農(nóng)藥三氟羧草醚對小鼠肝臟和腎臟氧化損傷的研究

杜俊停，李瀟瀟，宋 靜，張 倩，陸林潔，袁均林

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079)

農(nóng)藥三氟羧草醚對小鼠肝臟和腎臟氧化損傷的研究

杜俊停，李瀟瀟，宋 靜，張 倩，陸林潔，袁均林*

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079)

農(nóng)藥三氟羧草醚是一種原卟啉原氧化酶的抑制劑。為了探究三氟羧草醚對小鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷，將24只雄性Balb/c小鼠隨機(jī)分成4組：1個生理鹽水對照組和3個劑量水平為0.1 mg·kg-1、5 mg·kg-1、250 mg·kg-1的三氟羧草醚染毒組，14 d經(jīng)口灌胃染毒。制備組織勻漿液并測定組織中細(xì)胞色素c (cyt-c)、活性氧(ROS)、還原型谷胱甘肽(GSH)、脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的含量。結(jié)果表明：三氟羧草醚劑量為250 mg·kg-1時，肝臟和腎臟組織的臟器系數(shù)、ROS、MDA和8-OHdG的含量均有明顯上升(P<0.05)；細(xì)胞色素c和GSH的含量有顯著下降(P<0.05)；表明較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚能夠降低肝臟和腎臟組織中細(xì)胞色素c的含量以及可造成小鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷。

三氟羧草醚；肝臟；腎臟；細(xì)胞色素c；氧化損傷

Abstract：Acifluorfen is a kind of protoporphyrinogen oxidase inhibitor.In order to explore the oxidative stress on mouse liver and kidney induced by acifluorfen，we divided 24 Balb/c mice into four groups randomly:a control group and three dosage levels of acifluorfen poisoned groups (0.1 mg·kg-1，5 mg·kg-1，and 250 mg·kg-1) which were exposed by oral perfusion for 14 days.We prepared tissue homogenate， determined the contents of cytochrome c(cyt-c),reactive oxygen species(ROS)，reduced glutathione(GSH),malondialdehyde(MDA)，and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) in tissues.The results showed that when acifluorfen dosage was 250 mg·kg-1,organ coefficients，the contents of ROS,MDA,and 8-OHdG in liver and kidney tissues increased significantly(P<0.05),whereas the contents of cyt-c and GSH decreased significantly(P<0.05).The above results showed that high doses of acifluorfen could decrease the content of cyt-c in liver and kidney tissues,and induce the oxidative stress on mouse liver and kidney.

