草甘膦農(nóng)藥殘留檢測方法研究進(jìn)展

李燕虹，王飛翔，陳春牡，潘俊坤，王 耀

草甘膦農(nóng)藥殘留檢測方法研究進(jìn)展

李燕虹，王飛翔，陳春牡，潘俊坤，?王 耀

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽 471023）

草甘膦農(nóng)藥因具有低毒、高效的特點(diǎn)，目前已成為全球生產(chǎn)及使用量最大的除草劑之一，但其潛在毒性近年來也引起了人們的廣泛關(guān)注，并且對于草甘膦殘留的檢測研究也備受重視。對草甘膦殘留的檢測方法及研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，主要探討了化學(xué)分析法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、分光光度法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、電化學(xué)方法在草甘膦殘留檢測中的應(yīng)用，為草甘膦殘留檢測深入研究提供參考。

草甘膦；殘留；檢測；研究進(jìn)展

0 引言

草甘膦（Glyphosate） 是目前世界上使用量最大的除草劑之一，廣泛應(yīng)用于控制農(nóng)田或非耕作用地中的一年生或多年生雜草生長[1]。草甘膦是一種生物蛋白質(zhì)合成的抑制劑，通過抑制5-烯醇丙酮莽草酸3-磷酸鹽合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPs） 的活性，使蛋白質(zhì)合成受阻，致使植物死亡[2]。草甘膦及其代謝物易吸附于土壤中，經(jīng)食物鏈富集作用危害人體健康，經(jīng)一系列研究證實(shí)，草甘膦具有致畸作用[3]，對生物的遺傳、發(fā)育和生殖[4-5]都有一定的毒副作用。由于環(huán)境中存在的草甘膦殘留對人體健康具有潛在危害，近年來針對草甘膦殘留的檢測研究備受重視。對目前草甘膦殘留的檢測方法和研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期對檢測方法的深入研究提供參考，為加強(qiáng)草甘膦殘留監(jiān)控、降低草甘膦殘留風(fēng)險(xiǎn)提供支撐。

1 草甘膦殘留概述

1.1 草甘膦的化學(xué)性質(zhì)

1.2 草甘膦的特性及作用機(jī)制

草甘膦是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，可被植株上所有綠色部分吸收。向植物噴灑草甘膦農(nóng)藥后，能被植株的莖葉吸收并向下傳導(dǎo)，殺死多年生深根植物深埋地下的根莖；也可以在同一植株的不同分蘗間進(jìn)行傳導(dǎo)，殺死未接觸到藥劑的分蘗或分枝。草甘膦在植物韌皮部和木質(zhì)部的傳導(dǎo)速度受植物種類、發(fā)育階段、土壤的濕度、環(huán)境的相對濕度和溫度等多種因素的影響[6]。草甘膦屬廣譜滅生性除草劑，對幾乎所有的雙子葉雜草、一年生或多年生禾本科植物和灌木等都具有較好的防除作用，能殺死世界上最難根除的多年生深根性雜草，如香附子、假高粱、馬唐、通靈草、油草等，且不易使雜草對其產(chǎn)生抗性。

草甘膦的除草作用是通過抑制莽草酸途徑中的EPSPS活性來實(shí)現(xiàn)的。因EPSPS在芳香氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸） 的生物合成中具有重要的作用，而草甘膦抑制EPSPS的活性使莽草酸途徑堵塞，使蛋白質(zhì)合成受到抑制，從而導(dǎo)致高等植物消耗芳香族氨基酸，致使植物死亡，達(dá)到除草目的[7]。

