大鯢泛素結(jié)合酶玞gsUBE2L3基因克隆及其在免疫應(yīng)答中的表達(dá)分析

劉榴　石君玲　尤修玲

摘要[目的] 研究泛素結(jié)合酶UBE2L3基因在大鯢免疫應(yīng)答過程中的作用。 [方法] 克隆大鯢泛素結(jié)合酶基因（cgsUBE2L3），進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，并通過qRT-PCR對其組織分布及免疫刺激下的表達(dá)譜進(jìn)行分析。 [結(jié)果] 成功克隆了cgsUBE2L3基因，該基因全長包含一個462 bp的開放閱讀框，編碼154個氨基酸，預(yù)計(jì)蛋白分子量為21.2 ku；cgsUBE2L3氨基酸序列保守性很高，與非洲爪蟾的同源性高達(dá)97.4%；此外，qRT-PCR結(jié)果顯示，cgsUBE2L3基因在大鯢組織中廣泛分布，且被LPS感染的大鯢多個免疫組織中cgsUBE2L3的mRNA水平均發(fā)生了明顯變化。 [結(jié)論] cgsUBE2L3基因具有高度保守的結(jié)構(gòu)特征，其組織分布具有特異性且參與大鯢抵抗LPS刺激的免疫應(yīng)答。

關(guān)鍵詞大鯢；UBE2L3；序列分析；免疫應(yīng)答

中圖分類號S966.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）22-0093-05

Abstract[Objective] To study the role of ubiquitinconjugating enzyme cgsUBE2L3 gene during the immune response in Chinese giant salamander （Andrias davidianus）. [Method] To clone ubiquitinconjugating enzyme gene from Chinese giant salamander （cgsUBE2L3） and analyzed its amino acids by bioinformatics software， the tissue distribution and expression profile with the stimulation of lipopolysaccharide （LPS） were detected by qRTPCR. [Result] Successfully， we cloned cgsUBE2L3 gene. The fulllength cDNA of cgsUBE2L3 contained an open reading frame of 462 bp， encoding a protein of 154 amino acids with a putative weight of 21.2 ku. The cgsUBE2L3 had a highly conserved amino acid sequence and shared the highest identity of 97.4% with African clawed frog. Quantitative real time PCR results showed that the cgsUBE2L3 gene was widely distributed in the Chinese giant salamander tissues and the mRNA levels of cgsUBE2L3 were significantly changed in the immuneassociated tissues of LPSinfected Chinese giant salamander. [Conclusion] The cgsUBE2L3 gene has highly conserved structural feature and tissuespecific of mRNA expression. Moreover， it participates in the immune response of Chinese giant salamander to resist LPS stimulation.

Key wordsChinese giant salamander；UBE2L3；Sequence analysis；Immune response

泛素（Ubiquitin，Ub）是一種由76個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)，因在真核生物中廣泛存在而得名，它的主要作用是對需要分解的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，使其能夠被26S蛋白酶體降解[1]。通過泛素化修飾靶蛋白，降解異?；蛘甙胨テ诙痰牡鞍祝钦婧松矬w蛋白降解的主要途徑，對維持真核生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有重要作用。此外，泛素化還參與調(diào)控多種細(xì)胞的生理過程，包括細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)等[2-5]。泛素化過程至少涉及3種酶的參與：泛素激活酶（UbiquitinActivating Enzyme，E1）、泛素結(jié)合酶（UbiquitinConjugating Enzyme，E2）和泛素連接酶（UbiquitinProtein Ligase，E3）。E1利用ATP提供的能量將Ub活化，通過轉(zhuǎn)硫醇作用將活化的Ub傳送到E2的半胱氨酸殘基活化位點(diǎn)，最后E3與E2-Ub復(fù)合體結(jié)合對靶蛋白進(jìn)行泛素修飾，泛素化的蛋白隨后被26S蛋白酶體降解。其中，E2是泛素化中間環(huán)節(jié)的酶，主要參與轉(zhuǎn)硫醇作用和氨解作用，在整個泛素過程是十分重要的。

