毛細(xì)管電泳法同時(shí)測定發(fā)酵制品中D-和L-乳酸含量

汪雪蓮，於釗慶，朱 莉，張?jiān)ｂ?，?進(jìn)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

毛細(xì)管電泳法同時(shí)測定發(fā)酵制品中D-和L-乳酸含量

汪雪蓮，於釗慶，朱 莉，張?jiān)ｂ?，?進(jìn)*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

發(fā)酵制品中的乳酸通常是D,L-混合型，而D-乳酸的每日攝入量是有限制的。因此開發(fā)準(zhǔn)確測定發(fā)酵制品中D-和L-乳酸含量方法，對于控制食品品質(zhì)、保障食品安全具有重要意義。建立了同時(shí)測定發(fā)酵制品中D-和L-乳酸含量的毛細(xì)管電泳分析方法，考察了2-羥丙基-β-環(huán)糊精濃度、緩沖溶液pH值、分離電壓、分離溫度等因素對乳酸手性分離的影響。結(jié)果表明，使用中性毛細(xì)管，以500 mmol·L-12-羥丙基-β-環(huán)糊精為手性選擇劑，200 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH值為6.0)為電泳緩沖液，在分離電壓為-20 kV、分離溫度為20 ℃條件下可使D-和L-乳酸達(dá)到基線分離，分離度為1.5。

毛細(xì)管電泳；手性分離；乳酸；D-乳酸；L-乳酸

Abstract：Usually，both D- and L-lactic acids exist in the fermentation products.But D-lactic acid intake should be limited.So，developing an accurate method for the determination of D- and L-lactic acids in fermentation products is very important for controlling food quality and guaranteeing food security.We established a capillary electrophoresis assay for the simultaneous determination of D- and L-lactic acids in fermentation products,and investigated the effects of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin concentration，pH value of buffer solution，separation voltage，and separation temperature on the chiral separation of lactic acid.Results showed that D- and L-lactic acids reached the baseline separation，and the resolution was 1.5 under the conditions as follows: using neutral capillary,500 mmol·L-12-hydroxypropyl-β-cyclodextrin as a chiral selector， 200 mmol·L-1phosphate buffer (pH value 6.0) as electrophoretic buffer,separation voltage of -20 kV，and column temperature of 20 ℃.

Keywords：capillary electrophoresis；chiral separation；lactic acid；D-lactic acid；L-lactic acid

乳酸(lactic acid)又名α-羥基丙酸(α-hydroxypropionic acid)，為世界上公認(rèn)的3大有機(jī)酸之一，廣泛存在于生物體中，是生物細(xì)胞厭氧糖代謝的重要產(chǎn)物。乳酸是最小的手性分子，具有L(+)和D(-)2種對映體。許多乳酸菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)乳酸消旋酶(lactate racemase)能催化L-或D-乳酸轉(zhuǎn)化為相反的對映體。乳酸消旋酶的存在使得最終發(fā)酵產(chǎn)物仍為D，L-混合型乳酸[1]。

人和動(dòng)物體內(nèi)存在L-乳酸脫氫酶，能代謝L-乳酸，因而L-乳酸在食品工業(yè)上用作酸味劑和防腐劑，與檸檬酸、蘋果酸等食用酸相比具有很強(qiáng)的競爭力。但是人和動(dòng)物體內(nèi)并不存在D-乳酸脫氫酶，不能分解與代謝D-乳酸[2]。因此攝入過量的D,L-乳酸或D-乳酸會(huì)導(dǎo)致血液中D-乳酸積累，引起代謝紊亂，甚至出現(xiàn)酸中毒癥狀[3-4]。世界衛(wèi)生組織(WHO)明確規(guī)定人體每天的D-乳酸攝入量不能超過100 mg·kg-1，而對L-乳酸攝入量則不加限制[5]。

因此,乳酸制品中不僅需要測定乳酸總量，還需要準(zhǔn)確測定D-和L-乳酸的含量，這對于控制食品品質(zhì)、提高食品安全具有重要意義。利用乳酸脫氫酶的酶分析法是檢測乳酸對映體的簡單方法，但該方法反應(yīng)時(shí)間長，誤差也較大[6]。色譜是最常用的分離技術(shù)，已經(jīng)建立了許多拆分乳酸對映體的HPLC[6-11]與GC[12-13]方法,但均需要專一性的手性色譜柱。毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)具有快速、高效、靈敏及對環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。已經(jīng)有許多研究者建立了血液與體液中拆分乳酸對映體的CE方法[14-15]。鑒于此，作者針對發(fā)酵制品，優(yōu)化并建立了分析D-和L-乳酸的CE分析方法，為發(fā)酵制品中D-乳酸的控制提供了一種簡便方法。同時(shí)，該方法可為篩選高產(chǎn)L-乳酸的乳酸菌提供直接的鑒定方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

3種酸奶、1種泡菜，購于武漢市超市。

D-乳酸鋰、L-乳酸鋰，Sigma公司；2-羥丙基-β-環(huán)糊精，山東新大生物科技有限公司；乳酸(分析純)、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、磷酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

