新疆南疆地區(qū)鏈格孢的分離鑒定及抗鏈格孢乳酸菌的篩選

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(塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆阿拉爾 843300)

新疆南疆地區(qū)鏈格孢的分離鑒定及抗鏈格孢乳酸菌的篩選

李明楊,謝婷婷,李建,張銳利*

(塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆阿拉爾843300)

鏈格孢是引起果實(shí)黑斑病的主要致病菌之一,嚴(yán)重危害果實(shí)的采后貯藏過(guò)程。從新疆南疆某果園患病果實(shí)分離鏈格孢,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定,同時(shí)從分離自新疆特色乳制品的110株乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)中篩選具有抑制鏈格孢活性的乳酸菌,并采用固態(tài)菌餅、靜態(tài)發(fā)酵及搖床發(fā)酵3種方式探索最佳的發(fā)酵方式。結(jié)果表明共分離獲得2株鏈格孢,經(jīng)鑒定分別為梨黑斑鏈格孢(Alternariagaisen)和細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima);篩選獲得4株對(duì)相應(yīng)鏈格孢具有抑制活性的乳酸菌,其中3株為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus),1株為副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei),同時(shí)發(fā)現(xiàn)搖床發(fā)酵方式所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物抑制鏈格孢活性相對(duì)最強(qiáng),抑菌圈直徑最大可達(dá)21.17 mm。這為將乳源乳酸菌用于水果采后防治鏈格孢引起的黑斑病提供了理論依據(jù)。

黑斑病,鏈格孢,乳酸菌,抑制,發(fā)酵方式

Abstract:Alternariais one of the main pathogenic bacteria of fruit black spot and severely impairs the postharvest storage process of fruit.Alternariawas isolated from the pear and apple of a orchard in south Xinjiang and identified by morphological characteristics and molecular biological methods. 110 strains of lactic acid bacteria(LAB)from Xinjiang dairy products were performed to detect the inhibitory activity onAlternariaand solid cake,stationary and shaker broth were used for fermentation. The results showed that 2 strains ofAlternarianamedAlternariagaisenandAlternariatenuissimawere obtained. 4 strains of LAB with inhibitory activity onAlternariawere screened out and 3 of them wereLactobacilluspentosus,the other one namedLactobacillusparacasei. At the same time,the highest inhibitory activity onAlternariawas from shaker fermentation broth and the diameter of the zone of inhibition was up to 21.17 mm. It provided a theoretical basis to apply LAB from dairy products to control the black spot disease caused byAlternariain the postharvest.

Keywords:black spot disease;Alternaria;lactic acid bacteria;inhibition;fermentation methods

黑斑病是梨、蘋果、紅棗、杏、柑橘等水果的一類重要病害,該病害主要由鏈格孢(Alternariaalternata)的侵染引起[1]。鏈格孢引起的黑斑病可導(dǎo)致葉斑和果實(shí)組織腐爛,對(duì)梨、蘋果、紅棗、芒果等果實(shí)貯藏危害較大[2],被侵染水果果實(shí)的表皮會(huì)形成黑色斑塊,凹陷,最終導(dǎo)致果實(shí)腐爛,對(duì)貯藏、運(yùn)輸和銷售造成影響,嚴(yán)重影響水果的食用價(jià)值和商品價(jià)值,引起巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。

目前主要采用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)該病原菌進(jìn)行防治,但是隨著人們生活水平的逐步提高,對(duì)農(nóng)藥殘留危害人類健康認(rèn)識(shí)的逐步深入,迫切需要非化學(xué)的、無(wú)公害的殺菌劑來(lái)防治果蔬的采后病害。同時(shí)由于病原菌耐藥性的增強(qiáng),使生物法防治果蔬采后病害得到越來(lái)越多的關(guān)注[4]。生物防治作為一種效果明顯、安全無(wú)毒且成本低廉的防治病害新途徑被人們接受和重視,并成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

表1 引物序列及其擴(kuò)增ITS區(qū)域的相應(yīng)位點(diǎn)[15]Table 1 Primer sequences and sites for ITS amplification region[15]

