基于銀納米粒子的熒光增強(qiáng)法測(cè)定依諾沙星

李滿秀*， 王 磊, 杜麗娟, 賀彩虹

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州 034000)

依諾沙星(ENX)是第三代氟喹諾酮類抗生素，具有殺菌作用強(qiáng)、抗菌活性高、吸收迅速完全、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，臨床主要用于對(duì)其敏感的革蘭陰性菌和陽(yáng)性菌引起的感染，如泌尿、腸道、呼吸道、外科等感染性疾病。目前，用于依諾沙星的測(cè)定方法包括分光光度法、伏安法、高效液相色譜法、化學(xué)發(fā)光法和熒光分析法等[1 - 5]?，F(xiàn)有測(cè)定方法有各自的局限，新方法的研究仍具有現(xiàn)實(shí)意義。

銀納米粒子(AgNPs)體積小、比表面積大，具有獨(dú)特的量子尺寸效應(yīng)、良好的抗菌性、生物兼容性及表面易修飾等優(yōu)點(diǎn),因此AgNPs的研究近年來(lái)深受人們的關(guān)注[6 - 9]。迄今尚未見利用AgNPs測(cè)定依諾沙星的方法報(bào)道。本文室溫下制備聚乙烯吡咯烷酮AgNPs溶液，用熒光、紫外光譜等進(jìn)行表征，研究發(fā)現(xiàn)依諾沙星與AgNPs相互作用后,可增強(qiáng)AgNPs溶液的熒光強(qiáng)度，以此建立了測(cè)定依諾沙星的新方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)依諾沙星的定量檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4500型熒光分光光度計(jì)(日本，日立公司)；UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本，島津公司)；pHS-3B型酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；78-2型磁力加熱攪拌器 (江蘇金壇金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠)；HK-2A超級(jí)恒溫水浴箱(南京南大萬(wàn)和科技有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

AgNO3、聚乙烯吡咯烷酮K-30、NaBH4(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，聚乙二醇400、Na2HPO4(天津化學(xué)試劑三廠)，NaH2PO4(天津申泰化學(xué)試劑有限公司)，依諾沙星(東京化成工業(yè)株式會(huì)社)。NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液：由0.2 mol/L Na2HPO4溶液和0.3 mol/L NaH2PO4溶液混合制備，酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH值。所用試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1AgNPs的制備向100 mL燒杯中依次加入48.5 mL水，0.5 mL的0.01 mol/L AgNO3溶液，0.5 mL 4 g/L聚乙烯吡咯烷酮K-30溶液，在25 ℃水浴中攪拌25 min后，再加入0.5 mL 4 g/L NaBH4溶液，繼續(xù)攪拌10 min，可制得1.0×10-4mol/L的聚乙烯吡咯烷酮AgNPs溶液，將其倒入60 mL棕色小滴瓶中，置于冰箱中冷藏保存。

1.2.2紫外吸收光譜的測(cè)定在10 mL比色管中，依次加入2.0 mL的AgNPs溶液，0.3 mL的聚乙二醇和1.0 mL不同濃度的依諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液定容至5 mL，室溫下反應(yīng)20 min后，在280～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定其紫外吸收光譜。

1.2.3熒光光譜的測(cè)定在10 mL比色管中，依次加入2.0 mL的AgNPs溶液，0.3 mL聚乙二醇和1.0 mL不同濃度的依諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液定容至5 mL，室溫下反應(yīng)20 min后，在λex/λem=337/380 nm處測(cè)定其熒光強(qiáng)度(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 AgNPs與依諾沙星作用效果與機(jī)理探討

AgNPs與依諾沙星作用的熒光光譜如圖1所示。以熒光強(qiáng)度的比值(F/F0)對(duì)依諾沙星的濃度進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，發(fā)現(xiàn)依諾沙星濃度在4.0×10-7～1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)與F/F0呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(其中：F為加入依諾沙星后體系的熒光強(qiáng)度；F0不加依諾沙星時(shí)體系的熒光強(qiáng)度)，且F/F0隨依諾沙星濃度的增大而增加，符合Stern-Volmer方程，線性方程為：F/F0=1.0241+0.1576c(μmol/L)，相關(guān)系數(shù)為0.9994。聚乙烯吡咯烷酮AgNPs溶液中加入依諾沙星溶液，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，此現(xiàn)象可能與加入依諾沙星后AgNPs顆粒變小的結(jié)果相關(guān)，在一定濃度依諾沙星存在時(shí)，引起AgNPs聚集，發(fā)生明顯表面鍵合、腐蝕作用，顆粒尺寸減小，表現(xiàn)出明顯量子尺寸效應(yīng)，導(dǎo)致體系熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。