1.3 草甘膦的危害

草甘膦在很長一段時(shí)間被認(rèn)為是一種較為安全、毒性較低的除草劑，然而毒理學(xué)研究顯示，長期接觸草甘膦會(huì)對人體健康造成一定的影響，尤其是在生殖發(fā)育方面。2015年3月，世界衛(wèi)生組織的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將草甘膦定義為“對人類可能的致癌物”。有研究顯示，孕婦在妊娠期間暴露于含有草甘膦的環(huán)境下，其生出的后代存在包括無腦畸形、小頭畸形及顱骨畸形等的生育缺陷[3]。Mink P J等人[4]從草甘膦早期使用者中隨機(jī)抽取536個(gè)家庭中的1 532名兒童作為樣本，通過電話隨訪進(jìn)行調(diào)查記錄，調(diào)查發(fā)現(xiàn)父母接觸過草甘膦的兒童患多動(dòng)癥風(fēng)險(xiǎn)與父母未接觸草甘膦的兒童相比要高2.6倍。Clegg B S等人[5]發(fā)現(xiàn)雙臍螺在10%的草甘膦有效質(zhì)量分?jǐn)?shù)下暴露4周，可導(dǎo)致其生存率和產(chǎn)卵數(shù)與對照組相比有比較明顯降低，且異常卵的數(shù)量顯著增加。

1.4 草甘膦殘留限量標(biāo)準(zhǔn)

據(jù)了解，當(dāng)天，楚雄供電局安全監(jiān)察部員工孔雷、李輝福、大姚供電局石羊供電所員工文華及駕駛員尹亮正驅(qū)車前往大姚縣石羊鎮(zhèn)岔河二隊(duì)，準(zhǔn)備對10kV石西線大修技改施工現(xiàn)場開展安全監(jiān)督檢查。途徑石羊長園水庫時(shí)，他們注意到水庫邊上圍著一群人，所有人神色慌張，不知所措。直覺告訴孔雷，出事了，他立即將車叫停，三步并作兩步?jīng)_向人群，原來是一輛面包車不慎駛?cè)肓死镩L園水庫。

草甘膦在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的大量使用，導(dǎo)致其在自然環(huán)境中存在較大殘留量，殘留物質(zhì)污染環(huán)境，并通過食物鏈的富集作用轉(zhuǎn)移到人體，威脅人體健康，目前已有多篇報(bào)道表明水源水及食品均有草甘膦的殘留。例如，2015年河南省生活飲用水和水源水中草甘膦污染狀況的初步調(diào)查顯示，在3個(gè)不同地區(qū)采取水源水樣品54份，生活飲用水29份，其中生活飲用水中均未檢出草甘膦殘留，水源水樣品中草甘膦的檢出率為24.07%[8]。我國臺(tái)灣省食藥署2016年燕麥產(chǎn)品抽檢結(jié)果顯示，總計(jì)抽檢的市售36款燕麥片產(chǎn)品中有10款燕麥片檢出草甘膦農(nóng)藥[9]。德國慕尼黑環(huán)境研究所2016年公布的一份實(shí)驗(yàn)室檢測報(bào)告顯示，德國最受歡迎的14種啤酒中被檢測出含有不同程度的農(nóng)藥殘留物草甘膦，這些啤酒中的草甘膦含量介于 0.46～29.74 μg/L[10]。吳曉剛等人[11]和諸力等人[12]利用高效液相色譜法對部分市售茶進(jìn)行檢測，部分樣本也檢出草甘膦殘留。

草甘膦及其代謝產(chǎn)物（AMPA）可在自然界長期持久存在且不易被代謝，可被人群以多種途徑接觸后影響機(jī)體的健康。因此，很多國家和地區(qū)都對草甘膦的使用作出了限制，并將其殘留限量列入相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)中，美國現(xiàn)行 的飲用水標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定草甘膦污染物最高質(zhì)量濃度（Maximumcontaminant level，MCL）為0.7 mg/L[13]。同樣，我國生活飲用水衛(wèi)生國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 5749—2006） 中規(guī)定的草甘膦最大殘留限量也為0.7 mg/L；食品中草甘膦殘留的最大限量則規(guī)定得更為詳細(xì)。

國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2014規(guī)定的各類食品中草甘膦最大殘留限量見表1。