表2 PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系(50 μL)Table 2 PCR reaction amplification system(50 μL)

趙超等[5]從芒果葉片及果實(shí)上分離采后主要病原菌及其拮抗菌,發(fā)現(xiàn)菌株A1菌液對(duì)芒果炭疽病和蒂腐病的平均防效達(dá)到77.12%;耿海峰等[6]從土壤中分離獲得11株對(duì)冬棗細(xì)交鏈格孢病菌、多隔鐮孢霉和美澳核果褐腐串珠霉具有較好抑制作用的拮抗菌,抑菌效果最顯著的B26的抑制率高達(dá)78.8%。乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一類產(chǎn)乳酸細(xì)菌的統(tǒng)稱,是被國(guó)際公認(rèn)為安全且被歐盟食品安全局所推薦的益生菌[7]。乳酸菌能夠產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物并廣泛應(yīng)用于抑制病原性真菌相關(guān)研究[8]。但是對(duì)于將乳源乳酸菌應(yīng)用于抑制黑斑病病原菌鏈格孢的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

本研究從新疆南疆地區(qū)阿拉爾市某果園中的黑斑病香梨及蘋果中分離鏈格孢,同時(shí)將分離自新疆特色乳制品中的乳酸菌用于抗鏈格孢活性篩選,以期為果蔬采后保鮮提供新的技術(shù)途徑,并為無(wú)公害防治黑斑病奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)病香梨和蘋果 均來(lái)自新疆南疆阿拉爾市周邊某果園;細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)CGMCC3.3546 購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心;乳酸菌 本課題組前期從新疆傳統(tǒng)乳制品中分離獲得的110株乳酸菌(均已鑒定)[9];MRS肉湯培養(yǎng)基及PDA固體培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;PCR相關(guān)試劑 均購(gòu)自Takara公司;其他實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Chem Doc XRS+凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司;PCR儀 德國(guó)SensoQuest;Leica DM1000顯微鏡 德國(guó)徠卡微系統(tǒng)有限公司;ZW-CJ-2FD無(wú)菌工作臺(tái) 博訊實(shí)業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠;DNP-9082A電熱恒溫培養(yǎng)箱 揚(yáng)州鴻都電子有限公司;PC2002電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離 參照郭東起[10]及范瑛閣[11]等的方法對(duì)具有典型黑斑病癥狀的香梨和蘋果的鏈格孢進(jìn)行分離。果實(shí)表皮清洗干凈后置于75%的酒精中浸泡60 s,無(wú)菌水沖洗5次,取病健接壤處組織,切成5 mm3組織放在PDA平板上,28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d,以點(diǎn)植法接種分離至菌落單一。

1.2.2 病原菌的鑒定

1.2.2.1 病原菌細(xì)胞形態(tài)觀察 將分離純化獲得的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)5～7 d,觀察菌落特征并于顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態(tài)。鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[12-13]的方法。

1.2.2.2 病原菌DNA的提取 參照白逢彥等[14]的方法并略作修改,對(duì)所分離病原菌提取總DNA,具體如下:活化所分離的病原菌至PDA平板培養(yǎng)基,28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d;挑取少量菌絲體至無(wú)菌離心管,加入100 μL裂解液(100 mmol/L Tris,30 mmol/L EDTA,0.5% SDS,pH8.0),劇烈振蕩后100 ℃水浴15 min;加入100 μL、2.5 mol/L的醋酸鉀,冰浴0.5～1 h;4 ℃、13000 r/min離心5 min,上清加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1),12000 r/min離心15 min;上清加入等體積預(yù)冷的異丙醇,-20 ℃靜置15 min;12000 r/min離心15 min,收集DNA沉淀,100 μL 70%的乙醇洗滌沉淀后自然晾干;加入50 μL TE溶解DNA,-20 ℃冷藏備用。

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增及鑒定 rDNA-ITS序列擴(kuò)增的引物序列(表1)及PCR反應(yīng)體系(表2)如下。

