鐵皮石斛多糖提取工藝優(yōu)化及分子量分析

韓 冉，李 卿，王汝華，孔 宇，梁增瀾，張 金，趙慧慧

鐵皮石斛多糖提取工藝優(yōu)化及分子量分析

韓 冉，李 卿，王汝華，孔 宇，梁增瀾，張 金，趙慧慧

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

鐵皮石斛中含有較高的石斛多糖，以新鮮鐵皮石斛為原料，采用酶解法和超聲法提取，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化2種提取方式的工藝條件，比較其多糖得率，并對提取得到的多糖分子量進行了初步分析。結(jié)果表明，酶解提取法的最優(yōu)工藝參數(shù)為提取液pH值6.0，果膠酶濃度1 500 U/L，提取溫度60℃；超聲輔助提取法的最優(yōu)工藝參數(shù)為超聲頻率24 kHz，超聲時間20 min，超聲溫度25℃。高效液相色譜分析的結(jié)果顯示，超聲法提取后的鐵皮石斛多糖分子量高于酶解法。

鐵皮石斛；多糖；酶解；超聲；分子量

0 引言

鐵皮石斛（Dendrobium candidum Wall.ex Lindl）位列“中華九大仙草”之首[1]，享有“藥中黃金”的佳譽。其藥用部分為新鮮或干燥莖，有益胃生津、滋陰清熱、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老等功效。但石斛屬植物生長緩慢，對生長環(huán)境要求嚴(yán)格[2]，嚴(yán)重的供求失衡最終導(dǎo)致石斛資源短缺，價格昂貴。近年來，為了緩解石斛屬植物的嚴(yán)峻現(xiàn)狀，開始研究人工栽培技術(shù)，但人工栽培石斛的化學(xué)成分與野生石斛存在較大差異。因此，如何最大限度提取石斛中的有效化學(xué)成分是研究者亟待解決的問題。

鐵皮石斛化學(xué)組分主要包括石斛多糖、生物堿、游離氨基酸、礦物質(zhì)元素等[3]，其中石斛多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、降血糖[4-8]等作用。水提醇沉法是提取多糖最常用的方法，也是較為傳統(tǒng)的一種方法，但其試劑使用量大、提取多糖得率較低。采用酶解提取法和超聲輔助提取法，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化2種提取方式的工藝參數(shù)，最大限度地提取石斛多糖。同時，通過高效液相色譜分析2種提取方式下石斛多糖的結(jié)構(gòu)，為進一步探究其結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和設(shè)備

3年生仿野生鐵皮石斛鮮條（含水量約75%），產(chǎn)自浙江樂清雁蕩山；果膠酶（30 000 U/mL），Solarbio公司提供；HK-08型搖擺式粉碎機，廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；722型可見分光光度計，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；FD-10型冷凍干燥機，北京德天佑科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；LC Solution 1.26 SP1型高效液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司產(chǎn)品。

1.2 鐵皮石斛的干品制備

將新鮮鐵皮石斛的莖部截成長1～2 cm的小段，置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)于50℃條件下烘干3～4 h，再經(jīng)搖擺式粉碎機進行粉碎，過80目篩后備用。

1.3 石斛多糖的提取工藝流程

（1） 酶解提取法。80目石斛粉→加熱浸提→果膠酶水解→滅酶處理→抽濾去除不溶雜質(zhì)→真空濃縮→醇沉多糖→離心→沉淀復(fù)溶→真空濃縮→冷凍干燥→石斛多糖。