Keywords：acifluorfen;liver;kidney;cytochrome c;oxidative stress

原卟啉原氧化酶是機(jī)體內(nèi)的一個關(guān)鍵酶，參與合成亞鐵血紅素和葉綠素[1]。三氟羧草醚(acifluorfen)屬于二苯醚類除草劑，是近年來發(fā)展比較快的除草劑品種之一[2]。研究表明，在植物體內(nèi)三氟羧草醚能夠降低原卟啉原氧化酶的活性[3]。三氟羧草醚引起植物的生理變化主要有：生長受到抑制、葉綠素降解增多、原卟啉Ⅸ大量積累和細(xì)胞膜遭到破壞。其作用機(jī)理主要是由于大量活性氧(ROS)產(chǎn)生導(dǎo)致脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用，因而三氟羧草醚又稱為過氧化除草劑[4]。在動物機(jī)體中，三氟羧草醚也能夠抑制肝細(xì)胞中原卟啉原氧化酶的活性，導(dǎo)致原卟啉Ⅸ的積累[5]。卟啉本身是一種致癌物質(zhì)，具有光化學(xué)細(xì)胞毒性，過量的卟啉經(jīng)照射后可形成高反應(yīng)性的氧自由基，過量的氧自由基通過氧化作用破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。有8種酶參與血紅素的生物合成，其中任何一種酶的缺乏或者活性受到抑制將導(dǎo)致某種形式的卟啉癥。而卟啉癥與肝細(xì)胞癌存在某種聯(lián)系，卟啉癥患者發(fā)生肝細(xì)胞癌的風(fēng)險增大[6]。美國EPA在2002年再次強(qiáng)調(diào)對三氟羧草醚的關(guān)注，將該藥歸于可能的致癌物[7]。在大鼠和小鼠體內(nèi)，三氟羧草醚能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性和后期的肝腫瘤[8]。Stevens等[9]研究表明，三氟羧草醚是一種過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的激活劑，而PPARα的活化可誘導(dǎo)肝腫瘤的發(fā)生[10]。Kuwata等[8]實驗表明，長期的細(xì)胞毒性是三氟羧草醚引發(fā)肝腫瘤發(fā)生的重要因素，組成型雄甾烷受體(CAR)在三氟羧草醚引發(fā)的小鼠急性肝臟損傷和腫瘤發(fā)生的發(fā)展中起重要作用。目前三氟羧草醚誘導(dǎo)肝腫瘤發(fā)生的具體機(jī)制還不是很清楚，氧化應(yīng)激能夠引發(fā)細(xì)胞毒性，也是許多疾病發(fā)展和組織損傷的重要因素和作用機(jī)制，因而肝臟氧化損傷的研究對機(jī)制的探索是十分有價值的。侯粉霞等[11]研究表明，肝臟、腎臟和血液系統(tǒng)可能是三氟羧草醚原藥作用于大鼠的主要靶器官。近幾年關(guān)于三氟羧草醚的毒性研究甚少，為全面認(rèn)識三氟羧草醚對動物機(jī)體健康的影響，作者探究了三氟羧草醚對小鼠肝臟和腎臟的氧化損傷，為三氟羧草醚的毒性作用研究提供更豐富的信息。

1 實驗

1.1 主要試劑與儀器

2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA 熒光染料，濃度99.9%)、戊巴比妥鈉，Sigma；硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)，分析純，國藥集團(tuán)；小鼠細(xì)胞色素c酶聯(lián)免疫試劑盒、小鼠8-OHdG酶聯(lián)免疫試劑盒、微量還原型谷胱甘肽試劑盒、福林酚試劑盒，南京建成。

FLX800熒光酶標(biāo)儀,美國Bio-Tek。

1.2 受試農(nóng)藥

三氟羧草醚原藥(純度92%)，上海將來生化試劑公司。

1.3 實驗動物

24只體重約22 g的SPF級雄性Balb/c小鼠[合格證號：No.42000600013094，許可證號：SCXK(鄂)2015-0018]，湖北省實驗動物疾控中心。在實驗期間小鼠飼養(yǎng)于一個溫度約為21～25 ℃、濕度為51%～70%、無致病源的無菌環(huán)境中。

1.4 實驗動物的分組與染毒

24只SPF級雄性Balb/c小鼠先在無菌環(huán)境飼養(yǎng)7 d。7 d后隨機(jī)將小鼠分成4組:1個空白對照組，給予生理鹽水;3個染毒組，三氟羧草醚劑量分別為0.1 mg·kg-1、5 mg·kg-1和250 mg·kg-1。各組采用經(jīng)口灌胃方法染毒，連續(xù)染毒14 d，染毒結(jié)束后用頸椎脫臼法將小鼠處死。

1.5 臟器系數(shù)

用鑷子將小鼠的整個肝臟和兩側(cè)腎臟取出，浸在冰冷的PBS溶液中沖洗，濾紙拭干表面水分并去除附在表面的脂肪組織，稱重并計算臟器系數(shù)：臟器系數(shù)=(臟器濕重/體重)×100%。

1.6 肝臟、腎臟組織切片的制備和觀察

用消毒過的鑷子將肝臟和腎臟取出,浸泡在濃度為10%的福爾馬林中，然后制備石蠟切片，H&E染色，最后在顯微鏡下察看肝臟和腎臟組織切片，觀察其病理學(xué)變化。

1.7 肝臟和腎臟組織勻漿

用pH值為7.5的PBS溶液漂洗肝臟和腎臟組織，用濾紙吸去其表面水分，然后加入一定量的PBS溶液制成10%勻漿液，4 ℃離心后取上清液，備用。

1.8 分析測試

1.8.1 活性氧(ROS)含量的測定

參照Crow[12]方法。各取小鼠肝臟和腎臟組織離心后的勻漿上清液4 μL，加入396 μL PBS溶液稀釋100倍。用移液槍分別加入100 μL稀釋液和DCFH-DA熒光染料于酶標(biāo)板中，然后在37 ℃下避光反應(yīng)10 min，最后用酶標(biāo)儀檢測其熒光強(qiáng)度。