PCR反應(yīng)程序:第一步,95 ℃預(yù)變性4 min;第二步,94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán);第三步,72 ℃延伸10 min后,4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后,120 V電泳30 min,EB染色,凝膠成像系統(tǒng)成像,將擴(kuò)增出較亮目的條帶的菌株送上海生工測(cè)序分析,測(cè)序結(jié)果用DNAMAN進(jìn)行編輯,然后將所獲得的基因序列提交至NCBI,與Genebank中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),將比對(duì)結(jié)果作為菌株最終的鑒定結(jié)果,同時(shí)采用MEGA建立系統(tǒng)進(jìn)化樹,對(duì)所用鏈格孢進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.3 乳酸菌的活化及不同發(fā)酵方式對(duì)乳酸菌抗鏈格孢活性的影響 將110株乳酸菌分別接種至MRS培養(yǎng)基進(jìn)行活化,37 ℃培養(yǎng)48 h至MRS平板長(zhǎng)出單菌落,挑取單菌落接入MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),為乳酸菌母液。分別采用固態(tài)菌餅、靜態(tài)發(fā)酵及搖床發(fā)酵3種發(fā)酵方式,獲取發(fā)酵產(chǎn)物,從中篩選具有抗鏈格孢活性的乳酸菌。

1.2.3.1 固態(tài)發(fā)酵 取30 μL乳酸菌母液至MRS固體平板中,涂布均勻,37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.3.2 靜態(tài)發(fā)酵 取相同乳酸菌母液按1∶100比例加入裝有10 mL MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中,37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。

1.2.3.3 搖床發(fā)酵 取相同乳酸菌母液按1∶100比例加入裝有10 mL MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中,37 ℃,185 r/min搖床培養(yǎng)48 h。

1.2.3.4 乳酸菌抗鏈格孢活性研究 無(wú)菌條件下挑取新鮮鏈格孢孢子至無(wú)菌水中,鏡檢懸浮液中孢子情況,制成106個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液,移取100 μL孢子懸浮液至PDA平板,涂布均勻后用打孔器打孔(直徑6 mm);分別移取乳酸菌固態(tài)發(fā)酵菌餅、100 μL乳酸菌靜態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物及100 μL乳酸菌搖床發(fā)酵產(chǎn)物至PDA平板相應(yīng)孔中,PDA平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)4～5 d,觀察鏈格孢長(zhǎng)勢(shì)及抑菌圈的形成情況,測(cè)量各組抑菌圈直徑。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置重復(fù)平行3個(gè),設(shè)置空培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 對(duì)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22進(jìn)行單因素ANOVA統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈格孢的分離及顯微觀察

果實(shí)黑斑病發(fā)病癥狀:黑斑病是香梨或蘋果等水果在貯藏6個(gè)月左右開始發(fā)病的。發(fā)病期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),發(fā)病較緩慢。癥狀:首先是果皮出現(xiàn)黑褐色斑點(diǎn)和表皮組織開始褐變硬化并收縮,從果皮蔓延到核心,最后呈現(xiàn)黑色棕色凹形。

致病菌菌落形態(tài):黑斑病病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)較慢,28 ℃培養(yǎng)5～7 d,菌落形態(tài)為黑色橢圓狀,菌絲灰色至黑色(圖1,兩株鏈格孢菌落形態(tài)相同),菌落底部為黑色。

圖1 香梨鏈格孢Ap1菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of the Alternaria(Ap1)from pear

共分離獲得2株病原菌,根據(jù)來(lái)源分別暫命名為香梨鏈格孢(Ap1)和蘋果鏈格孢(Am1),對(duì)所分離獲得致病菌進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察,結(jié)果如圖2?？梢悦黠@看出其孢子呈卵形、手榴彈狀,單生或簇生等形態(tài)。

圖2 香梨鏈格孢Ap1(A)和蘋果鏈格孢Am1(B)微觀結(jié)構(gòu)觀察Fig.2 The micro structure of the Alternaria from pear(Ap1,A)and apple(Am1,B)

