大孔樹脂AB-8分離純化倫晚臍橙總黃酮

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(1.西南大學園藝園林學院,重慶 400716;2.南方山地園藝學教育部重點實驗室,重慶 400715)

大孔樹脂AB-8分離純化倫晚臍橙總黃酮

聶超1,趙梓燕1,徐曉丹1,周志欽1,2,*

(1.西南大學園藝園林學院,重慶400716;2.南方山地園藝學教育部重點實驗室,重慶400715)

考察了不同大孔樹脂對倫晚臍橙殘次果總黃酮的吸附與解吸性能,篩選出適宜純化的大孔樹脂AB-8。以蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素6種標準品繪制標準曲線,采用高效液相色譜法(HPLC)進行定性、定量分析。通過靜態(tài)與動態(tài)吸附、解吸,得出大孔樹脂AB-8純化倫晚臍橙殘次果總黃酮的最佳工藝條件為:0.75 mg/mL的pH=3上樣液,上樣體積為3.5倍柱體積(BV),上樣流速為2 BV/h;80%乙醇為洗脫劑,2 BV/h流速洗脫,洗脫體積為5 BV,解吸率達90.73%。經大孔樹脂純化后,提取物中總黃酮含量由純化前36.04 mg/g增加到純化后334.54 mg/g。HPLC分析結果表明,AB-8分離純化倫晚臍橙總黃酮不會造成單體黃酮組成變化,其中主要黃酮類物質是蕓香柚皮苷、橙皮苷,占總量的91.14%。該工藝能有效地富集倫晚臍橙黃酮類,去除糖、色素等物質,且對倫晚臍橙黃酮組分沒有影響。

倫晚臍橙,總黃酮,高效液相色譜法,大孔樹脂,分離純化

Abstract:The adsorption and desorption of total flavonoids from lane late navel orange fruits were investigated by using 3 macroporous resins. Results indicated that AB-8 resin was appropriate to purify the total flavonoids. Then the polyphenols from orange fruits were qualitatively and quantitatively by HPLC(high performance liquid chromatography). To optimize the separation process,the static and dynamic of adsorption and desorption experiments were carried out,the optimal adsorption conditions were as follows:initial concentrations in sample solution 0.75 mg/mL,pH3.0,sample loading amount 3.5 BV,flow rate 2 BV/h. The optimal desorption parameters were 80% ethanol 5 BV,flow rate of 2 BV/h,the desorption ratio was 90.73%.After purification,the content of flavonoids in product was increased from 36.04 mg/g to 334.54 mg/g. HPLC analysis results found that the flavonoids profiles of lane late navel orange were not changed after adsorption and desorption by AB-8 macroporous resin. The main flavonoids were narirutin and hesperidin,the percentage content to the total flavonoids was 91.14%.The results showed that AB-8 resin revealed a good ability to enrichment total flavonoids from lane late navel orange,and the method can be referenced for the enrichment of total flavonoids from other material.

Keywords:lane late navel orange;total flavonoids;high performance liquid chromatography;macroporous resin;separation and purification

臍橙屬于蕓香科柑橘屬甜橙類,素有“柑桔之王”的美譽。近年來,為了優(yōu)化柑橘品種結構[1],晚熟柑橘得到了大力發(fā)展。倫晚臍橙(Citrus sinensis Osbeck cv.Lane late)是我國主要推廣發(fā)展的晚熟品種之一,其經濟效益明顯。但在實際生產過程中,倫晚臍橙落果現象嚴重,以及存在殘次果較多等問題,造成了資源浪費,其合理開發(fā)利用對提高農產品利用率具有重大意義[2]。黃酮是一類大量存在于植物中的,具有抗炎、抗氧化、抗菌等活性的次生代謝物質[3-4]。倫晚臍橙殘次果中含有豐富黃酮類物質,其中多甲氧基黃酮(polymethoxyflavones,PMFs)是柑橘屬水果特有的一類高度甲氧化的黃酮類化合物[5],PMFs易于吸收代謝,且生物活性高于一般黃酮類化合物[6]。