1.8.2 丙二醛(MDA)含量的測定

參照Draper等[13]方法。各取0.5 mL肝臟和腎臟組織離心后的勻漿上清液于小管中，加入2 mL 6%TBA進(jìn)行沸水浴15 min，再用冰水冷卻，取1 mL，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液200 μL于酶標(biāo)板中，測其在450 nm、532 nm、600 nm處的OD值，計算丙二醛的含量c(μmol·L-1)：c=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450。

1.8.3 還原型谷胱甘肽(GSH)含量的測定

各取400 μL肝臟和腎臟組織離心后的勻漿上清液于小管中，加入V氯仿∶V正丁醇=4∶1的有機(jī)溶劑2 mL，冰上冷卻10 min后，10 000 r·min-1離心5 min，然后取50 μL上清液于酶標(biāo)板中，并加入濃度為60 ng·mL-1的150 μL DTNB，室溫下避光5 min，測其在412 nm處的OD值?？瞻捉M用50 μL PBS溶液代替上清液。

1.8.4 其它指標(biāo)的測定

細(xì)胞色素c、8-OHdG以及蛋白質(zhì)含量的測定嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計分析

實驗測得的數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件處理，單因素方差分析(ANOVA)用于比較多組間均數(shù)，LSD檢驗用于比較兩組間均數(shù)的差異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠肝臟和腎臟的臟器系數(shù)的變化(圖1)

*表示P<0.05，**表示P<0.01,與對照組相比

由圖1可知，低、中劑量三氟羧草醚染毒組(≤ 5 mg·kg-1)肝臟和腎臟的臟器系數(shù)與對照組無顯著差異。高劑量(250 mg·kg-1)三氟羧草醚染毒組小鼠的肝臟和腎臟系數(shù)均明顯變大(P<0.01，P<0.05)。說明較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚可能造成小鼠肝臟和腎臟的腫大。

2.2 小鼠肝臟和腎臟組織切片觀察(圖2、圖3)

a.空白對照組 b～d，三氟羧草醚染毒組：

由圖2a可知，對照組的肝細(xì)胞排列比較有規(guī)則，即以中央靜脈為中心向外輻射狀排列；由圖2b、c可知，低、中劑量三氟羧草醚染毒組與對照組比較沒有明顯變化；由圖2d可知，250 mg·kg-1染毒組可以觀察到明顯的肝臟組織病變，如部分細(xì)胞核固縮、破裂、水解、胞漿空亮、空泡樣變、局部細(xì)胞嚴(yán)重壞死，說明250 mg·kg-1三氟羧草醚能導(dǎo)致肝臟組織嚴(yán)重?fù)p傷。

a.空白對照組 b～d,三氟羧草醚染毒組:

由圖3可知，低、中劑量三氟羧草醚染毒組和對照組相比，腎臟組織沒有明顯差別；250 mg·kg-1染毒組出現(xiàn)了腎小體數(shù)量減少、腎小體血管球增生肥大、與囊壁界限不清等癥狀。說明250 mg·kg-1三氟羧草醚也能導(dǎo)致小鼠腎臟組織的嚴(yán)重?fù)p傷。

2.3 細(xì)胞色素c含量的影響(圖4)

*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對照組相比

由圖4可知，與對照組相比，染毒劑量為5 mg·kg-1和250 mg·kg-1時，肝臟組織中細(xì)胞色素c含量顯著降低 (P<0.05，P<0.01)；染毒劑量≤5 mg·kg-1，腎臟組織中細(xì)胞色素c含量無明顯差異(P>0.05)；染毒劑量為250 mg·kg-1時，肝臟和腎臟組織細(xì)胞色素c含量具有明顯差異(P<0.01，P<0.05)。表明，較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚能夠降低小鼠肝臟和腎臟組織中細(xì)胞色素c的含量。