2.2 鏈格孢的分子生物學(xué)鑒定

分別對(duì)所分離獲得的2株鏈格孢進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,采用A.tenuissimaCGMCC3.3546作為對(duì)照。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),3株鏈格孢的rDNA-ITS序列大小在600 bp左右,結(jié)果如圖3所示。

圖3 3株鏈格孢rDNA-ITS序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The rDNA-ITS sequence amplification results of 3 Alternaria strains注:1:A. Tenuissima CGMCC3.3546 rDNA-ITS序列條帶;2:蘋果鏈格孢Am1 rDNA-ITS序列條帶;3:香梨鏈格孢Ap1 rDNA-ITS序列條帶；M：marker。

將分離獲得的Ap1及Am1的ITS區(qū)rDNA基因部分序列與NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析,序列通過(guò)Clustal X軟件進(jìn)行排列,利用MEGA 6.0以及Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖4)。從圖4所示系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果中可以看出,菌株Ap1與梨黑斑鏈格孢(Alternariagaisen)在同一分支,而Am1與A.tenuissimaCGMCC3.3546及細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)在同一分支,結(jié)合序列比對(duì)結(jié)果,Ap1與梨黑斑鏈格孢、Am1與細(xì)極鏈格孢相似性均在99%以上。

圖4 所分離鏈格孢的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of isolated Alternaria

表3 不同發(fā)酵方式對(duì)乳酸菌(LAB)抗鏈格孢效果的影響Table 3 Effects of different fermentation methods on the resistance of LAB against Alternaria

注:結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同行字母不同表示差異顯著(p<0.05)。真菌鑒定的主要方法為形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定[16],從以上形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)果均表明:Ap1為梨黑斑鏈格孢(A.gaisen),Am1為細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)。所分離2株鏈格孢分別代表不同的鏈格孢菌種,實(shí)驗(yàn)具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。

2.3 抗鏈格孢乳酸菌的篩選及不同發(fā)酵方式對(duì)乳酸菌抗鏈格孢活性的影響

分別以A.tenuissimaCGMCC 3.3546、A.gaisenAp1及A.tenuissimaAm1為靶標(biāo),采用固體發(fā)酵、靜態(tài)發(fā)酵及搖床發(fā)酵3種不同的發(fā)酵方式對(duì)110株乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物抑制鏈格孢活性檢測(cè)。共獲得4株對(duì)不同靶標(biāo)菌株有抑制活性的乳酸菌(表3),乳酸菌68(LAB 68)、乳酸菌86(LAB 86)、乳酸菌91(LAB 91)對(duì)A.tenuissimaCGMCC 3.3546具有較好的抑菌活性,結(jié)果如圖5所示。LAB 68、乳酸菌37(LAB 37)對(duì)A.tenuissimaAm1具有較好的活性,結(jié)果如圖6所示。LAB 86對(duì)A.gaisenAp1具有明顯的抑菌活性,結(jié)果如圖7所示。其中LAB 68、LAB 86、LAB 91為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus),LAB 37為副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)。以上結(jié)果說(shuō)明不同的乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)不同的鏈格孢菌株的抑菌活性各不相同。同時(shí),分別對(duì)比固態(tài)發(fā)酵、靜態(tài)發(fā)酵及搖床發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物活性,從表3中可以看出,不同的發(fā)酵方式對(duì)乳酸菌的抗鏈格孢活性有顯著影響(p<0.05)。固態(tài)發(fā)酵菌餅的抗鏈格孢活性顯著低于靜態(tài)發(fā)酵組和搖床發(fā)酵組(p<0.05),并且靜態(tài)發(fā)酵組的抑菌圈直徑顯著低于搖床發(fā)酵組(p<0.05),搖床發(fā)酵組的抑菌圈直徑最大為21.17 mm。圖5～圖7中可以明顯看出搖床發(fā)酵組(3)的抑菌圈直徑明顯大于其他兩組。PDA平板上的鏈格孢長(zhǎng)勢(shì)均勻,抑菌圈明顯(白色部分即為抑菌圈)。