（2） 超聲輔助提取法。80目石斛粉→加水溶解→超聲提取→抽濾去除不溶雜質(zhì)→真空濃縮→醇沉多糖→離心→沉淀復(fù)溶→真空濃縮→冷凍干燥→石斛多糖。

1.4 石斛多糖提取工藝優(yōu)化

（1） 酶解提取法單因素試驗與正交試驗設(shè)計。在提取液pH值6.0，提取溫度60℃的條件下，依次添加果膠酶至終濃度0，300，900，1 500，2 100，2 700 U/L，分析果膠酶濃度對石斛多糖得率的影響。果膠酶終濃度1 500 U/L，提取溫度60℃的條件下，依次改變提取液pH值5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，分析提取液pH值對石斛多糖得率的影響。在果膠酶終濃度1 500 U/L，提取液pH值6.0的條件下，依次改變提取溫度40，50，60，70，80℃，分析提取溫度對石斛多糖得率的影響。依照試驗結(jié)果，利用L9（34）正交試驗方案，進一步研究果膠酶濃度、提取液pH值、提取溫度對石斛多糖得率的影響。

酶解提取法正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 酶解提取法正交試驗因素與水平設(shè)計

（2）超聲輔助提取法單因素試驗與正交試驗設(shè)計。在超聲頻率24 kHz，超聲溫度25℃的條件下，依次改變超聲時間0，5，10，15，20，25 min，分析超聲時間對石斛多糖得率的影響。在超聲頻率24 kHz，超聲時間20 min的條件下，依次改變超聲溫度20，25，30，35，40℃，分析超聲溫度對石斛多糖得率的影響。在超聲時間20 min，超聲溫度25℃的條件下，依次改變超聲頻率16，20，24，28，30 kHz，分析超聲頻率對石斛多糖得率的影響。依照試驗結(jié)果，利用L9（34）正交試驗方案，進一步研究超聲時間、超聲溫度、超聲頻率對石斛多糖得率的影響。

超聲輔助提取法正交試驗因素與水平設(shè)計見表2。

1.5 石斛多糖得率的測定

采用苯酚-硫酸法測定石斛多糖的濃度。

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

表2 超聲輔助提取法正交試驗因素與水平設(shè)計

式中：c——查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得葡萄糖質(zhì)量濃度，g/L；

v——溶劑體積，L；

N——稀釋倍數(shù)；

m——石斛質(zhì)量，g。

1.6 石斛多糖相對分子質(zhì)量的測定

采用高效液相色譜法（HPLC） 測定石斛多糖分子質(zhì)量。色譜條件：GPC色譜柱為OHpak SB-802.5 HQ型；流動相為三蒸水；流速為0.8 mL/min；柱溫為30℃；柱壓為3.0 MPa；采用示差折光檢測器檢測。樣品質(zhì)量濃度10 mg/mL，進樣量20 L，0.45 m濾膜過濾后進樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解提取法單因素試驗

（1）果膠酶濃度對石斛多糖得率的影響。果膠酶濃度對石斛多糖得率的影響見圖1。

精密稱取干燥（60℃）恒質(zhì)量的葡萄糖20 mg，用蒸餾水溶解并稀釋至500 mL，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液 0，400，600，800，1 000，1 200 μL，分別置于試管內(nèi)，加蒸餾水至2.0 mL，再各加6%苯酚試劑1.0 mL，各管迅速滴加濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，立刻搖勻，用可見分光光度計于波長490 nm處測定吸光度[9]。以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=0.045X+0.000 3。

1.5.2 石斛多糖得率的計算公式

圖1 果膠酶濃度對石斛多糖得率的影響

由圖1可知，果膠酶濃度對石斛多糖得率有較大的影響，當(dāng)果膠酶濃度為1 500 U/L時，石斛多糖得率最高為13.94%。這可能是由于石斛植物細胞壁富含果膠，通過果膠酶將細胞壁上的果膠水解，使溶劑進入細胞內(nèi)，加速石斛多糖的溶出[10]。當(dāng)果膠酶濃度增加到一定值時，果膠酶除完成對細胞壁的分解作用外，對石斛多糖的分解作用也加劇，石斛多糖得率反而下降[11]。