目前,黃酮類物質的純化方法主要有大孔樹脂、硅膠柱、聚酰胺、葡糖凝膠和高速逆流色譜等,由于大孔樹脂具有成本低、效率高、易操作等優(yōu)點,被廣泛應用于食品和天然藥物行業(yè)[7],尤其是純化植物化學物質[8]。汪洋等[9]發(fā)現大孔樹脂D101適合于柑橘皮渣總黃酮的純化,程灝旻等[10]利用AB-8純化血橙果皮總黃酮,使得黃酮類化合物的純度從6.00%提高到23.32%。但是,前人的研究大都是針對柑橘皮渣進行純化,對于落果和殘次果總黃酮分離純化還鮮有報道。

本研究采用HPLC對黃酮含量進行精確定量,利用不同大孔樹脂對倫晚臍橙殘次果總黃酮提取物進行吸附、解吸,篩選出適宜純化的樹脂類型,并對其動態(tài)吸附條件進行優(yōu)化,確定最優(yōu)工藝參數。以期為大孔樹脂分離純化倫晚臍橙殘次果總黃酮的應用提供理論依據,對解決資源浪費,提高臍橙殘次果的綜合利用具有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

倫晚臍橙殘次果 落果以及有損傷的成熟果,2016年收集于重慶市云陽縣,洗凈、切至5～10 mm厚度,烘箱內60 ℃烘干;大孔樹脂AB-8、NKA-9 天津市光復精細化工研究所;大孔樹脂D101 成都市科龍化工試劑廠;標準品蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素 純度為98%以上,美國Sigma公司;甲醇 色譜純,美國Sigma公司;甲酸 色譜純,美國Fisher公司;無水乙醇 分析純,成都市科龍試劑廠。

Milli-Q Advantange A10超純水系統(tǒng) 美國密理博(Millipore)公司;DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司;KQ5200DE數控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Waters e2695高效液相色譜儀、Waters 2998光電二極管陣列檢測器 美國Waters公司;Sartorius BSA224S電子天平 感量0.1 mg,Max 220 g,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;EYELA N1100旋轉蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會社;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;HH-S電子恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;SHA-C水浴恒溫振蕩器 金壇市宏業(yè)實驗儀器廠;SevenCompact-S210 pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司;LGJ-12真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 倫晚臍橙殘次果總黃酮粗提液的制備 根據本實驗室前期對提取條件的優(yōu)化,得到倫晚臍橙殘次果總黃酮粗提液的制備方法。倫晚臍橙殘次果切片后,烘干,粉碎機磨粉,過60目篩。用體積分數為95%乙醇,在溫度90 ℃,料液比為1∶5 (g/mL)條件下熱回流提取2 h,重復兩次。將提取液過濾,旋轉蒸發(fā)回收乙醇(蒸至無醇味),用少量蒸餾水溶解,得到倫晚臍橙殘次果總黃酮粗提液,作為原液在4 ℃冷藏備用。

1.2.2 黃酮含量測定 黃酮含量采用HPLC測定,稱取6種黃酮類標準品各10.00 mg,用甲醇定容至10.00 mL,配制成1.00 mg/mL的母液,保存于-20 ℃待用。色譜條件參考張元梅[11]等,色譜柱:Sunfire-C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);檢測波長:280 nm(黃烷酮)、330 nm(多甲氧基黃酮);流速:0.7 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣體積為10 μL;流動相:A 0.1%甲酸高純水,B甲醇。梯度洗脫:0～20 min,37%～50% B;20～35 min,50%～80% B;35～40 min,80%～100% B;40～50 min,100% B;50～60 min,37% B;流速:0.7 mL/min。

根據樣品出峰時間與標準品保留時間進行對照,判斷黃酮種類,進行定性分析。以標準品的質量濃度與相應峰面積為橫縱坐標,繪制標準曲線,進行定量分析。

1.2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸附

1.2.3.1 大孔樹脂預處理 分別取大孔樹脂AB-8、D101、NKA-9,首先用95%乙醇浸泡大孔樹脂24 h,蒸餾水洗至無醇味。接著用質量分數為5%的NaOH浸泡3 h,蒸餾水不斷沖洗至中性。質量分數為5%的HCl浸泡3 h,蒸餾水洗至中性。最后用體積分數為95%乙醇浸泡4 h,蒸餾水洗至無醇味,備用。

