雨生紅球藻蝦青素對小鼠免疫調(diào)節(jié)的研究

劉穎芬，辛乃宏，李炳乾，張云澤，鐘貞，蔡祥焜，喬秋爽，鄭立新，*

（1.中鹽工程技術(shù)研究院有限公司，天津300450；2.中國檢驗檢疫科學研究院綜合檢測中心，北京100121）

雨生紅球藻蝦青素對小鼠免疫調(diào)節(jié)的研究

劉穎芬1，辛乃宏1，李炳乾1，張云澤1，鐘貞2，蔡祥焜2，喬秋爽2，鄭立新2，*

（1.中鹽工程技術(shù)研究院有限公司，天津300450；2.中國檢驗檢疫科學研究院綜合檢測中心，北京100121）

評價雨生紅球藻蝦青素對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。選用雌性ICR小鼠，試驗分為4個免疫組，分別進行，每組設置低、中、高劑量及對照組。低、中、高劑量分別為0.083、0.167、0.5 g/kg·BW，對照組喂服植物油，試驗周期30 d。結(jié)果：在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能3個方面有增強免疫力功能。結(jié)果表明：雨生紅球藻蝦青素有增強小鼠免疫力功能。

雨生紅球藻；蝦青素；免疫調(diào)節(jié)

Abstract：To study the effect of astaxanthin on immune regulation in mice.Female ICR mice were selected and divided into 4 groups.Each group was divided into different dose gavage（Low dose=0.083 g/kg·BW，medium dose=0.167 g/kg·BW，high doses=0.5 g/kg·BW，controlgroupwasfedwithvegetableoil），andthetestperiodwas 30d.Conclusionshowedthat：astaxanthinfromHaematococcuspluvialiscouldenhanceimmunefunctionofmice.

Key words：Haematococcus pluvialis；astaxanthin；immune regulation

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis），屬團藻目，紅球藻科。當前，雨生紅球藻被公認為自然界中生產(chǎn)天然蝦青素的最好生物[1]。蝦青素（Astaxanthin）是一種酮基類胡蘿卜素，天然蝦青素比角黃素、β-胡蘿卜素和玉米黃素能更有效地阻止不飽和脂肪酸甲酯的過度氧化[2]，被譽為“超級維生素 E”、“超級抗氧化劑”[3]。有研究表明：蝦青素具有抗氧化[4]、增強免疫[5-7]、保護視力和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[8-9]、預防心血管疾病[10]、抑制腫瘤[11-13]、拮抗小鼠DNA損傷[14]等功能。隨著蝦青素消費市場的不斷擴展，已有機構(gòu)圍繞其預防與治療疾病潛在機理開展探索性研究[15-16]。本試驗旨在依據(jù)我國《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003版）》的免疫學相關(guān)指標規(guī)定，通過雨生紅球藻蝦青素對雌性ICR小鼠細胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細胞以及NK細胞活性指標的影響，探究其增強小鼠免疫力的作用，為今后雨生紅球藻蝦青素的免疫活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

雨生紅球藻蝦青素（蝦青素含量為1%）：中鹽工程技術(shù)研究院有限公司。

1.1.2 實驗動物

SPF級雌性ICR小鼠，240只，體重18 g～22 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.1.3 試驗試劑

YAC-1細胞：中國科學研究院；文齊氏試劑：天津市現(xiàn)代高科技研究院中山研究所；刀豆蛋白A（ConA）：美國sigma公司。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋（HH-2型）：常州中捷實驗儀器制造有限公司；酶標儀（Multiskan MK3型）：雷勃公司ThermoLabsystems。

1.3 方法

1.3.1 劑量選擇和實驗動物分組

本實驗分為低、中、高劑量3個劑量，分別為0.083、0.167、0.5 g/kg·BW，陰性對照組灌胃植物油，灌胃量均為10 mL/kg·BW。喂服采用灌胃方法，連續(xù)喂服30 d。240只SPF級ICR小鼠，分別進行4組免疫實驗：免疫一組60只（每只體重18 g～22 g），隨機分為低、中、高劑量及對照組，每組15只，進行遲發(fā)型變態(tài)反應試驗、半數(shù)溶血值測定和抗體生成細胞檢測；免疫二組60只（每只體重18 g～22 g），隨機分為低、中、高劑量及對照組，每組15只，進行碳廓清試驗；免疫三組 60 只（每只體重 18 g～22 g），隨機分為低、中、高劑量及對照組，每組15只，進行巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力試驗；免疫四組60只（每只體重18 g～22 g）隨機分為低、中、高劑量及對照組，每組15只，進行ConA誘導小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗和NK活性測定試驗。