（2）提取液pH值對石斛多糖得率的影響。

提取液pH值對石斛多糖得率的影響見圖2。

圖2 提取液pH值對石斛多糖得率的影響

由圖2可知，當(dāng)提取液pH值為6.0時，石斛多糖得率達到最高為14.21%；然后隨著提取液pH值的增大，石斛多糖得率有所下降?？梢娛嗵禽^宜在微酸的環(huán)境下提取，也可能是果膠酶在酸性條件下酶活力較高[12]的原因。

（3）提取溫度對石斛多糖得率的影響。

提取溫度對石斛多糖得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對石斛多糖得率的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，石斛多糖得率先升高再降低。這是由于提取溫度的升高使石斛多糖的溶解度增加，加快了傳質(zhì)過程的速度，較高的溫度對細胞壁的破壞作用較大，有利于石斛多糖的溶出。當(dāng)提取溫度為60℃時，石斛多糖提取得率達到最大值為14.08%。隨著提取溫度的繼續(xù)升高，石斛多糖中存在著的不穩(wěn)定成分結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而產(chǎn)生降解。同時，由于非糖物質(zhì)的溶出，也會造成石斛多糖得率的下降[13]。此外，由于提取溫度升高，還可能導(dǎo)致石斛多糖提取液的黏度增大，不容易分離，從而導(dǎo)致石斛多糖得率的下降[14]。

2.1.2 超聲輔助提取法單因素試驗

（1）超聲時間對石斛多糖得率的影響。

超聲時間對石斛多糖得率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著超聲時間的延長，石斛多糖得率明顯升高。當(dāng)超聲時間達到20 min時，其得率最大為15.45%，這是由于超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)能加速石斛多糖的溶出；然后隨著超聲時間的延長，石斛多糖得率趨于平緩并略有下降。可能是由于超聲時間延長，超聲作用產(chǎn)生的機械剪切力增大，使糖苷鍵斷裂，一定程度上破壞了石斛多糖的結(jié)構(gòu)[15]，導(dǎo)致其得率略有下降。

圖4 超聲時間對石斛多糖得率的影響

（2）超聲溫度對石斛多糖得率的影響。

超聲溫度對石斛多糖得率的影響見圖5。

圖5 超聲溫度對石斛多糖得率的影響

由圖5可知，超聲溫度對石斛多糖得率的影響并不顯著。超聲溫度為25℃時，石斛多糖得率最大為15.55%。隨著超聲溫度的繼續(xù)升高，其得率略有下降。這可能是由于超聲能使細胞內(nèi)產(chǎn)生巨大的能量，細胞內(nèi)溫度高過設(shè)定溫度，加速了多糖的溶出，溫度越高，越多地破壞多糖的結(jié)構(gòu)。

（3）超聲頻率對石斛多糖得率的影響。

超聲頻率對石斛多糖得率的影響見圖6。

圖6 超聲頻率對石斛多糖得率的影響

由圖6可知，隨著超聲頻率的增加，石斛多糖得率先升高后下降。當(dāng)超聲頻率達24 kHz時，石斛多糖得率最高為15.68%；當(dāng)超聲頻率超過24 kHz時，其石斛多糖得率有所下降?？赡苁怯捎诔曨l率過大使石斛多糖發(fā)生降解，還可能是超聲頻率升高產(chǎn)生氣泡導(dǎo)致超聲波相互反射，從而減少了能量傳遞[16]；或者是提取液流動加快，使石斛原料在超聲場停留時間縮短，導(dǎo)致破壁作用減弱，從而使石斛多糖得率有所下降[17]。

2.2 正交試驗

2.2.1 酶解提取法正交試驗結(jié)果

酶解提取法試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，酶解提取法試驗方差分析見表4。

表3 酶解提取法試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 酶解提取法試驗方差分析

由表3～表4可知，3個因素的作用強弱依次為提取液pH值＞果膠酶濃度＞提取溫度。A2B2C2為最佳工藝組合，即提取液pH值為6.0，果膠酶濃度為1 500 U/L，提取溫度為60℃。用上述最優(yōu)工藝條件進行驗證試驗，得到石斛多糖得率為14.89%±0.053%。