1.2.3.2 靜態(tài)吸附 稱取2.0 g樹脂于100 mL錐形瓶中,加入20 mL濃度為0.75 mg/mL的總黃酮粗提液,密封后置于恒溫振蕩器中吸附24 h(25 ℃、150 r/min)平衡后,過濾,測定吸附后溶液中的黃酮含量,按式(1)、式(2)計算吸附量、吸附率。

式(1)

式(2)

式中:qe為吸附量,mg/g;E為吸附率,%;C0為起始液黃酮含量,mg/mL;C1為吸附后溶液中的黃酮含量,mg/mL;V1為上樣液體積,mL;M為樹脂質量(烘干),g。

1.2.3.3 靜態(tài)解吸 將上述過濾溶液后的樹脂用蒸餾水清洗兩次,用濾紙吸干表面水分。加入30 mL體積分數為80%乙醇溶液,密封于振蕩器中解吸24 h(25 ℃、150 r/min),過濾,測定濾液中黃酮含量,按式(3)、式(4)計算解析量、解吸率。

式(3)

式(4)

式中:qd為解吸量,mg/g;D為解吸率,%;C0為起始液黃酮含量,mg/mL;C1為吸附后溶液中的黃酮含量,mg/mL;C2為洗脫液黃酮含量,mg/mL;V1為上樣液體積,mL;V2為洗脫液體積,mL;M為樹脂質量(烘干),g。

1.2.3.4 樹脂的篩選 稱取預處理后的三種大孔樹脂各2.0 g,按照1.2.3.2的方法進行靜態(tài)吸附,測定吸附前后總黃酮含量,根據式(1)、式(2)計算吸附量和吸附率。按照1.2.3.3的方法進行靜態(tài)解吸,測定洗脫液中總黃酮含量,按式(3)、式(4)計算解吸量和解吸率。

1.2.3.5 靜態(tài)吸附與解吸動力學 綜合考慮樹脂的吸附量和解吸率,篩選出最適合的樹脂類型,測定其靜態(tài)吸附動力學曲線。按照1.2.3.2所述方法,分別測定0.5、1、2、5、8、10、24 h吸附后溶液中的黃酮含量,繪制該大孔樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線。按照1.2.3.3所述方法,分別在0.5、1、2、5、8、10、24 h時測定洗脫液中黃酮含量,繪制該大孔樹脂的靜態(tài)解吸動力學曲線。

1.2.3.6 pH對吸附效果的影響 準確稱取2.0 g樹脂于100 mL錐形瓶中,分別加入20 mL pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的總黃酮粗提液,振蕩器中吸附24 h(25 ℃、150 r/min)平衡后,測定平衡液中黃酮含量,計算不同pH下樹脂的吸附率。

1.2.3.7 洗脫液濃度對樹脂解吸效果的影響 吸附后的樹脂用蒸餾水清洗兩次,用濾紙吸干表面水分。加入30 mL體積分數為10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液,于振蕩器中解吸24 h(25 ℃、150 r/min),平衡后,測定洗脫液中黃酮含量,計算解吸率,確定適合解吸的乙醇體積分數。

1.2.4 大孔樹脂的動態(tài)吸附與解吸 將預處理好的20.0 g樹脂采用濕法上柱,裝入(30 mm×300 mm)玻璃層析柱中。取質量濃度為0.45、0.75、1.05、1.52 mg/mL上樣液,以1、2、3、4 BV/h流速上樣,收集流出液,15 mL為一管,測定流出液中黃酮的質量濃度,以流出液的體積和黃酮濃度作圖,繪制動態(tài)吸附曲線,確定上樣流速與上樣濃度。

吸附飽和后的樹脂用蒸餾水清洗3次去除樹脂表面雜質,水洗至無色,并用苯酚-濃硫酸法[12]檢測至無糖。用體積分數為80%的乙醇溶液分別以2 BV/h洗脫,15 mL為一管收集洗脫液,測定洗脫液中黃酮含量。以體積為橫坐標,流出液黃酮濃度為縱坐標,繪制動態(tài)解吸曲線。