1.3.2 細胞免疫功能測定

1.3.2.1 遲發(fā)型變態(tài)反應（足跖增厚法，DTH）

取新鮮的脫纖維羊血，生理鹽水洗滌3次，每只鼠腹腔注射2%壓積SRBC 0.2 mL，致敏后4 d，測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值。然后在測量部位皮下注射20%SRBC 20 μL，24 h后測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值，以攻擊前后足跖厚度的差值（足跖腫脹度）來表示DTH的程度。

1.3.2.2 ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗（MTT法）

無菌取脾，制成單細胞懸液，用Hank’s液沖洗，3次后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度致5×106個/mL。將細胞懸液分兩孔加入24孔板中，每孔1 mL，其中一孔中加入75 μL ConA液，將孔板置于5%CO2，37℃培養(yǎng)68 h后，每孔輕輕吸取上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，同時加入 MTT（5 mg/mL）50 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，移入96孔板中，在酶標儀上進行測定，波長為570 nm。淋巴細胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值表示。

1.3.3 體液免疫功能測定

1.3.3.1 抗體生成細胞檢測實驗（Jerme改良玻片法）

取新鮮羊血，每只鼠腹腔注射2%（用生理鹽水配制）壓積SRBC 0.2 mL，致敏后4 d處死小鼠，取全脾，制成細胞懸液，定容在8 mL Hank’s。將瓊脂糖加熱溶解后，與等量雙倍Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5 mL，再向管內(nèi)加10%（用SA緩沖液配制）壓積SRBC 50 μL，脾細胞懸液 20 μL，迅速混勻，傾倒至已刷瓊脂糖薄層的玻片上；待瓊脂凝固后，將玻片放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h，然后用SA緩沖液稀釋的補體（1∶8）放入玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)孵育1.5 h，計數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.3.3.2 血清溶血素半數(shù)溶血值（HC50）的測定

取新鮮羊血，每只鼠腹腔注射2%（用生理鹽水配制）壓積SRBC 0.2 mL，致敏后4 d，摘除眼球取血于1.5 mL離心管內(nèi)，放置約1 h后離心，取血清。用SA緩沖液稀釋300倍，取0.1 mL置96孔板內(nèi)，依次加入10%SRBC 0.05 mL，補體0.1 mL（按1∶8用SA緩沖液稀釋），置于37℃恒溫水浴保溫30 min后，冰浴。離心取上清液0.05 mL，加文齊氏試劑0.15 mL，同時取10%，用SA緩沖液配制）壓積SRBC 0.012 5 mL，加文齊氏試劑至0.2 mL于至另一96孔板，充分混勻。靜置10 min，在540 nm波長下，用酶標儀分別測定各孔光密度值。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按以下公式計算：

樣品HC50=（樣品光密度值/SRBC半數(shù)溶血時的光密度值）×稀釋倍數(shù)

1.3.4 單核-巨噬細胞功能測定

1.3.4.1 小鼠碳廓清試驗

小鼠尾靜脈注射1∶3用生理鹽水稀釋的印度墨汁，注入后立即計時。分別2 min和10 min后，從眼內(nèi)靜脈取血20 μL，加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，用酶標儀在600 nm波長處測定OD值，以Na2CO3溶液作空白對照。小鼠稱重，取肝臟、脾臟稱重。根據(jù)動物體重、肝重和脾重計算吞噬指數(shù)，按以下公式計算：

式中：OD1為2 min時測定的吸光度值；OD2為10 min時測定的吸光度值；t1為2 min；t2為10 min。

1.3.4.2 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（半體內(nèi)法）

小鼠腹腔注射5%壓積雞紅細胞懸液1 mL。2.5 h后，頸椎脫臼處死動物，腹腔注射生理鹽水2 mL。取腹腔洗液1 mL，平均分滴于2片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，37℃孵箱孵育30 min。孵畢，生理鹽水漂洗，晾干。以1∶1丙酮甲醇溶液固定（1∶1配制，體積比），4%Giemsa-磷酸鹽沖液染色3 min，蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計數(shù)，每張片計數(shù)100個，按以下公式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

吞噬率/%=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)×100

吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細胞總數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)

1.3.5 NK細胞活性測定（乳酸脫氫酶LDH測定法）

實驗前24 h將靶細胞YAC-1進行傳代培養(yǎng)，Hank’s洗3次，用含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度致4×105個/mL。小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，制成脾細胞懸液，Hank’s液沖洗3次，離心，再用2 mL含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，計數(shù)調(diào)整細胞濃度致2×107個/mL。取靶細胞和效應細胞各100 μL，加入U型96孔培養(yǎng)板中，靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%NP40各100 μL，上述均設3個平行孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)4 h，96孔培養(yǎng)板離心，每孔吸取上清100 μL置平底96孔培養(yǎng)板，加入LDH基質(zhì)液100 μL，避光反應10 min，然后每孔加入1 mol/L的HCL溶液30 μL終止反應，在酶標儀492 nm處測OD值。NK活性按下式計算：