表1 國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2014規(guī)定的各類食品中草甘膦最大殘留限量/mg·kg-1

由這些嚴(yán)格的限量規(guī)定可以看出，目前對于草甘膦殘留的檢測已成為農(nóng)藥殘留檢測中的重要檢測項(xiàng)目，對于其檢測方法的研究和開發(fā)具有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

2 草甘膦殘留檢測方法

2.1 化學(xué)分析法

化學(xué)分析法是根據(jù)特定的反應(yīng)與劑量關(guān)系對待測物質(zhì)進(jìn)行分析，包括質(zhì)量分析及滴定分析等方法[14]，屬于最傳統(tǒng)的一類檢測方法。周潔薇[15]建立了一種電位滴定測定草甘膦的方法，即以汞電極作為指示電極，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液用量測出絡(luò)合物總量，以偶氮胂Ⅱ?yàn)榻j(luò)合指示劑測定雜質(zhì)含量，用差減法計(jì)算草甘膦含量。范淑霞[16]采用亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定的方法對草甘膦進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示該法平行誤差在0.2%～0.5%。董文庚等人[17]建立間接測定草甘膦的褪色分光光度方法，在pH值6.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中草甘膦與微量過量溴發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使羅丹明B褪色，檢測范圍隨著加入溴溶液濃度變化而變化，溴濃度為1.44×10-5mol/L和2.72×10-5mol/L時(shí)，測定范圍分別為0～0.5 mg/L和0.4～0.9 mg/L。采用化學(xué)分析法檢測草甘膦殘留，雖然方法操作簡單、快捷，但檢測范圍較窄、靈敏度低、測定結(jié)果誤差較大。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一種以抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，將該反應(yīng)與酶對底物高效催化作用結(jié)合起來的高靈敏免疫學(xué)檢測方法[18-19]。因其特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高、適用性強(qiáng)、檢測迅速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，在疾病診斷、疫病防控、食品衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)測[20-23]中應(yīng)用廣泛。

Selvia等人[24]以草甘膦-堿性磷酸酶偶聯(lián)物作為酶標(biāo)物質(zhì)建立了一種簡單的競爭ELISA方法，用來測定食品中的草甘膦殘留，該方法檢測限為2 ng/mL。潘熙萍等人[25]采用EDC法將草甘膦分別與BSA和OVA偶聯(lián)制備免疫原（PMG-BSA）和包被原（PMGOVA），通過用合成的免疫原對新西蘭大白兔進(jìn)行免疫采血，制備草甘膦多抗血清，建立了草甘膦間接競爭ELISA檢測方法。Morti M等人[26]建立ELISA方法，對地下水資源中草甘膦殘留進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示檢測范圍為0.05～0.12 μg/L。ELISA雖然已是一類成熟的免疫學(xué)檢測方法，但其在草甘膦殘留檢測中的應(yīng)用仍十分有限。

2.3 分光光度法

用來檢測草甘膦的分光光度法主要有紫外分光光度法和褪色分光光度法。分光光度法操作簡便、分析快速，但容易受到其他離子，尤其是受其最大吸收波長相近物質(zhì)的干擾。吳淑彬等人[27]利用草甘膦在酸性條件下與亞硝酸鈉反應(yīng)生成草甘膦亞硝基衍生物，這種化合物于波長243 nm處有最大吸收峰的特點(diǎn)，根據(jù)所生成的衍生物在一定濃度范圍內(nèi)吸光度含量的線性關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線確定草甘膦含量。

