RNAi可作為管理西方玉米根蟲(WCR)的工具

葉 萱 編譯

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RNAi可作為管理西方玉米根蟲(WCR)的工具

葉 萱 編譯

(上海農(nóng)藥研究所，上海 200032)

西方玉米根蟲(WCR)適應(yīng)性很強，是侵入性害蟲，美國玉米種植帶最重要的害蟲。目前，此害蟲的防治費用及所造成的玉米損失每年達十幾億美元。WCR是一化性昆蟲，以卵在土壤中越冬，在晚春到早夏期間孵化為幼蟲，幼蟲取食禾本科植物根部，特別是玉米。被危害的玉米植株倒伏，產(chǎn)量下降。以前，主要采用玉米與非寄主作物(如大豆)輪作以及應(yīng)用殺蟲劑防治，但由于抗性的發(fā)展，此害蟲的防治遇到了挑戰(zhàn)。已報道的抗性范例中，抗性的產(chǎn)生往往與大面積應(yīng)用一種防治技術(shù)有關(guān)，化學(xué)農(nóng)藥、作物輪作以及最近的轉(zhuǎn)基因玉米都是如此。因此，增加根蟲管理方法的選擇對未來技術(shù)的持續(xù)發(fā)展很重要。依靠單個方法進行管理不具有持續(xù)性，增加防治方法的多樣性很重要，包括轉(zhuǎn)基因植物、化學(xué)殺蟲劑、生物方法和栽培措施，這就需要開發(fā)對環(huán)境安全的新穎有效的防治方法。

自2003年首個抗玉米根蟲的植物被開發(fā)后，商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因抗玉米根蟲作物都是轉(zhuǎn)基因作物，目前登記的只有4個殺蟲蛋白。已報道至少在其中2個蛋白(Cry3Bb1和mCry3A)間存在交互抗性，即田間害蟲對一個蛋白產(chǎn)生抗性，對另一蛋白也具有抗性。據(jù)報道至少1個田間抗Cry3Bb1害蟲品系具有非隱性遺傳，缺少適合度代價的特性，預(yù)計這有利于田間抗性的發(fā)展和維持。在Cry34Ab1/Cry35Ab1 (Cry34/35)雙重殺蟲蛋白和Cry3蛋白間沒有交互抗性，故Cry34Ab1/Cry35Ab1(Cry34/35)被單獨利用或與Cry3蛋白基因疊加開發(fā)轉(zhuǎn)基因作物。所以，選擇壓增加是可能的，特別是在田間Cry3抗性發(fā)生的情況下。當(dāng)前田間對根蟲活性的狀況表明開發(fā)防治這個重要經(jīng)濟害蟲的新作用方式很重要。

管理根蟲的最新方法之一為RNA干擾或RNAi。RNAi是在研究秀麗隱桿線蟲()反義RNA(antisense RNA)的過程中發(fā)現(xiàn)的，是指由短dsRNA介導(dǎo)的同源RNA降解過程。研究已表明RNAi途徑與病毒防御機制或可移動遺傳因子的整合有關(guān)，RNAi也能有效調(diào)節(jié)幾乎所有真核生物的基因表達，包括植物和昆蟲。RNAi能抑制(knockdown)同源基因靶標，被廣泛用于基因功能研究，已成為大眾化的功能基因組學(xué)和遺傳學(xué)工具。學(xué)術(shù)界和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)都應(yīng)用RNAi進行研發(fā)，已認識到其作為害蟲管理產(chǎn)品的潛力。報道RNAi對數(shù)種昆蟲有效，但防治結(jié)果因昆蟲種類的不同變化很大。表達雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因RNAi植物防治WCR的研究結(jié)果，預(yù)示不久商業(yè)化轉(zhuǎn)基因RNAi玉米產(chǎn)品將有可能彌補玉米技術(shù)管理WCR的不足。本文介紹了RNAi防治WCR的機制以及使用此技術(shù)進行WCR管理。