圖5 不同發(fā)酵方式及不同乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗A. tenuissima CGMCC3.3546活性Fig.5 The inhibitory activity on A. tenuissima CGMCC3.3546 of fermentation products from different lactic acid bacteria with different fermentation methods注:1:固態(tài)發(fā)酵菌餅,2:靜態(tài)發(fā)酵液,3:搖床發(fā)酵液,圖6、圖7同;A:LAB 86;B:LAB 91;C:LAB 68。

圖6 不同發(fā)酵方式及不同乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗A.tenuissima Am1活性Fig.6 The inhibitory activity on A.tenuissima Am1 of fermentation products from different lactic acid bacteria with different fermentation methods注:A:LAB 68;B:LAB 37。

圖7 不同發(fā)酵方式對(duì)LAB 86發(fā)酵產(chǎn)物的抗A. gaisen Ap1活性的影響Fig.7 The inhibitory activity on A. gaisen Ap1 of fermentation products from lactic acid bacteria 86 with different fermentation methods

3 討論

許多學(xué)者對(duì)鏈格孢的致病性進(jìn)行了報(bào)道研究。郝莉花等[17]對(duì)紅棗干果貯藏期間的真菌病害進(jìn)行了深入研究,指出紅棗因真菌病害侵染而導(dǎo)致的腐爛率達(dá)到30%以上,鏈格孢(Alternariaspp.)是紅棗干果貯藏期的優(yōu)勢(shì)病原菌,也是引起紅棗鮮果病害的主要病原菌。常有宏等[18]采用噴霧及涂抹法對(duì)梨接種黑斑病病原菌,得出此病原菌很容易使梨患病的結(jié)論,同時(shí)獲得了病原菌侵染的最適條件并指出梨黑斑病病原菌致病性的強(qiáng)弱可能與其產(chǎn)生色素有關(guān)。本研究分別從新疆南疆本地區(qū)果園采集的香梨和蘋果上分離獲得了一株鏈格孢,并鑒定為梨黑斑鏈格孢(A.gaisen)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima),這對(duì)于本地區(qū)的針對(duì)性防治黑斑病病害起到了一定的指導(dǎo)和鑒別作用。

蔡文韜等[4]從柿子椒中分離獲得了一株黏質(zhì)紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)具有較好的抑制鏈格孢的活性,該菌株發(fā)酵液的75%乙醇沉淀物和乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢產(chǎn)孢、萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)等方面都具有較好的抑菌效果,并且發(fā)現(xiàn)將其應(yīng)用于辣椒和番茄采后防腐保鮮方面也具有一定的效果,能夠大大降低果蔬的腐爛率。郭東起等[10]對(duì)新疆南疆地區(qū)引起駿棗黑斑病的病原菌進(jìn)行了分離鑒定,并篩選出10株具有較好抑制鏈格孢的酵母菌,為防治紅棗黑斑病提供了理論依據(jù)。乳酸菌的抗真菌活性也已被多位學(xué)者證實(shí),如副干酪乳桿菌(L.paracasei)能夠抑制層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)和禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)[19];Rouse S等[20]從麥芽中分離的戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)可抑制擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)等。本研究中所篩選出的4株乳酸菌分別為戊糖乳桿菌(L.pentosus)和副干酪乳桿菌(L.paracasei),均分離自新疆傳統(tǒng)乳制品,并且LAB 86對(duì)A.tenuissimaCGMCC3.3546的抑菌圈直徑為21.17 mm,明顯高于耿海峰等[6]所分離獲得的抗鏈格孢乳酸菌的抑菌活性,表明新疆牧區(qū)極為豐富的民族特色乳制品蘊(yùn)藏著眾多的乳酸菌資源,這為乳酸菌防治鏈格孢提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