Jan M R等人[28]建立了一種簡便的分光光度法檢測環(huán)境和生物樣品中草甘膦的含量，利用草甘膦與二硫化碳形成二硫代氨基甲酸并隨后在氨存在下與銅形成配合物，于波長435 nm處測定得到的黃色銅二硫代氨基甲酸鹽絡(luò)合物的吸光度，測得草甘膦檢測限與定量限分別為1.1 ng/mL和3.7 ng/mL。汪海萍等人[29]研究并討論了亞硝基衍生化紫外分光光度法用于檢測廢水中草甘膦的實(shí)用性，通過改變加入硫酸量來分析其對亞硝化反應(yīng)的影響，結(jié)果表明應(yīng)根據(jù)樣品的酸堿性來調(diào)整硫酸的用量，該方法的檢測限是0.069 mg/L，檢測上限是50.0 mg/L。李國鵬等人[30]在甘氨酸存在的情況下用紫外分光光度計(jì)法來測定廢水中草甘膦，測定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.10%。

2.4 高效液相色譜法

高效液相色譜是以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)發(fā)展而來的一種具有高分離速率、高分離效率和高檢測靈敏度等特點(diǎn)的柱色譜技術(shù)。不受樣品揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性及相對分子質(zhì)量的限制，流動(dòng)相選擇范圍廣，可與樣品分子發(fā)生選擇性的相互作用，為控制和改善分離條件提供了一個(gè)可變因素，該方法是草甘膦檢測的常用方法之一[31-33]。Ofitserova M等人[34]和Zhang Y等人[35]采用高效液相色譜熒光法檢測大豆中的草甘膦殘留量，結(jié)果均獲得較低檢測限。Wang Shu等人[36]用9-芴基氯仿衍生草甘膦后，采用高效液相色譜熒光法檢測海水中的草甘膦，檢測限為0.60 ng/L。Rodríguez等人[37]以 1,2-萘醌 -4-磺酸作為柱前衍生劑，采用高效液相色譜法測定土壤中草甘膦和氨甲基膦酸的含量，測得草甘膦和氨甲基膦酸的檢測限分別為0.064 mg/kg和0.098 mg/kg。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是高效液相色譜檢測方法的發(fā)展，目前國內(nèi)外在檢測食品及水中草甘膦殘留方面已有應(yīng)用[11，38-40]。Todorovic G R 等人[40]建立了一種用硼酸鈉提取土壤中的草甘膦，經(jīng)SPE步驟凈化提取液，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測草甘膦的方法。Guo H等人[41]采用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜的方法檢測環(huán)境水中草甘膦含量，結(jié)果顯示添加回收率為85%～112%，線性相關(guān)系數(shù)大于0.997。Chamkasem N等人[42]采用液相色譜-質(zhì)譜法直接檢測大豆、玉米中的草甘膦含量，結(jié)果顯示其線性范圍為10～1 000 ng/mL，相關(guān)系數(shù)大于0.995。

2.5 氣相色譜法

氣相色譜法以氣體作為流動(dòng)相，利用混合物中各組分在兩相中的吸附系數(shù)或者分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離，通常用來監(jiān)測分析氣態(tài)物質(zhì)或在一定的溫度下能夠轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)。氣相色譜分離效能高、選擇性高、靈敏度高，但是操作步驟繁瑣、儀器昂貴、對操作人員要求高。王天玉等人[43]采用氣相色譜檢測白茯苓、山藥等中藥材中的草甘膦殘留量，固相萃取后用三氟乙醇（TFE） 和三氟乙酸酐（TFAA）進(jìn)行衍生，經(jīng)氮磷檢測器檢測，檢測限為0.05 mg/kg。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是將氣相色譜的高效分離能力與質(zhì)譜的準(zhǔn)確鑒定能力有效地結(jié)合起來，以達(dá)到提高檢測水平的目的。Saito T等人[44]和Motojyuku M等人[45]都采用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測血清中草甘膦及其代謝物含量。Saito T等人[44]將樣品經(jīng)C-C-18單片旋轉(zhuǎn)柱萃取后檢測，結(jié)果顯示草甘膦及其分解物的檢測限分別為10，5 ng/mL；Motojyuku M等人[45]對經(jīng)固相萃取后的血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示草甘膦及其代謝物在3～100 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。Steinborn A等人[46]建立了一種以三氟乙酸衍生化草甘膦，然后經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜檢測的方法，該方法的檢測限為1 ng/mL。