P/ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀、中性毛細(xì)管，Beckman Coulter 公司；S-320型pH計(jì)，Mettler Toledo公司；5415D型離心機(jī)，Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 毛細(xì)管電泳條件

在涂層的中性毛細(xì)管(60 cm×50 μm)中，以2-羥丙基-β-環(huán)糊精(500 mmol·L-1)為手性選擇劑；檢測波長為200 nm，分離電壓為-20 kV，柱溫為20 ℃；壓力進(jìn)樣(0.5 psi × 40 s)；緩沖液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾；每次運(yùn)行前用雙蒸水、1 mmol·L-1磷酸、雙蒸水各洗5 min。

1.2.2 樣品測定

配制80 mmol·L-1乳酸于-18 ℃保存，使用當(dāng)天取出稀釋10倍，離心(10 000×g、5 min)后加入樣品管進(jìn)行電泳。

酸奶、泡菜均稀釋200倍，離心(10 000×g、5 min)后加入樣品管進(jìn)行電泳。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，為得到最佳的分離條件，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)如表1。

表1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Tab.1 Design of orthogonal experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 手性選擇劑

環(huán)糊精及其衍生物是最為常用的手性選擇劑[16]。本實(shí)驗(yàn)比較了不同環(huán)糊精的效果，結(jié)果表明，2-羥丙基-β-環(huán)糊精可以成功拆分乳酸對映體。這可能是由2-羥丙基-β-環(huán)糊精的特殊結(jié)構(gòu)所決定的，其羥丙基上的羥基自由度較高，恰好能與乳酸的手性碳——羧基α-位碳原子很好地結(jié)合[17]。

2.2 分離電壓、分離溫度對手性拆分的影響

毛細(xì)管內(nèi)的溫度影響分離度。溫度低，渦流或振動(dòng)能減弱，從而增強(qiáng)D-或L-乳酸與2-羥丙基-β-環(huán)糊精內(nèi)部和邊緣的結(jié)合力，提高手性選擇劑對對映體的選擇性[18]。在17.5～30 kV電壓范圍內(nèi)，分離度隨著電壓的升高而升高，當(dāng)電壓為20 kV時(shí)分離度達(dá)到最大，而后隨著電壓的升高分離效果反而變差，這可能與焦耳熱有關(guān)。綜合考慮，選擇分離溫度為20 ℃，分離電壓為-20 kV。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在9種電泳緩沖液中，5#緩沖液(即pH值為6.0，磷酸緩沖液濃度為200 mmol·L-1，2-羥丙基-β-環(huán)糊精濃度為500 mmol·L-1)的分離度最大(Rs=1.5)，已達(dá)基線分離(如圖1)。而根據(jù)所得數(shù)據(jù)，用正交設(shè)計(jì)軟件計(jì)算出的最優(yōu)條件為：pH值6.0，磷酸緩沖液濃度225 mmol·L-1，2-羥丙基-β-環(huán)糊精濃度500 mmol·L-1。

進(jìn)一步比較了這兩種條件下的分離情況，結(jié)果表明5#緩沖液更利于分離。這說明考察的三因素之間可能還存在著交互作用，不能僅憑正交實(shí)驗(yàn)來確定最優(yōu)條件。因此，確定以500 mmol·L-12-羥丙基-β-環(huán)糊精為手性選擇劑，200 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH值為6.0)為電泳緩沖液。

圖1 乳酸的手性分離電泳圖Fig.1 Chiral separation electrophoretogram of lactic acid

2.4 線性范圍、檢測限

配制濃度為0.1～10.0 mmol·L-1的乳酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行電泳分離，以濃度為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，線性關(guān)系見表2。

采用稀釋法測得L-乳酸及D-乳酸的最低檢測限分別為0.25 mmol·L-1和0.28 mmol·L-1。

2.5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

以4 mmol·L-1乳酸溶液在優(yōu)化條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，遷移時(shí)間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別小于1.0%和2.0%，表明該方法重現(xiàn)性好。

2.6 回收率

將乳酸配制成1.59 mmol·L-1的溶液，分別與1 mmol·L-1D-乳酸(1#)和1 mmol·L-1L-乳酸(2#)及水(3#)以1∶1的比例混合，測定回收率，結(jié)果見表3。

表2方法的線性關(guān)系與檢測限

Tab.2 Linear relationship and detection limit of the method

表3乳酸的回收率

Tab.3 Recovery of lactic acid

由表3可知，L-乳酸和D-乳酸的回收率分別為91.5%～106.3%和96.7%～108.8%，表明該方法準(zhǔn)確度好。

2.7 樣品的測定

在被測定的4種發(fā)酵制品中，只有酸奶C同時(shí)檢測出L-乳酸和D-乳酸，其它發(fā)酵制品只檢測出L-乳酸。根據(jù)回歸方程，計(jì)算出4種發(fā)酵制品中L-乳酸含量分別為：酸奶A 112 mmol·L-1、酸奶B 122 mmol·L-1、酸奶C 114 mmol·L-1、泡菜36 mmol·L-1，其中酸奶C中D-乳酸含量為42 mmol·L-1。