1 RNAi性狀

1.1 致死性RNAi

與其他重要農(nóng)業(yè)害蟲如食葉鱗翅目昆蟲不同，WCR的幼蟲和成蟲在攝入dsRNA后，有很強的RNAi反應(yīng)。根據(jù)此特性，可利用人工飼料飼喂試驗高通量測定以必須基因為靶標的dsRNA分子。在2007年，Baum等人研究了WCR幼蟲的290個基因，確定了許多致死性和抑制生長的基因靶標。在其研究中，最有效的RNAi基因靶標之一為V-ATPase (vacuolar ATPase subunit A)；幼蟲暴露于V-ATPase-A dsRNA后，其體內(nèi)相應(yīng)的內(nèi)源性mRNA被快速抑制，幼蟲死亡和/或生長受到抑制。重要的是，WCR幼蟲取食表達dsRNA的玉米，此dsRNA以V-ATPase基因為靶標，可保護玉米根不受危害。這首次報道了RNAi(in planta RNAi)可能具有管理害蟲的潛力。進一步研究表明WCR轉(zhuǎn)運必需內(nèi)吞體分選復(fù)合物(ESCRT-III)(Endosomal Sorting Complex Requiredfor Transport-III)(果蠅體內(nèi)為Vps32或shrub)的液泡蛋白分選基因WCR Snf7也是RNAi的作用靶標，表明RNAi具有防治WCR的價值。

對WCR來說，致死性RNAi主要取決于靶標基因的選擇。由于RNAi在WCR體內(nèi)具有系統(tǒng)性分布特性，所以靶標基因的選擇不必像Cry蛋白一樣限定在中腸上皮細胞，而應(yīng)考慮有關(guān)靶標敏感性和dsRNA設(shè)計的因素。dsRNA靶標序列在靶標昆蟲種內(nèi)和種間高度保守，這也很重要，但在分類群間(broad taxonomic groups)不保守。顧名思義，致死性RNAi靶標應(yīng)該是必須基因(如管家基因)。必須基因是昆蟲生命周期和取食暴露期間必須的。然而，也要考慮重要的生物過程、平行途徑或同源基因可能代替靶標基因的功能，這也很重要。其他相關(guān)因素可能包括轉(zhuǎn)錄表達水平、基因的劑量敏感性和蛋白的周轉(zhuǎn)率。蛋白質(zhì)的半衰期短，其消耗的就快，相對應(yīng)的顯型出現(xiàn)得快。遺憾的是有關(guān)蛋白質(zhì)半衰期的知識很少。WCR體內(nèi)的所有同源物或轉(zhuǎn)錄剪切異構(gòu)體等其他參數(shù)難以測定，也沒有相關(guān)基因組的報道。所以試驗篩選RNAi候選基因仍然是確定WCR體內(nèi)致死性RNAi靶標的最好方法。

也能應(yīng)用其他昆蟲和昆蟲細胞系的全基因組測試方法確定WCR體內(nèi)潛在的RNAi靶標。例如，Ulrich等人通過對赤擬谷盜()幼蟲和蛹注射dsRNA，確定dsRNA可作用于赤擬谷盜體內(nèi)100個靶標，對此蟲的致死率可達90%以上。在此注射研究中，他們也測試了Baum等人描述的5個活性最好的WCR靶標的赤擬谷盜同源物。赤擬谷盜同源基因也有活性，但其活性沒有赤擬谷盜RNAi靶標的活性高。這表明利用其他昆蟲的RNAi靶標能增加成功的可能性，但RNAi靶標的總防效可能因昆蟲不同而不同。