2.6 電化學(xué)方法

電化學(xué)方法是將生物組分（如酶、抗體等）與電化學(xué)相結(jié)合，制備生物傳感器，檢測特定的化合物。該法具有高度專一、分析速度快、靈敏度高、選擇性高、價(jià)格低廉等優(yōu)勢，多被用于醫(yī)療分析、環(huán)境質(zhì)量控制等方面。

有研究以納米材料和多酚氧化酶修飾的玻碳電極為工作電極，Hg/HgCl為參比電極，鉑絲為對電極建立三電極體系，用于檢測草甘膦殘留量。碳納米材料與多酚氧化酶質(zhì)量比為1∶2修飾工作電極，在pH值為6時(shí)，所得傳感器對草甘膦的檢測限為3.5 μg/L，線性檢測范圍為 5～60 μg/L。采用電化學(xué)沉積法將辣根過氧化物酶修飾金電極表面，依據(jù)加入緩沖液中草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度變化能夠引起底物H2O2濃度變化的原理，建立了一種生物電化學(xué)檢測草甘膦含量的方法，線性范圍為0.25～14.0 ng/L，檢測限為1.70 ng/L。

3 小結(jié)及展望

近年來，有關(guān)草甘膦殘留對人體健康存在威脅的研究報(bào)道越來越多，人們對草甘膦殘留問題的關(guān)注度也越來越高，對草甘膦殘留檢測方法研究更加重視。目前，草甘膦殘留檢測的方法包括化學(xué)分析法、分光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜法等傳統(tǒng)方法，以及酶聯(lián)免疫法、電化學(xué)分析等快速方法。在這些方法中，色譜方法和質(zhì)譜聯(lián)用方法已取得階段性成果，在草甘膦殘留檢測方面應(yīng)用較為普遍，但這些方法前處理復(fù)雜、檢測耗時(shí)、難以進(jìn)行高通量分析，對其推廣應(yīng)用產(chǎn)生了一定限制。與國外相比，我國免疫檢測、電化學(xué)檢測等快速檢測技術(shù)起步較晚，方法還未成熟，仍有較大的發(fā)展空間。

近年來，隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，促進(jìn)了其與傳統(tǒng)檢測方法的融合，發(fā)展出許多簡便省時(shí)、靈敏特異的檢測方法，為農(nóng)藥殘留檢測提供了新思路。因此，目前針對草甘膦殘留的檢測方法如果能夠在利用納米材料或其他識別分子的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，必將創(chuàng)新出更多高通量、高靈敏、強(qiáng)特異的快速檢測方法，為草甘膦的安全檢測與監(jiān)控提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

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Advances in the Detection Methods Research of Glyphosate Residues

LI Yanhong，WANG Feixiang，CHENChunmu，PANJunkun，?WANG Yao
（College of Food and Bioengineering，He'nan University of Science and Technology，Luoyang，He'nan 471023，China）

Because of its low toxicity，high efficiency，glyphosate has become one of the most widely used herbicides in the world.However，its potential toxicity and the study of glyphosate residue detection have attracted much attention in recent years.In this paper，the methods of detecting glyphosate residues in recent years are reviewed，mainly discusses the chemical analysis methods，enzyme linked immunosorbent assay，spectrophotometry，high performance liquid chromatography，high performance liquid chromatography-mass spectrometry，gas chromatography，gas chromatography-mass spectrometry，electrochemical method for residue detection advantages and disadvantages in the application of glyphosate，provide reference for further research on detection of glyphosate.

glyphosate；residue；detection；research advance

TS207.53

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.09.020

1671-9646（2017） 09a-0070-05

2017-05-12

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610464035）；河南科技大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2016064）；河南科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（13480062）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（15A550003）。

李燕虹（1992— ），女，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。

?通訊作者：王 耀（1986— ），男，博士，講師，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。