3 結(jié)論

建立了乳酸對映體的手性拆分毛細(xì)管電泳法，并達(dá)到基線分離。L-乳酸在0.25～1.5 mmol·L-1、D-乳酸在0.28～1.4 mmol·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系好，重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高，而且簡便易操作，能連續(xù)自動(dòng)地進(jìn)行發(fā)酵制品中D-乳酸和L-乳酸的測定。

[1] XU T，WODRICH M D，SCOPELLITI R，et al．Nickel pincer model of the active site of lactate racemase involves ligand participation in hydride transfer[J]．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2017，114(6)：1242-1245．

[2] GIORGIO C，ANNAMARIA P，CARLO S，et al．A simple，sensitive and efficient assay for the determination of D- and L-lactic acid enantiomers in human plasma by high-performance liquid chromatography[J]．Journal of Chromatography A，2011，1218(6)：787-792.

[3] KOWLGI N G，CHHABRA L．D-lactic acidosis：an underrecognized complication of short bowel syndrome[J]．Gastroenterology Research and Practice，2015：476215.doi:10.1155/2015/476215.

[4] URIBARRI J，OH M S，CARROLL H J．D-lactic acidosis:a review of clinical presentation，biochemical features，and pathophysiologic mechanisms[J]．Medicine，1998，77(2)：73-82.

[5] WEE Y J，KIM J N，RYU H W．Biotechnological production of lactic acid and its recent applications[J]．Food Technology and Biotechnology，2006，44(2)：163-172.

[6] EWASCHUK J B，ZELLO G A，NAYLOR J M，et al．Metabolic acidosis：separation methods and biological relevance of organic acids and lactic acid enantiomers[J]．Journal of Chromatography B，2002，781(1/2)：39-56．

[7] BUGLASS A L，LEE S H．Sequential analysis of malic acid and both enantiomers of lactic acid in wine using a high performance liquid chromatog raphic column-switching procedure[J]．Journal of Chromatographic Science，2001，39(11)：453-458．

[8] 白冬梅，趙學(xué)明，胡宗定．高效液相色譜法測定米根霉乳酸發(fā)酵液中乳酸的光學(xué)純度[J].色譜，2001，19(1)：13-15．

[9] 黎婕，劉冬梅，馮細(xì)漫．幾種泡菜中的乳酸兩種手性對映體和亞硝酸鹽的測定[J]．食品研究與開發(fā)，2010，31(12)：129-133．

[10] 何悅銘，王杉，揭琴豐，等．手性色譜法測定L-乳酸鋅[J]．食品科學(xué)，2015，36(14)：107-110．

[11] 孫晶，朱學(xué)伸，王苑，等．食品中L-乳酸檢測方法及其研究進(jìn)展[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(31)：17801-17802，17805．

[12] BETSCHINGER F，LIBMAN J，SHAZER A．Gas chromatographic enantiomer separation on a chiral self associating selector[J]．Journal o f Chromatography A，1996，746(1)：53-62

[13] 常影，邱靜，魏吉安，等．衍生化氣相色譜法檢測瘤胃液和青貯液中乳酸對映體和揮發(fā)酸[J]．中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，11(2)：49-53．

[14] 王羽，葛衛(wèi)紅．高效毛細(xì)管電泳法同時(shí)測定人血漿D，L-乳酸對映體[J]．中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38(5)：412-414．

[15] SAAVEDRA L，BARBAS C．Optimization of the separation lactic acid enantiomers in body fluids by capillary electrophoresis[J]．Journal of Chromatography B，2002，766(2)：235-24

[16] 李德茂，李從發(fā)，劉四新，等．苯基乳酸的手性毛細(xì)管電泳拆分[J]．色譜，2004，22(3)：281-283．

[17] CLOHS L，MCERLANE K M．Development of a capillary electrophoresis assay for the determination of carvedilol enantiomers in serum using cyclodextrins[J]．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2001，24：545-554．

[18] KODAMA S，YAMAMOTO A，MATSUNAGE A，et al．Direct chiral resolution of lactic acid in food product by capillary electrophoresis[J]．Journal of Chromatography A，2000，875(1/2)：371-377．

SimultaneousDeterminationofD-andL-LacticAcidsbyCapillaryElectrophoresis

WANG Xue-lian,YU Zhao-qing,ZHU Li,ZHANG Yu-ling,HE Jin*

(CollegeofLifeScienceandTechnology,HuanzhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

O657.8

A

1672-5425(2017)09-0064-03

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(HZAU：2662017PY112)

2017-06-13

汪雪蓮(1986-)，女，湖北宜昌人，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)與生物信息學(xué)，E-mail:wangxuelian1215@163.com；通訊作者：何進(jìn)，教授，E-mail:hejin@mail.hzau.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.09.014

汪雪蓮，於釗慶，朱莉,等.毛細(xì)管電泳法同時(shí)測定發(fā)酵制品中D-和L-乳酸含量[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(9)：64-66,70.