NK活性/%=（反應孔OD-自然釋放孔OD）/（最大釋放孔OD-自然釋放孔OD）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 雨生紅球藻蝦青素對小鼠細胞免疫功能的影響

雨生紅球藻蝦青素對小鼠細胞免疫功能的影響見表1、表2。

表1 雨生紅球藻蝦青素對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）的影響（±SD）Table 1 The effect of astaxanthinon delayed type hypersensitivity in mice（±SD）

表1 雨生紅球藻蝦青素對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）的影響（±SD）Table 1 The effect of astaxanthinon delayed type hypersensitivity in mice（±SD）

劑量組/（g/kg·BW）動物數(shù)足趾腫脹/mmP值對照 15 0.66±0.28 0.083 15 0.70±0.38 0.979 0.167 15 0.72±0.39 0.952 0.500 15 0.87±0.33 0.277

表2 雨生紅球藻蝦青素對ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗的影響（±SD）Table 2 The effect of astaxanthinon lymphocyte transforming which inducing by the ConA in mice（±SD）

表2 雨生紅球藻蝦青素對ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗的影響（±SD）Table 2 The effect of astaxanthinon lymphocyte transforming which inducing by the ConA in mice（±SD）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

劑量組/（g/kg·BW）動物數(shù)淋巴細胞增殖能力（OD差值） P值對照 15 0.078±0.068 0.083 15 0.160±0.087* 0.044 0.167 15 0.180±0.131* 0.037 0.500 15 0.210±0.138** 0.009

由表1可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的雨生紅球藻蝦青素30 d，經(jīng)統(tǒng)計學分析，足趾腫脹度在各劑量組與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。由表2可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的雨生紅球藻蝦青素30 d，經(jīng)統(tǒng)計學分析，其淋巴細胞增殖能力在低、中、高劑量組與對照組比較有顯著性差異（低、中劑量P＜0.05，高劑量P＜0.01），判定細胞免疫功能陽性。

2.2 雨生紅球藻蝦青素對體液免疫的影響

雨生紅球藻蝦青素對體液免疫的影響見表3、表4。

表3 雨生紅球藻蝦青素對抗體生成細胞數(shù)的影響（±SD）Table 3 The effect of astaxanthinon on antibody forming cells（±SD）

表3 雨生紅球藻蝦青素對抗體生成細胞數(shù)的影響（±SD）Table 3 The effect of astaxanthinon on antibody forming cells（±SD）

劑量組/（g/kg·BW）動物數(shù)溶血空斑數(shù)（×103全脾） P值對照 15 101.33±30.34 0.083 15 119.93±26.68 0.244 0.167 15 127.80±35.54 0.058 0.500 15 128.27±30.24 0.053

表4 雨生紅球藻蝦青素對小鼠半數(shù)溶血值（HC50）的影響（±SD）Table 4 The effect of astaxanthinon HC50in mice（±SD）

表4 雨生紅球藻蝦青素對小鼠半數(shù)溶血值（HC50）的影響（±SD）Table 4 The effect of astaxanthinon HC50in mice（±SD）

注：與對照組比較，**P＜0.01。

劑量組/（g/kg·BW）動物數(shù)HC50P值對照 15 139.29±81.69 0.083 15 213.69±67.18** 0.007 0.167 15 252.02±30.79** 0.000 0.500 15 220.49±76.90** 0.002

由表3可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的雨生紅球藻蝦青素30 d，經(jīng)統(tǒng)計學分析，其抗體生成細胞數(shù)在各劑量組與對照組間比較無顯著性差異（P＞0.05）。由表4可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的雨生紅球藻蝦青素30 d，經(jīng)統(tǒng)計學分析，其半數(shù)溶血值（HC50）在低、中、高劑量組與對照組間比較有顯著性差異（P＜0.01），判定體液免疫功能陽性。

2.3 雨生紅球藻蝦青素對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響

雨生紅球藻蝦青素對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響見表5、表6。

由表5可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的雨生紅球藻蝦青素30 d，經(jīng)統(tǒng)計學分析，其碳廓清功能在各劑量與對照組間比較無顯著性差異（P＞0.05）。由表6可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的雨生紅球藻蝦青素30 d，經(jīng)統(tǒng)計學分析，其吞噬率在高劑量組與對照組間比較有顯著性差異（P＜0.01），吞噬指數(shù)在中、高劑量組與對照組間比較有顯著性差異（P＜0.01），判定單核-巨噬細胞吞噬功能陽性。

表5 雨生紅球藻蝦青素對小鼠單核-巨噬細胞碳廓清能力的影響（±SD）Table 5 The effect of astaxanthin on carbon clearance ability of mice mononuclear macrophage（±SD）