E2家族成員大多包含一個催化域（Ubiquitin-Conjugating enzyme，Catalytic domain，UBC），約由150個氨基酸組成，同時還有一個簡單的活性部位，可直接接觸靶蛋白發(fā)揮修飾作用，此過程不需要E1或E3的參與[6-7]。UBC由4個α螺旋和4個反向平行的β折疊組成，結(jié)構(gòu)十分緊湊且高度保守。盡管大多數(shù)E2只含有一個結(jié)構(gòu)功能域UBC，但是許多在N或C端都有用來實(shí)現(xiàn)特殊功能的相應(yīng)的擴(kuò)展結(jié)構(gòu)，用于調(diào)節(jié)其他酶的活性[8-9]。泛素結(jié)合酶E2L3（UBE2L3，也稱E2-F1，L-UBC和UBCH7等）是E2泛素結(jié)合酶家族成員，在體外參與p53、c-Fos和NF-κB前體蛋白p105的泛素化[10]。目前，關(guān)于UBE2L3基因的研究主要集中在人和植物中，在其他物種中的研究少見報(bào)道。

大鯢（Andrias davidianus），俗稱“娃娃魚”，屬于兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，是我國特有的大型珍稀兩棲類動物，與蚓螈、蛙并稱為現(xiàn)存的三大主要兩棲類動物。大鯢起源于泥盆紀(jì)時期，由水生魚類演變而成[11]，其心臟構(gòu)造特殊，已出現(xiàn)了一些爬行類的特征，因此在研究物種起源和基因家族進(jìn)化上具有極高的科研價(jià)值[12-13]。此外，大鯢肉質(zhì)鮮美，富含多種人體必需的氨基酸及微量元素，被譽(yù)為水中“活人參”，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。然而，隨著棲息地的減少、傳染病[14]和環(huán)境污染等一系列因素的影響，大鯢一度瀕臨滅絕，因此被列為國家二級保護(hù)動物。為保護(hù)大鯢得以生存和繁衍，人們研究的首要任務(wù)是提高大鯢的種群數(shù)量，為此應(yīng)著眼于野生大鯢保護(hù)工作的加強(qiáng)和人工養(yǎng)殖技術(shù)的推廣，但在這2個過程中勢必面臨著疾病防治的問題。對大鯢免疫系統(tǒng)進(jìn)行研究不僅有助于了解進(jìn)化免疫學(xué)的信息，還能為大鯢人工養(yǎng)殖過程中的疾病防治提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)試劑

RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen，德國），SMART cDNA library construction kit（Clontech，美國），DH10B Competent cell（Tiangen，北京），Vitagene 96-easy plasmid Miniprep kit（Vitagene，意大利），THERMO script OneStep qRT-PCR Kit（Thermo Scientific，美國），LPS（Sigma，美國），其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2大鯢與免疫刺激

子二代大鯢，體重（250±25）g，購自浙江省溫州市樂清市高塘大鯢養(yǎng)殖基地，飼養(yǎng)在干凈的水槽中。每3尾大鯢為1組，用200 μL 0.5 mg/mL的LPS通過腹腔注射刺激大鯢，LPS溶解在PBS溶液中。分別刺激0、12、24、48、72 h后，從預(yù)先麻醉的大鯢中分離脾臟、肝臟、腎臟、心臟、小腸、肌肉、脂肪、骨和腦組織，立即凍存在液氮中，用于組織RNA提取和實(shí)時定量PCR（qRT-PCR）檢測。以200 μL PBS處理大鯢組作為陰性對照。