AgNPs與依諾沙星作用的紫外吸收光譜如圖2所示。以AgNPs體系382 nm處吸光度對(duì)依諾沙星濃度進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，發(fā)現(xiàn)依諾沙星濃度在4.0×10-7～1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且吸光度隨依諾沙星濃度的增大而減小，符合Stern-Volmer方程，線性回歸方程為：A=-0.0614c+0.7667，相關(guān)系數(shù)為0.9993。AgNPs溶液中加入依諾沙星后，體系的吸光度明顯降低，其原因可能是：聚乙烯吡咯烷酮作為保護(hù)劑制備AgNPs的過(guò)程中,主要是通過(guò)分子中大量羥基和酰胺基團(tuán)與金屬表面產(chǎn)生化學(xué)吸附包裹于金屬表面,從而實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用，使得AgNPs在水溶液中呈均一的穩(wěn)定分散狀態(tài)。當(dāng)加入依諾沙星溶液后，打破了原本穩(wěn)定的分散狀態(tài)，致使AgNPs產(chǎn)生團(tuán)聚。AgNPs之間的距離變小，其表面等離子體共振吸收發(fā)生變化，382 nm處的吸收明顯降低。

圖1 AgNPs與依諾沙星相互作用的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of AgNPs and enoxacin’s interaction cEMX:1-6:0,0.4,0.8,2.0,4.0,10 μmol/L.

圖2 AgNPs與依諾沙星相互作用的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of AgNPs and enoxacin’s interaction cENX:1-6:0,0.4,0.8,2.0,4.0,10 μmol/L.

圖3 pH對(duì)AgNPs體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of pH on the fluorescence intensity of AgNPs

2.2 pH值的影響

按照實(shí)驗(yàn)方法，選擇pH分別為5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，聚乙烯吡咯烷酮AgNPs溶液與依諾沙星作用最強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)選擇體系的pH=7.4。

2.3 聚乙二醇用量的影響

按照實(shí)驗(yàn)方法，探討了聚乙二醇用量對(duì)體系的影響。分別在體系中加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL聚乙二醇，測(cè)定AgNPs溶液的熒光強(qiáng)度，測(cè)定值為159、164、182、161、156，表明聚乙二醇用量為0.3 mL時(shí)效果最佳。

2.4 AgNPs用量的影響

AgNPs溶液加入量直接影響依諾沙星檢測(cè)的靈敏度和線性范圍，實(shí)驗(yàn)探討了不同AgNPs溶液加入量對(duì)依諾沙星檢測(cè)效果的影響。分別加入0.5～2.5 mL AgNPs溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著AgNPs溶液用量增加，熒光強(qiáng)度逐漸增大，2.0 mL時(shí)熒光強(qiáng)度最大。實(shí)驗(yàn)選擇AgNPs溶液用量為2.0 mL。

2.5 反應(yīng)時(shí)間及溫度影響

按照實(shí)驗(yàn)方法，分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60、90、120 min 后進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，在20 min后聚乙烯吡咯烷酮AgNPs溶液與依諾沙星作用穩(wěn)定，體系的熒光強(qiáng)度基本不變，實(shí)驗(yàn)選擇20 min后進(jìn)行測(cè)定。按照實(shí)驗(yàn)方法，分別在15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃時(shí)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明隨著反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度不斷下降。但在15～25 ℃之間，熒光強(qiáng)度變化較小，實(shí)驗(yàn)選擇常溫下操作。

2.6 干擾試驗(yàn)

2.7 工作曲線、檢出限及精密度

依諾沙星濃度在1.0×10-7～1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)與體系F/F0呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為：F/F0=1.1131+0.0942c(μmol/L)，相關(guān)系數(shù)為0.9956，該方法的檢出限為8.0×10-8mol/L(檢出限按3δ/k來(lái)計(jì)算;δ為連續(xù)測(cè)定10個(gè)空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為線性方程的斜率)。對(duì)10份1.0×10-6mol/L依諾沙星溶液測(cè)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.4%。

2.8 樣品測(cè)定

稱取1.0 g依諾沙星膠囊，用乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶中備用。取口服依諾沙星片200 mg 的健康受試者2 h后的尿樣,經(jīng)3 800 r/min離心10 min 后,準(zhǔn)確移取10 mL于50 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度備用。

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法分別測(cè)定依諾沙星膠囊和尿樣中依諾沙星的含量。分別取處理好的樣品溶液平行測(cè)定5組并求平均值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中依諾沙星含量，然后加入三種不同濃度的的依諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率。結(jié)果如表1所示。膠囊樣品根據(jù)其測(cè)定濃度計(jì)算出膠囊中依諾沙星為189 毫克/粒，與標(biāo)示值(200 毫克/粒)一致。

表1 樣品分析結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

研究了依諾沙星與銀納米粒子的相互作用,初步探討了其作用機(jī)理,建立了測(cè)定依諾沙星的新方法。方法用于藥品和尿樣中依諾沙星含量測(cè)定,結(jié)果令人滿意。該方法儀器要求簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便快速,靈敏度高,可為藥品質(zhì)量檢測(cè)及銀納米粒子的應(yīng)用提供有益的參考。