2.4 ROS含量的影響(圖5)

*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對照組相比

由圖5可知，低、中劑量染毒組(≤5 mg·kg-1)肝臟組織中的ROS含量與對照組相比無明顯差異(P>0.05)，250 mg·kg-1染毒組有明顯升高(P<0.01)。染毒劑量為5 mg·kg-1和250 mg·kg-1時，腎臟組織中ROS含量與對照組相比均有顯著升高(P<0.05，P<0.01)。表明，較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚能造成肝臟和腎臟組織中ROS含量的上升。

2.5 GSH含量的影響(圖6)

*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對照組相比

由圖6可知，與對照組相比，低、中劑量三氟羧草醚染毒組(≤5 mg·kg-1)肝臟和腎臟組織中的GSH含量無統(tǒng)計學(xué)差異，250 mg·kg-1染毒組肝臟和腎臟組織中的GSH都有明顯降低 (P<0.01，P<0.05)。表明，較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚能造成肝臟和腎臟組織中GSH含量下降。

2.6 MDA含量的影響(圖7)

*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對照組相比

由圖7可知，與對照組相比，低、中劑量三氟羧草醚染毒組(≤5 mg·kg-1)小鼠肝臟組織中MDA含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，然而高劑量染毒組出現(xiàn)明顯升高 (P<0.05)；在腎臟組織中，染毒劑量為5 mg·kg-1和250 mg·kg-1時，MDA含量均有升高(P<0.05，P<0.01)。表明，較高劑量的三氟羧草醚能使小鼠肝臟和腎臟組織細(xì)胞的脂膜受到損傷。

2.7 8-OHdG含量的影響(圖8)

*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對照組相比

由圖8可知，在肝臟和腎臟組織中，染毒劑量≤5 mg·kg-1，其8-OHdG含量與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；然而染毒劑量為250 mg·kg-1，8-OHdG含量均有明顯的升高(P<0.01，P<0.05)。表明，較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚能使小鼠肝臟和腎臟組織細(xì)胞的DNA受到損傷。

2.8 討論

臟器系數(shù)的變動能夠反映一種有毒化學(xué)物對某組織毒性的綜合情況[14]，也是找到有毒物質(zhì)主要作用靶器官的可靠依據(jù)。正常情況下，各個臟器在動物機(jī)體中的比例是相對恒定的，動物暴露于一些毒素后，如果器官受損，其重量和臟器系數(shù)會發(fā)生相應(yīng)的改變。臟器充血、水腫變大以及臟器增生等病變都將引起對應(yīng)的臟器系數(shù)增大；臟器萎縮或退行等病變將引起對應(yīng)的臟器系數(shù)減小。本研究表明，250 mg·kg-1三氟羧草醚引起了肝臟和腎臟臟器系數(shù)的顯著升高，說明250 mg·kg-1三氟羧草醚對小鼠的肝臟和腎臟有損傷作用。

細(xì)胞色素c是由前細(xì)胞色素c和亞鐵血紅素組成[15]。細(xì)胞色素c在線粒體中有傳遞電子的功能[16]，如果細(xì)胞色素c不足，電子的傳遞將被阻斷，從而造成ATP合成減少以及生成大量的超氧陰離子[17]。另外，細(xì)胞色素c還有抵抗超氧自由基和雙氧水的抗氧化功能[18-19]。正常水平的細(xì)胞色素c含量對線粒體保持正常的氧自由基水平有至關(guān)重要的作用。本研究表明，三氟羧草醚劑量為250 mg·kg-1時，三氟羧草醚分別導(dǎo)致小鼠肝臟和腎臟組織中細(xì)胞色素c含量下降，這可能是肝臟和腎臟組織細(xì)胞內(nèi)的氧自由基量失衡的原因之一。