1.2.5 純化前后倫晚臍橙殘次果總黃酮提取物的組成與含量分析 按照上述方法分離純化倫晚臍橙殘次果總黃酮提取物,將洗脫液減壓濃縮,采用真空冷凍干燥凍干,得到倫晚臍橙黃酮純化物。在280 nm(黃烷酮)、330 nm(多甲氧基黃酮)下,采用HPLC測定純化前后黃酮組成與含量。

1.2.6 統(tǒng)計分析 采用Excel和SPSS 19軟件對數據進行統(tǒng)計分析,采用Origin 8作圖,實驗重復3次,結果以均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 黃酮標準品HPLC分析與標準曲線繪制

如圖1所示,6種類黃酮標準品物質在60 min內完全分離,可以滿足對類黃酮物質的定性。6種主要類黃酮標準品回歸方程、相關系數等結果如表1所示,蕓香柚皮苷等類黃酮標準品質量濃度與相應峰面積呈良好線性關系,符合定量要求。

圖1 類黃酮標準品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of flavonoids standards注:1-蕓香柚皮苷;2-橙皮苷;3-香蜂草苷;4-甜橙黃酮;5-川陳皮素;6-橘皮素。

表1 黃酮物質標準品回歸方程、相關系數、線性范圍Table 1 Regression equations,correlation coefficients,linearity range of flavonoids compositions

2.2 樹脂篩選結果

樹脂的吸附能力遵循“相似相溶”原理,由于類黃酮物質既具有非極性的苯環(huán)結構,也有極性的多羥基結構,結合他人研究[13-15],選擇AB-8、NKA-9、D101三種樹脂用于類黃酮物質分離純化。

本研究結果如圖2所示,AB-8、NKA-9和D101三種樹脂對黃酮物質的吸附性能差異極顯著(p<0.01),吸附量分別為23.81、16.88、21.02 mg/g。結果表明,AB-8對黃酮的選擇吸附能力最強,其次是D101。從解吸性能來看,AB-8解吸率達到89.75%,極顯著高于其他樹脂(p<0.01)。因此,AB-8最適用于類黃酮分離純化。

圖2 不同類型樹脂對倫晚臍橙全果總黃酮的吸附與解吸性能Fig.2 The static adsorption and desorption tests of 3 macroporous resins

2.3 靜態(tài)吸附、解吸曲線

靜態(tài)吸附曲線反映了溶質吸附速率隨吸附時間的變化,是衡量吸附性能的重要參數[16]。本研究結果如圖3所示,在0～3 h內,AB-8大孔樹脂對倫晚臍橙殘次果總黃酮的吸附量迅速增大,在3 h時吸附達到平衡狀態(tài)。AB-8大孔樹脂對倫晚臍橙殘次果總黃酮的吸附時間短,吸附效果好,符合實驗要求。

由解吸曲線(圖3)可知,樹脂吸附的倫晚臍橙殘次果總黃酮在80%乙醇洗脫下,在0～2 h時解吸量迅速增加,3 h后,隨著解吸時間增加解吸量變化不太明顯,達到解吸平衡狀態(tài)。AB-8大孔樹脂解吸時間短,可以滿足實際操作。

圖3 AB-8樹脂靜態(tài)吸附與解吸動力學曲線Fig.3 Static adsorption and desorption kinetic scurve of AB-8 macroporous resins

2.4 上樣液pH對吸附性能的影響

上樣液的pH影響溶質的電離程度,是影響大孔樹脂吸附量的關鍵參數[17]。如圖4所示,pH為3時,AB-8大孔樹脂對倫晚臍橙殘次果總黃酮物質的吸附率最高。隨著pH繼續(xù)增高,吸附率開始下降。

圖4 上樣液pH對黃酮吸附率的影響Fig.4 Effect of sample solution pH value on the adsorption ratio of the total flavonoids