在不考慮靶標基因的情況下，WCR體內(nèi)RNAi生測結(jié)果主要取決于生測試驗的設(shè)計。dsRNA片段的長度、靶標基因的劑量敏感性和生測持續(xù)的時間等條件影響RNAi生測的結(jié)果。Bolognesi等人描述了12 d的生測試驗，Baum等人指出7 d的生測試驗沒有取得任何結(jié)果。對于Snf7，Bolognesi等人指出在5 d的生測試驗中有較大的生長抑制活性，這可能是在較短的觀察時間內(nèi)(少于12 d)，RNAi作用靶標的數(shù)量少，但可確定效果好或作用快的dsRNA。測定死亡率以外的參數(shù)，如LC50、LT50或GI50(對生長量的抑制作用達到50%時的濃度)有利于確定潛在的靶標序列和區(qū)分多個有效的dsRNA標靶。

1.2 adult RNAi和parental RNAi

Rangasamy和Siegfrie首次研究報道了RNAi對WCR成蟲的致死性影響。他們發(fā)現(xiàn)用含有dsRNA的人工飼料飼喂WCR成蟲，V-ATPase A的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)的表達水平降低了，成蟲在處理14 d內(nèi)死亡。成蟲生測可作為替代性篩選方法用于確定致死性RNAi的靶標。WCR成蟲對dsRNA的敏感性使跨代防治具有可能性。此作用也叫作parental RNAi(pRNAi)，已在多種昆蟲中發(fā)現(xiàn)。pRNAi的前提是dsRNA用于成蟲，在后代看到效果，因此，pRNAi用于昆蟲主要是為了開發(fā)研究，故pRNAi可能會給WCR提供額外的管理策略。

首次報道WCR pRNAi的研究確定了發(fā)育基因和為RNAi的靶標，在實驗室條件下RNAi能降低WCR的產(chǎn)卵力。雖然和等基因靶標不會短期內(nèi)引起WCR成蟲的死亡，但不能排除pRNAi基因靶標具有致死效應(yīng)，可以設(shè)想其對一些昆蟲有致命性，可致存活昆蟲不育。pRNAi技術(shù)也可與致死性RNAi進行多基因疊加防治幼蟲，或與其他控制方法(例如殺蟲蛋白)聯(lián)用。此外，pRNAi可用于治理化學(xué)殺蟲劑或殺蟲蛋白的抗性。pRNAi作用的詳細特性，如有效植物劑量、最少暴露時間、反應(yīng)開始時間、取食后反應(yīng)持續(xù)時間，將決定每個靶標基因用于pRNAi的可能性。

2 RNAi機制

2.1 潛在的吸收機制

dsRNA被WCR取食后具有強的活性，這表明dsRNA在昆蟲的消化系統(tǒng)內(nèi)不會降解。WCR口服的RNAi反應(yīng)具有以下2個主要機制：⑴dsRNA最早是在中腸被吸收；⑵RNAi信號的系統(tǒng)性傳播。系統(tǒng)性RNAi信號可能是由完整的dsRNA，被剪切為siRNA的dsRNA或其他RNAs引發(fā)。第3種成分可能不被中腸吸收，注射的dsRNA誘導(dǎo)WCR體內(nèi)發(fā)生RNAi時啟動細胞對其的吸收。從理論上來說，WCR體內(nèi)RNAi反應(yīng)的這3個成分可能被相同或不同機制介導(dǎo)。

秀麗隱桿線蟲在體內(nèi)SID-1(systemic RNA interference-deficient proteins 1)和SID-2共同作用下從環(huán)境中吸收dsRNA。而只有SID-1參與RNAi在細胞間的擴展。秀麗隱桿線蟲SID-1在果蠅S2細胞中的表達能使各種大小的dsRNA被動吸收，這表明SID-1為dsRNA-門控通道。SID-2主要位于腸內(nèi)，腸細胞從腸腔吸收50 bp或更長的dsRNA需要SID-2。有趣的是，依賴于SID-2的dsRNA的運輸發(fā)生在酸性條件下，可能依賴于內(nèi)吞作用。秀麗隱桿線蟲的另一SID蛋白(SID-5)在RNAi中的功能是從內(nèi)含體釋放dsRNA，這進一步證實了內(nèi)吞作用存在于dsRNA的吸收過程中。