1.3RNA抽提，cDNA文庫構(gòu)建及EST測序

根據(jù)說明書，使用RNeasy Plus Mini Kit提取大鯢脾臟總RNA，通過分析28S和18S及測量的OD260/OD280比值鑒定提取RNA的質(zhì)量。隨后使用SMART cDNA library construction kit構(gòu)建大鯢脾臟全長cDNA文庫。將所有長度大于500 bp的cDNA片段連接至pDNR-LIB載體，轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)挑取不同的cDNA陽性克隆菌，直接接種到含有1 mL YT培養(yǎng)基的96孔板中，37 ℃孵育過夜。利用Vitagene 96-easy plasmid Miniprep kit抽提菌液中的DNA，送往上海生工生物公司進(jìn)行測序。使用T7引物，從5′端測序，篩選cgsUBE2L3基因cDNA序列。

1.4生物信息學(xué)分析

通過BioxM 2.6軟件分析cgsUBE2L3基因cDNA序列；其功能結(jié)構(gòu)域通過SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)行在線分析；cgsUBE2L3

氨基酸同源性比對及保守結(jié)構(gòu)的分析通過BioEdit軟件完成；利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線預(yù)測cgsUBE2L3蛋白空間結(jié)構(gòu)模型；使用MEGA6.0軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5qRT-PCR 分析

根據(jù)RNeasy Plus Mini Kit提取大鯢脾臟、肝臟和肌肉等組織總RNA，用RNase-free DNase I 進(jìn)行處理。取同等質(zhì)量的各組織總RNA通過THERMO script OneStep qRT-PCR Kit進(jìn)行qRT-PCR檢測。反應(yīng)體系25 μL，以β-actin為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，每個反應(yīng)重復(fù)3次。程序如下：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，38個循環(huán)。在每個PCR反應(yīng)結(jié)束后分析擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線，確保只有一個PCR產(chǎn)物被擴(kuò)增并檢測。通過循環(huán)閾值比較法（Δ ct）分析cgsUBE2L3基因的表達(dá)水平。試驗(yàn)過程涉及到的引物信息見表1。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 6.0軟件通過單因素變量比較法進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1cgsUBE2L3基因cDNA序列及功能域分析

cgsUBE2L3基因全長包含一個462 bp的開放閱讀框，編碼154個氨基酸（圖1），預(yù)計(jì)蛋白分子量為21.2 ku，等電點(diǎn)為9.36。SMART結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示（圖2），cgsUBE2L3蛋白含有一個E2家族共有的、完整的泛素結(jié)合酶結(jié)構(gòu)域（UBC），該結(jié)構(gòu)域由145個氨基酸組成，是cgsUBE2L3的主要功能結(jié)構(gòu)。

2.2cgsUBE2L3氨基酸序列分析

通過BioEdit軟件將cgsUBE2L3氨基酸序列與其他已知物種的UBE2L3進(jìn)行兩兩比對，結(jié)果如表2所示。cgsUBE2L3與非洲爪蟾的UBE2L3氨基酸序列同源性高達(dá)97.4%，與雞的同源性次之，為96.7%，與綠海龜?shù)耐葱宰畹?，?8.9%，說明UBE2L3氨基酸在物種進(jìn)化過程中是非常保守的。

UBE2L3氨基酸多序列比對結(jié)果（圖3）同樣能夠說明，UBE2L3氨基酸在進(jìn)化上是高度保守的，并且含有一個保守的半胱氨酸活性位點(diǎn)（C86，用豎框表示），負(fù)責(zé)結(jié)合活化的泛素分子。

基于序列保守性的前提，模擬了cgsUBE2L3的三維結(jié)構(gòu)模型（圖4）。結(jié)果顯示，cgsUBE2L3蛋白主要由4個α螺旋和4個反向平行的β折疊組成，與數(shù)據(jù)庫中已有的UBE2L3結(jié)構(gòu)是一致的。

2.3系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了研究cgsUBE2L3氨基酸的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建了N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹（Bootstrap：1 000），結(jié)果顯示（圖5），cgsUBE2L3的氨基酸序列在魚類（大西洋鮭魚）和蛙類（非洲爪蟾）之間，與兩棲類歸為一簇，符合大鯢物種在進(jìn)化上的規(guī)律。