這表明上樣液的pH可能通過影響溶質的電離程度從而影響大孔樹脂的吸附率。當pH較高時,黃酮酚羥基分離H+,氫鍵相互作用減少,從而導致較低的吸附能力。因此,將樣品溶液的pH調整到3.0最利于AB-8對倫晚臍橙殘次果總黃酮的吸附。

2.5 洗脫液體積濃度對解吸性能的影響

由于黃酮類物質具有抗氧化、抗炎、抗癌等藥理保健性質,從安全角度出發(fā),本實驗選擇乙醇作為洗脫劑。如圖5所示,將不同體積分數的乙醇加入已吸附飽和的AB-8大孔樹脂中,考察乙醇濃度對樹脂解吸率的影響。

圖5 乙醇濃度對黃酮解吸率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the desorption properties of the total flavonoids

在乙醇濃度為10%～50%時,隨著乙醇濃度的增加,解吸率迅速增大。進一步提高乙醇的濃度,解吸率增加變緩,80%的乙醇濃度解吸率最大,這與乙醇溶液的極性有關。綜合考慮成本等因素,本實驗選擇80%乙醇作為洗脫劑的濃度。

2.6 動態(tài)吸附與解吸條件優(yōu)化

2.6.1 上樣濃度對樹脂吸附效果的影響 大孔樹脂AB-8對不同濃度倫晚臍橙殘次果總黃酮的動態(tài)吸附性能如圖6所示。通常,將流出液總黃酮濃度達到上樣液起始濃度10%作為泄漏點[18]。上樣液黃酮濃度為1.52 mg/mL時,在1.5 BV左右開始泄露,泄漏點出現太早,容易堵塞樹脂,不利用大孔樹脂吸附;黃酮濃度為1.05 mg/mL時,在上樣體積為2.5 BV時發(fā)生泄露;當樣品濃度為0.45、0.75 mg/mL時,泄漏點同時出現在3.5 BV附近。上樣液黃酮濃度為0.45、0.75、1.05 mg/mL,發(fā)生泄露時,大孔樹脂吸附量分別為45.92、75.83、73.88 mg黃酮。在0.75、1.05 mg/mL濃度下,樹脂吸附能力相差不明顯(p>0.05),但1.05 mg/mL上樣粘度較大,有一定沉淀物,容易沖散樹脂。因此,將上樣液的濃度確定為0.75 mg/mL最利于樹脂的吸附。

圖6 上樣濃度對AB-8樹脂吸附效果的影響Fig.6 Effect of samples concentration on the adsorption properties of AB-8

2.6.2 上樣流速對樹脂吸附效果的影響 上樣流速主要通過影響黃酮類化合物與樹脂表面活性區(qū)域的相互作用時間,從而影響吸附性能[19]。流速太快,不利于樹脂與樣品充分接觸,降低樹脂吸附量;流速太慢,雖有利于吸附,但不利于生產實際。AB-8大孔樹脂對不同上樣流速的動態(tài)吸附性能如圖7所示。

圖7 上樣流速對AB-8樹脂吸附效果的影響Fig.7 Effect of flow ingrate on the adsorption properties of AB-8

上樣流速為4.0 BV/h時,在2 BV左右就開始泄露,泄漏點出現太早,不利于大孔樹脂吸附。上樣流速為1、2、3 BV/h時,泄漏點分別出現在4.0、3.5、2.5 BV附近,此時AB-8的吸附量分別為87.29、75.78、53.88 mg黃酮。上樣流速為1.0 BV/h,盡管泄漏點出現較晚且吸附量最高,但上樣時間太長,效率低下。上樣速度為3.0 BV/h時,泄漏點出現相對較早,同時樹脂吸附量較低。綜合考慮,選擇2 BV/h為最佳上樣流速。

2.6.3 動態(tài)解吸曲線 從圖8可以看出,隨乙醇溶液體積的增加洗脫液中黃酮含量呈先升高再降低趨勢。當洗脫到2 BV時,洗脫液中黃酮含量達到最大值,之后增加洗脫液體積,黃酮質量濃度下降。5 BV后洗脫液中黃酮含量很少,此時,解吸率達到90.73%,說明5 BV的80%乙醇就可將大部分吸附在樹脂上總黃酮洗脫下來。因此,采用5 BV的80%乙醇洗脫即可滿足實驗要求。