在昆蟲體內(nèi)，已確定存在SID或類SID(SIL)蛋白，但仍不清楚是否在所有昆蟲體內(nèi)SID/SIL同源物都參與dsRNA的吸收。擬谷盜屬和WCR的SIL基因與SID-1相似，然而，在昆蟲體內(nèi)還沒有發(fā)現(xiàn)SID-2同源物。最近有關(guān)WCR的類SID的和基因研究表明，在sil基因被抑制后口服RNAi反應(yīng)中等而不強。這表明SIL蛋白不是唯一的dsRNA吸收調(diào)節(jié)物。對擬谷盜的研究假定類SID基因的最好替代物可能與秀麗隱桿線蟲的Tag-130有密切的相關(guān)性，而Tag-130與秀麗隱桿線蟲的系統(tǒng)性RNAi反應(yīng)沒有必然的相關(guān)性。作者推斷擬谷盜sil基因更可能是Tag-130直系同源基因，而不是SID直系同源基因。其他報告也提出直翅目和鱗翅目昆蟲的RNAi不依賴于SID或SIL蛋白。雙翅目昆蟲好像完全缺失SID/SIL蛋白。然而這些結(jié)果并沒有表明昆蟲體內(nèi)SID蛋白完全沒有參與RNAi的吸收和系統(tǒng)性擴展的功能。除了要弄清SIL蛋白參與昆蟲系統(tǒng)性RNAi的程度，還需弄明白其是否對昆蟲中腸對dsRNA的吸收、從內(nèi)含體的釋放、RNAi作用從細胞到細胞的擴展有作用(圖1)。

假設(shè)類SID蛋白既不參與WCR RNAi效應(yīng)的系統(tǒng)性擴展，也不單獨負責(zé)dsRNA的吸收，那可能還存在其他的吸收和擴展機制。最近，Cappelle等人比較了馬鈴薯甲蟲(，CPB)體內(nèi)SIL基因(和)和參與內(nèi)吞作用的“組成”[網(wǎng)絡(luò)蛋白重鏈和V-ATPase 16kD亞單位(Vha16)]的相對作用，發(fā)現(xiàn)與網(wǎng)絡(luò)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用相關(guān)的基因?qū)︸R鈴薯甲蟲對dsRNA的吸收具有重要的作用，但是和都對馬鈴薯對dsRNA的口服反應(yīng)具有弱而重要的作用。早前，Xiao等人研究表明擬谷盜的RNAi的產(chǎn)生需要網(wǎng)絡(luò)蛋白依賴性內(nèi)吞作用。他們的研究表明對擬谷盜注射的RNAi可能被網(wǎng)絡(luò)蛋白依賴性內(nèi)吞作用的抑制劑(bafilomycin A1和chlorpromazine)，但不是其他類型內(nèi)吞作用的抑制劑所阻斷。此外，Xiao等人研究發(fā)現(xiàn)擬谷盜數(shù)個與網(wǎng)絡(luò)蛋白依賴性內(nèi)吞作用(網(wǎng)絡(luò)蛋白重鏈、clathrin coat assembly protein ap50、V-ATPase亞單位H、和小GTPase Rab7)有關(guān)的基因被抑制(knockdown)后，RNAi受到抑制(圖1網(wǎng)絡(luò)蛋白介導(dǎo)的dsRNA內(nèi)吞作用)。早期對果蠅S2細胞研究表明內(nèi)吞途徑的“組成”，包括網(wǎng)絡(luò)蛋白重鏈、AP50、Rab7、Arf72A、液泡分選蛋白Vsp41和V-ATPase亞單位(VhaSFD和Vha16-1)以及清道夫受體Sr-Cl和酯。此套基因可能為研究網(wǎng)絡(luò)蛋白依賴性內(nèi)吞作用是否參與WCR吸收dsRNA和RNAi的系統(tǒng)性擴展提供了基礎(chǔ)。內(nèi)吞作用相對于SIL基因在dsRNA吸收和相關(guān)基因互作中的作用可能為WCR提供其他有趣的開發(fā)領(lǐng)域。