乳酸菌抗真菌活性物質(zhì)種類繁多,不同乳酸菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)不同,即使同一株乳酸菌在不同的發(fā)酵條件下所產(chǎn)生的活性物質(zhì)種類也有明顯差異。從本研究中即可看出,對(duì)于同一株乳酸菌,搖床發(fā)酵組的抗鏈格孢活性相對(duì)最強(qiáng),推測(cè)可能原因是抗鏈格孢活性產(chǎn)物的產(chǎn)生與乳酸菌培養(yǎng)過(guò)程中的氧供應(yīng)有密切聯(lián)系,搖床發(fā)酵使乳酸菌與氧氣的接觸面積增大,這為乳酸菌的生長(zhǎng)和活性產(chǎn)物的產(chǎn)生提供足量的氧氣供應(yīng)。對(duì)于乳酸菌的抗真菌活性物質(zhì),有多位學(xué)者對(duì)現(xiàn)已知的不同乳酸菌產(chǎn)生的主要抗真菌物質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)闡述[8,21],這類物質(zhì)主要包括有機(jī)酸(例如乳酸及醋酸等)、雙乙酰、過(guò)氧化氫、苯乳酸、蛋白類物質(zhì)、羅伊氏菌素、羥基脂肪酸、環(huán)狀肽等。關(guān)于乳酸菌對(duì)真菌毒素的抑制機(jī)制目前主要集中在3個(gè)方面:一是乳酸菌的代謝產(chǎn)物對(duì)真菌菌株的抑制;二是乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生了抑制復(fù)合物,可抑制毒素的合成,同時(shí)降解已產(chǎn)生的毒素;三是真菌毒素與乳酸菌細(xì)胞壁之間的物理結(jié)合效果[22-23]。但是由于不同活性物質(zhì)之間存在著普通而復(fù)雜的協(xié)同作用關(guān)系,因此很難精確地闡明乳酸菌的抗菌作用機(jī)制,目前的研究主要是在生物體外直接分離鑒定具有抗菌作用的活性物質(zhì)。這也將是本研究后續(xù)的主要研究?jī)?nèi)容,探明所篩選4株乳酸菌體外抑制鏈格孢的活性物質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行分離鑒定,為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)生物防治鏈格孢引起的果實(shí)黑斑病提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

從新疆南疆阿拉爾市某果園的黑斑病香梨和蘋果上分離獲得2株鏈格孢病原菌,經(jīng)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定分別為梨黑斑鏈格孢(A.gaisen)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima),這也再次證明鏈格孢是引發(fā)水果黑斑病的主要致病菌之一。

以所分離的2株鏈格孢及1株鏈格孢標(biāo)準(zhǔn)菌株為靶標(biāo),從課題組前期分離自新疆傳統(tǒng)民族特色乳制品的110株乳酸菌中篩選抑制鏈格孢活性的乳酸菌,結(jié)果獲得了4株對(duì)相應(yīng)鏈格孢有抑制活性的乳酸菌,分別為戊糖乳桿菌(LAB 68、LAB 86和LAB 91)和副干酪乳桿菌(LAB 37),可作為后續(xù)乳酸菌抗真菌活性物質(zhì)的深入研究的菌株材料。

搖床發(fā)酵所獲得的發(fā)酵產(chǎn)物具有更好的抑菌活性,為后續(xù)相關(guān)活性菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化提供前期研究基礎(chǔ)。

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IdentificationoftheAlternariaandscreeningofthelacticacidbacteriaagainstAlternariainsouthXinjiang

LIMing-yang,XIETing-ting,LIJian,ZHANGRui-li*

(College of Life Sciences of Tarim University,Production & Construction Group Key Laboratory of Special Agricultural Products Further Processing in Southern Xinjiang,Tarim University,Alar 843300,China)

TS201.3

A

1002-0306(2017)18-0145-06

2017-02-27

李明楊(1986-)，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：lmy564181@163.com。

*通訊作者:張銳利(1975-)，男，碩士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：zrl_p@sina.com。

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2015AG003)；新疆維吾爾族自治區(qū)科技攻關(guān)計(jì)劃(2016AB009)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.028