圖8 AB-8大孔樹脂對臍橙全果黃酮的動態(tài)解吸曲線Fig.8 Dynamic desorption curve of the AB-8 resin

2.7 純化前后倫晚臍橙殘次果總黃酮的組成及含量

以6種黃酮單體制成混標,采用HPLC法對純化前后提取物中的總黃酮進行分析。由圖9可知,經過AB-8大孔樹脂純化后黃酮的組成并未發(fā)生明顯改變。倫晚臍橙殘次果總黃酮提取物在純化前,3～10 min內有較多雜峰,純化后雜峰明顯降低,且主要黃酮物質均被很好地保留,說明AB-8大孔樹脂適用于倫晚臍橙殘次果總黃酮的分離純化。

圖9 AB-8樹脂純化前后臍橙全果提取物HPLC圖譜Fig.9 HPLC chromatograms of lane late navelsfruit extract before and after AB-8 resin purification注:A純化前;B純化后;1-蕓香柚皮苷;2-橙皮苷;3-香蜂草苷;4-甜橙黃酮;5-川陳皮素;6-橘皮素。

采用HPLC法對6種黃酮進行了定量分析,純化前后的黃酮含量見表2。含量最高的是蕓香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黃酮,占總黃酮含量的91.27%。經大孔樹脂AB-8純化后,倫晚臍橙殘次果提取物中總黃酮含量由純化前36.04 mg/g增加到純化后334.54 mg/g,純度達到33.45%。唐巧玉[20]等利用大孔樹脂純化金橘果皮總黃酮,純化后的總黃酮純度可達38.2%,與本實驗結果相近。石磊[9]等純化蘆柑果皮總黃酮后純度達到51.6%,高于本實驗的33.45%。這可能與材料本身有關,果實中的其他雜質影響了產物的純度。

表2 AB-8純化前后臍橙全果提取物中黃酮單體的種類與含量變化Table 2 Composition and content of flavonoids compounds of lane late navels before and after AB-8 resin purification

3 結論

通過對3種不同型號的大孔樹脂進行篩選,確定AB-8更適合于倫晚臍橙殘次果總黃酮的分離純化。AB-8分離純化倫晚臍橙殘次果總黃酮提取物的最佳條件:上樣液濃度0.75 mg/mL,pH=3的上樣液以2 BV/h流速上樣;采用80%乙醇作為洗脫劑,在2 BV/h流速下洗脫5 BV,解吸效果較好,解吸率達90.73%。經AB-8大孔樹脂純化后,黃酮組成沒有發(fā)生改變,總黃酮含量達到334.54 mg/g,純度從3.61%提高到33.45%,較純化前提高了8.28倍。

由此可以得出,AB-8適合倫晚臍橙殘次果總黃酮提取物的分離純化,該純化工藝簡單、易操作,經該工藝處理后,倫晚臍橙殘次果總黃酮純度大大提高,對于解決殘次果的資源浪費問題具有重大意義,其純化最優(yōu)條件對工業(yè)生產有一定參考價值。

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SeparationandpurificationoftotalflavonoidsfromlanelatenavelorangebyAB-8macroporousresins

NIEChao1,ZHAOZi-yan1,XUXiao-dan1,ZHOUZhi-qin1,2,*

(1.College of Horticulture and Landscape Architecture,Southwest University,Chongqing 400716,China;2.Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions,Ministry of Education,Chongqing 400715,China)

TS202.1

B

1002-0306(2017)18-0221-06

2017-02-28

聶超(1993-)，男，碩士研究生，研究方向:果品營養(yǎng)與質量安全，E-mail:niechao@email.swu.edu.cn。

*通訊作者:周志欽(1964-)，男，博士，教授，研究方向:果品營養(yǎng)與質量安全，E-mail:zzqswu@yahoo.com。

重慶市現代特色效益農業(yè)技術體系創(chuàng)新項目(20174-4)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.042