圖1 細胞機器利用吸收來處理dsRNA

2.2 途徑基因(pathway genes)

RNAi現(xiàn)象是利用內(nèi)源性細胞機器(cellular machinery)能防御病毒的侵染，能產(chǎn)生內(nèi)源性非編碼調(diào)控RNAs[例如microRNAs(miRNAs)或昆蟲內(nèi)源性發(fā)夾序列產(chǎn)生的內(nèi)源性siRNAs(endo-siRNAs)]開發(fā)而來。昆蟲體內(nèi)RNAi的核心部分相似于其他真核細胞的情況。在活性RNAi分子(siRNAs和miRNAs)的生物產(chǎn)生過程中，其他動物和昆蟲的主要差異之一為在線蟲和脊椎動物體內(nèi)長鏈dsRNAs和miRNA前體經(jīng)RNase Ⅲ——Dicer作用產(chǎn)生功能性21-23 nt RNAs，而昆蟲體內(nèi)Dicer-1特異性識別miRNA前體，Dicer-2特異性識別dsRNA(圖1)。這些結(jié)論最初來自于果蠅，隨后在其他種昆蟲中確定了Dicer-2。早期對擬谷盜體內(nèi)的Dicer-1和Dicer-2的描述中基于其與秀麗隱桿線蟲Dicer的相似性推測擬谷盜Dicer-2的功能可能并不像果蠅的一樣具有特異性。

然而試驗結(jié)果證實擬谷盜體內(nèi)Dicer-2引導(dǎo)dsRNA生成siRNA。在dsRNA介導(dǎo)的RNAi中的另一重要蛋白為RNase Ⅲ——Argonaute 2(AGO2)，是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)的核心部分。siRNA的一條鏈負載在RISC中，引導(dǎo)RISC與靶標mRNA(序列與siRNA互補)結(jié)合，在AGO2蛋白作用下mRNA裂解。

在WCR轉(zhuǎn)錄組中已發(fā)現(xiàn)了Dicer-2和AGO2。在WCR的幼蟲和成蟲體內(nèi)這些基因被抑制后，隨后報告基因就如預(yù)期被抑制，RNAi就被抑制。由此認為Dicer-2和AGO2在WCR體內(nèi)dsRNA介導(dǎo)的RNAi途徑中具有重要的作用。這些報道也說明WCR對RNAi技術(shù)(即Dicer-2和AGO2的下調(diào)或突變可能導(dǎo)致對dsRNA的敏感性低)具有潛在的抗性機制，但Dicer-2、AGO2或其他途徑基因的突變可能具有適合度代價。在目前還沒有昆蟲對RNAi抗性的報道，Dicer-2、AGO2和其他途徑基因的突變是評估RNAi抗性風(fēng)險和相關(guān)適合度代價的一種方法。

除了Dicer-2和AGO2外，對siRNA的生物生成和RNAi重要的蛋白還有dsRNA結(jié)合蛋白R2D2和Loquacious(Loqs-PB、Loqs-PD)。R2D2與Dicer-2相互作用，有助于把外部的siRNA負載于含有AGO2的RISC復(fù)合體中。Loqs主要和內(nèi)部的siRNA有關(guān)，但也有人提出其在外部dsRNA加工過程中起一定的作用。在最近對埃及伊蚊的研究中，研究者報道埃及伊蚊缺少Loqs-PD異構(gòu)體(isoform)，而其是果蠅dsRNA加工中的特異性蛋白。埃及伊蚊Loqs-PA異構(gòu)體好像與dsRNA和miRNA加工中心都相互作用。有關(guān)WCR的R2D2和Loqs還未被研究，其功能和在外部siRNA、內(nèi)生siRNA和miRNA生成中的作用也可能與上不同。在外部siRNA和其他類型RNA間重要非編碼RNA生成機器的以上和其他成分功能的重疊可能決定了對dsRNA抗性的適合度代價，影響抗性產(chǎn)生的可能性。