表5 雨生紅球藻蝦青素對小鼠單核-巨噬細胞碳廓清能力的影響（±SD）Table 5 The effect of astaxanthin on carbon clearance ability of mice mononuclear macrophage（±SD）

劑量組/（g/kg·BW）動物數(shù)吞噬指數(shù)aP值對照 15 6.33±0.98 0.083 15 7.25±1.43 0.063 0.167 15 7.06±0.81 0.177 0.500 15 6.86±1.06 0.418

表6 雨生紅球藻蝦青素對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響（±SD）Table 6 The effect of astaxanthin on phagocytosis of chicken red blood cells and macrophages in mice（±SD）

表6 雨生紅球藻蝦青素對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響（±SD）Table 6 The effect of astaxanthin on phagocytosis of chicken red blood cells and macrophages in mice（±SD）

注：與對照組比較，**P＜0.01。

劑量組/（g/kg·BW）動物數(shù) 吞噬率/% P1值 吞噬指數(shù)a P2值對照 15 9.47±3.54 0.13±0.06 0.083 15 9.13±2.47 0.883 0.08±0.05 0.219 0.167 15 13.20±7.09 0.157 0.27±0.14** 0.002 0.500 15 21.73±6.12** 0.000 0.37±0.17** 0.000

2.4 雨生紅球藻蝦青素對小鼠NK細胞活性的影響

雨生紅球藻蝦青素對小鼠NK細胞活性的影響見表7。

表7 雨生紅球藻蝦青素對小鼠NK細胞活性的影響（±SD）Table 7 The effect of astaxanthin on NK cell activity in mice（±SD）

表7 雨生紅球藻蝦青素對小鼠NK細胞活性的影響（±SD）Table 7 The effect of astaxanthin on NK cell activity in mice（±SD）

注：與對照組比較，**P＜0.01。

劑量組/（g/kg·BW）動物數(shù)NK細胞活性/%P值對照 15 56.70±9.93 0.083 15 52.96±5.99 0.604 0.167 15 67.43±16.58 0.078 0.500 15 71.83±9.24** 0.001

由表7可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的雨生紅球藻蝦青素30 d，經(jīng)統(tǒng)計學分析，NK細胞活性在高劑量組與對照組間比較有顯著性差異（P＜0.01）。

3 討論

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是衛(wèi)生部2010年第17號公布的新食品原料，其富含的天然蝦青素具有抗氧化和增強免疫力的作用。國外已利用該功能將蝦青素作為藥物預防氧化性組織損傷和配制保健食品[17]。近年來蝦青素的免疫功能正引起學者的廣泛關(guān)注，國內(nèi)對蝦青素的需求量也越來越大，其被廣泛開發(fā)應用于食品、醫(yī)藥、化妝品及飼料等的生產(chǎn)[18]。

依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[19]（2003年版），在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能、NK細胞活性4項中任2項呈陽性，則可判定受試樣品具有增強免疫力功能作用；認為雨生紅球藻蝦青素有增強免疫力功能。實驗結(jié)果顯示：淋巴細胞增殖能力在3個劑量組與對照組比較均有顯著性差異（低、中劑量 P＜0.05，高劑量 P＜0.01），判定細胞免疫功能陽性；半數(shù)溶血值（HC50）在3個劑量組與對照組間比較均有顯著性差異（P＜0.01），判定體液免疫功能陽性；小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力其吞噬率在高劑量組與對照組間比較有顯著性差異（P＜0.01），吞噬指數(shù)在中、高劑量組與對照組間比較有顯著性差異（P＜0.01），判定單核-巨噬細胞吞噬功能陽性；NK細胞活性在高劑量組與對照組間比較有顯著性差異（P＜0.01）。因此可認定雨生紅球藻蝦青素對小鼠的免疫功能有顯著的提高作用。

目前對于雨生紅球藻蝦青素的研究大多集中在其增強免疫力和抗氧化的作用上，通過本研究進一步證明了雨生紅球藻蝦青素增強免疫力的功效，且研究效果與前人得出一致的結(jié)論，為下一步進行增強免疫力的機理研究提供了參考。

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Study of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis on Immune Regulation Function in Mice

LIU Ying-fen1，XIN Nai-hong1，LI Bing-qian1，ZHANG Yun-ze1，ZHONG Zhen2，CAI Xiang-kun2，QIAO Qiu-shuang2，ZHENG Li-xin2，*
（1.Salt Research Institute，CNSIC，Tianjin 300450，China；2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100121，China）

2017-03-03

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.038

劉穎芬（1983—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：海洋生物及食品營養(yǎng)。

*通信作者：鄭立新（1980—），女，工程師，碩士，研究方向：保健食品功能。