2.4cgsUBE2L3組織分布及免疫刺激應(yīng)答分析

通過qRT-PCR檢測cgsUBE2L3基因在大鯢各個組織中的表達(dá)分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cgsUBE2L3在大鯢組織中廣泛存在，且相對表達(dá)水平較高（圖6）。用LPS刺激一定時間后，檢測被感染的大鯢組織中cgsUBE2L3的mRNA表達(dá)變化，結(jié)果顯示，在LPS感染48 h后，大鯢腎臟、心臟、脾臟、小腸及骨中cgsUBE2L3的mRNA表達(dá)均發(fā)生明顯上調(diào)，而肌肉和脂肪組織中的表達(dá)幾乎無變化（圖7）。

3結(jié)論與討論

通過分子生物學(xué)手段，從構(gòu)建的大鯢脾臟cDNA文庫中鑒定了大鯢泛素結(jié)合酶基因（cgsUBE2L3），該基因cDNA序列全長包含一個462 bp的開放閱讀框，可編碼154個氨基

酸。與已知物種的UBE2L3氨基酸序列進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)cgsUBE2L3氨基酸與非洲爪蟾的UBE2L3同源性最高，達(dá)974%，與雞的同源性次之（96.7%），之后是爬行類的揚(yáng)子鱷與松獅蜥，兩者均為96.1%。雖然大鯢是遠(yuǎn)古水生魚類演化而來的兩棲綱物種，但是由于大鯢心臟構(gòu)造特殊，已經(jīng)出現(xiàn)了一些爬行類的特征，因此某些基因在進(jìn)化上與爬行類的較為接近。氨基酸多序列對比及功能域分析結(jié)果顯示，UBE2L3在物種進(jìn)化過程中是高度保守的，cgsUBE2L3與其他物種的UBE2L3一樣，都具有E2家族共有的催化功能域（UBC）及保守的半胱氨酸活性位點(diǎn)（C86），通過與泛素分子及E1、E3相互作用，參與泛素化降解過程，維持細(xì)胞正常的生命活動。cgsUBE2L3的空間結(jié)構(gòu)較為簡單，主要包括4個α螺旋和4個β折疊，C端及N端均沒有拓展氨基酸，或許在一定程度上使泛素結(jié)合酶的活性更加專業(yè)。根據(jù)已有UBE2L3氨基酸序列構(gòu)建的N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，大鯢與非洲爪蟾的親緣關(guān)系最近，其次為揚(yáng)子鱷、松獅蜥和美國牛蛙，而與魚類的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，大鯢UBE2L3氨基酸此外，在mRNA水平研究了cgsUBE2L3的組織分布及其在細(xì)菌感染的大鯢組織中表達(dá)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cgsUBE2L3在大鯢組織中廣泛分布，且表達(dá)量相對較高。當(dāng)受到LPS刺激時，24 h內(nèi)，大鯢各組織中cgsUBE2L3的mRNA表達(dá)量無明顯變化，48 h后，脾臟、頭腎、小腸和骨等免疫器官中cgsUBE2L3的表達(dá)量明顯升高，而脂肪和肌肉等非免疫器官中的cgsUBE2L3的表達(dá)幾乎未變，預(yù)示cgsUBE2L3與免疫相關(guān)，參與了大鯢抵抗LPS產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。

泛素蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)一系列生命進(jìn)程的調(diào)節(jié)方式，與疾病密切相連，該文以進(jìn)化上具有代表性的兩棲類大鯢為研究對象，鑒定了一種大鯢泛素結(jié)合酶基因——cgsUBE2L3，該基因在進(jìn)化上具有高度的保守性，且參與大鯢抵抗LPS刺激產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，為進(jìn)一步研究大鯢免疫系統(tǒng)與疾病防治提供了理論支持。

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