ROS是一種反映細(xì)胞中氧自由基水平的重要指標(biāo)[20]，動物在正常狀態(tài)下會產(chǎn)生適量的ROS，ROS是機(jī)體進(jìn)行正常生命活動的一種重要物質(zhì)，比如其參與了機(jī)體的保護(hù)、傳遞信號調(diào)控細(xì)胞分裂和分化等[21]；但過量的ROS將對機(jī)體產(chǎn)生一定的損傷作用，過量的ROS會攻擊氧化細(xì)胞各個組織成分，包括遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，以及引發(fā)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。本研究表明，在三氟羧草醚劑量為250 mg·kg-1時，三氟羧草醚能夠引起小鼠肝臟和腎臟組織中ROS含量增多。

GSH在清除細(xì)胞內(nèi)過量的活性氧的過程中發(fā)揮重大的作用。GSH是保護(hù)細(xì)胞免受ROS傷害的第一道防線，GSH在一定程度上能降低氧自由基的水平，還能促進(jìn)修復(fù)ROS引發(fā)的生物學(xué)傷害。但是，如果細(xì)胞GSH降低到一定水平時，將導(dǎo)致細(xì)胞受到嚴(yán)重破壞[22]。因此GSH含量可以作為反映機(jī)體的抗氧化能力的重要指標(biāo)。本研究表明，三氟羧草醚劑量為250 mg·kg-1時，三氟羧草醚能夠?qū)е滦∈蟾闻K和腎臟組織中的GSH含量下降。

過量的ROS還可氧化生物膜上的脂質(zhì)，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。MDA可間接反映自由基水平[23]，其含量的多少代表脂質(zhì)過氧化的程度和快慢[24-25]。本研究表明，在三氟羧草醚劑量為250 mg·kg-1時，三氟羧草醚能導(dǎo)致小鼠肝臟和腎臟組織脂類氧化產(chǎn)物MDA含量升高。

過量的氧自由基還可與DNA的脫氧鳥苷發(fā)生氧化反應(yīng)生成8-OHdG[26]。8-OHdG是一種只能在DNA發(fā)生氧化損傷的途徑中產(chǎn)生的穩(wěn)定性較高的氧化產(chǎn)物，所以8-OHdG含量的測定是一種評定DNA氧化損傷水平的可靠線索[27]。本研究表明，在三氟羧草醚劑量為250 mg·kg-1時，三氟羧草醚導(dǎo)致小鼠肝臟和腎臟組織8-OHdG含量明顯升高。說明高濃度的三氟羧草醚可引起小鼠肝臟和腎臟組織細(xì)胞中DNA發(fā)生氧化損傷，可能會導(dǎo)致小鼠組織進(jìn)一步病變甚至癌變。

3 結(jié)論

研究了農(nóng)藥三氟羧草醚對Balb/c小鼠肝臟和腎臟的氧化損傷，結(jié)果表明：(1)較高劑量(≥250 mg·kg-1)三氟羧草醚能夠降低細(xì)胞色素c的含量；(2)在較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚誘導(dǎo)之下機(jī)體產(chǎn)生了過量的ROS，大量的ROS攻擊細(xì)胞內(nèi)的各組分，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)GSH含量下降、脂質(zhì)過氧化物MDA增多和DNA發(fā)生損傷增多，造成小鼠肝臟和腎臟組織產(chǎn)生了一定程度的氧化損傷，而這有可能與細(xì)胞色素c含量的降低有關(guān)。

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OxidativeStressonMouseLiverandKidneyInducedbyAcifluorfen

DU Jun-ting,LI Xiao-xiao,SONG Jing,ZHANG Qian,LU Lin-jie,YUAN Jun-lin*

(HubeiKeyLaboratoryofGeneticRegulationandIntegrativeBiology,CollegeofLifeScience,HuazhongNormalUniversity,Wuhan430079,China)

R114

A

1672-5425(2017)09-0029-06

國家自然科學(xué)基金重點項目(51136002)

2017-04-08

杜俊停(1990-)，女，河南濮陽人，碩士研究生，研究方向：環(huán)境毒理，E-mail：dujunting166@126.com;通訊作者：袁均林，副教授，E-mail:yuanjl@mail.ccnu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.09.006

杜俊停，李瀟瀟，宋靜，等.農(nóng)藥三氟羧草醚對小鼠肝臟和腎臟氧化損傷的研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(9)：29-34，45.