2.2.2 超聲輔助提取法正交試驗結(jié)果

超聲輔助提取法試驗設(shè)計及結(jié)果見表5，超聲輔助提取法試驗方差分析見表6。

由表5～表6可知，3個因素的作用強弱依次為超聲頻率＞超聲時間＞超聲溫度。因此，正交試驗確定的最優(yōu)參數(shù)組合為A'2B'2C'2。根據(jù)正交試驗結(jié)果，在超聲頻率24 kHz，超聲時間20 min，超聲溫度 25℃的條件下進行驗證試驗，得到的石斛多糖得率為15.78%±0.072%。

2.3 石斛多糖相對分子質(zhì)量的測定

通過HPLC檢測酶解提取法與超聲輔助提取法提取石斛多糖的分子質(zhì)量分布。

酶解提取法石斛多糖的分子質(zhì)量分布見圖7，超聲輔助提取法石斛多糖的分子質(zhì)量分布見圖8。

通過計算，酶解提取法的多糖組分較少，主要由1種組分組成，分子量在1 000～70 kDa；超聲輔助提取的多糖組分比較多，分子量分布廣泛，為2 000～10 kDa。

表5 超聲輔助提取法試驗設(shè)計及結(jié)果

表6 超聲輔助提取法試驗方差分析

圖7 酶解提取法石斛多糖的分子質(zhì)量分布

圖8 超聲輔助提取法石斛多糖的分子質(zhì)量分布

3 結(jié)論

以鐵皮石斛為原料，探究鐵皮石斛提取多糖的研究過程。確定了最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為提取液pH值6.0，果膠酶濃度1 500 U/L，提取溫度60℃，石斛多糖得率為14.89%±0.053%；超聲輔助提取法的最優(yōu)工藝參數(shù)為超聲頻率24 kHz，超聲時間20 min，超聲溫度25℃，石斛多糖得率為15.78%±0.072%。

酶解法較超聲法的優(yōu)點是提取條件溫和、節(jié)約能源、操作簡單方便，可以省去部分設(shè)備，提取出的多糖分子量較小、易于復(fù)溶、便于人體吸收。而超聲法能最大程度地保持石斛多糖的結(jié)構(gòu)，不引入除原料外的其他物質(zhì)，節(jié)省時間，經(jīng)濟效益較高。這2種方法各有利弊，但都能較大程度地提取鐵皮石斛多糖功能性成分，可以針對不同人群，添加到相關(guān)產(chǎn)品中，深度挖掘其潛在的利用價值。

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Extraction Technology Optimization and Molecular Weight Analysis of Polysaccharide from Dendrobium candidum

HANRan，LI Qing，WANG Ruhua，KONG Yu，LIANG Zenglan，ZHANG Jin，ZHAOHuihui
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

Dendrobium candidum contains high Dendrobium polysaccharides.In this study， fresh Dendrobium candidum is used as raw material and extracted by enzymatic hydrolysis and ultrasonic method.The process conditions of two extraction methods are optimized by single factor test and orthogonal test.The molecular weight of polysaccharides is analysis.The results show that the optimum enzymatic extraction conditions are as follows pH 6.0，pectinase concentration 1 500 U/L，extraction temperature 60 ℃.The optimum parameters of ultrasonic assisted extraction are ultrasonic frequency 24 kHz，ultrasonic time 20 min，ultrasonic temperature 25℃.The results of high performance liquid chromatography show that the molecular weight of polysaccharides by ultrasonic assisted extraction is higher than that by enzymatic extraction.

Dendrobium candidum；polysaccharide；enzymatic hydrolysis；ultrasonic；molecular weight

TS210.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.09.008

1671-9646（2017） 09a-0028-05

2017-07-11

天津科技大學(xué)大學(xué)生實驗室創(chuàng)新基金（1614A208）。

韓 冉（1989— ），女，碩士，實驗師，研究方向為食品分析。