2.3 小RNA在RNAi啟動中的作用

dsRNA在進入昆蟲細胞后在Dicer-2的作用下裂解為~21－23 bp的siRNA。體外來源的siRNA也被稱為外源siRNA(exo-siRNA)，區(qū)別于內(nèi)生的siRNA(endo-siRNA)。雖然siRNA為RNAi的功能單位，但dsRNA的長度是昆蟲體內(nèi)RNAi應(yīng)答的決定因素。對WCR的研究表明需要最小長度約為60 bp才能獲得致死性RNAi。對WCR的幼蟲和成蟲，經(jīng)飼喂和注射的處理方式，情況都是如此。反之，21 nt siRNA、Dicer底物27 bp dsRNA和短于60 bp的dsRNA不能啟動RNAi。有趣的是27-mer dsRNA被中性雙鏈載體序列擴展到60 bp以上的長度后對WCR有較高的致死率。Bolognesi等人認為短的dsRNA或siRNA不能啟動WCR RNAi是由于其幼蟲的中腸細胞不能吸收所致。這得到對擬谷盜研究的支持，即注射~30 bp dsRNA于擬谷盜合胞體胚胎而不是幼蟲可產(chǎn)生RNAi。然而短dsRNAs和siRNAs的無效性也可能是siRNA不能負載于RISC中或短dsRNA不能被Dicer加工所致。

2.4 系統(tǒng)性擴展

WCR在取食dsRNA后會產(chǎn)生很強的系統(tǒng)性RNAi。這是否是由于WCR體內(nèi)次級siRNA的產(chǎn)生擴大了RNAi所致。對于其他生物，在RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的作用下生成次級siRNA，而初級dsRNA引發(fā)了引物或非引物cRNA合成途徑。所生成的次級siRNA引發(fā)了次級基因沉默，這被稱為可傳遞的RNAi。次級dsRNA的擴增可能重新利用了負載RNA的RISC復(fù)合體，極大地放大了RNAi。在線蟲、植物和真菌體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)可傳遞的RNAi，但在昆蟲中還沒有發(fā)現(xiàn)。對于秀麗隱桿線蟲，一小部分初級siRNA分子是外部應(yīng)用的dsRNA經(jīng)Dicer作用生成，大部分siRNA分子是初級siRNA的反義鏈啟動cRNA合成后，經(jīng)RdRP作用產(chǎn)生。這些次級siRNA的分布呈現(xiàn)清晰的5'→3'反義鏈極性，超出5'端，但沒有超出3'端。植物也產(chǎn)生次級siRNA，主要通過非引物cRNA合成途徑，可以朝兩個方向擴展，超過最初標靶區(qū)的5'和3'的序列邊界，切割上游和下游序列。真菌體內(nèi)可傳遞RNAi的擴展相似于秀麗隱桿線蟲，在靶標mRNA從3'向5'擴展。

對WCR轉(zhuǎn)錄物組研究表明像其他昆蟲一樣，WCR體內(nèi)缺少RdRP。果蠅體內(nèi)也缺少RdRP和可傳遞RNAi。昆蟲基因組中沒有RdRP同源物，而RdRP同源物被認為對次級siRNA的增加重要，這表明昆蟲缺少可傳遞的RNAi途徑。這說明WCR體內(nèi)強的RNAi可能并不是次級siRNAi引導(dǎo)的可傳遞RNAi；或者WCR體內(nèi)存在可傳遞的RNAi，但是依賴于酶而不是RdRP，或可能是由于基因沉默的擴展所致。Elane Fishilevich等飼喂dsRNA后測定WCR體內(nèi)小RNA的序列，發(fā)現(xiàn)與dsRNA同源的靶標序列區(qū)遠端既沒有3'也沒有5'端的siRNA。這些結(jié)果表明WCR體內(nèi)缺少可傳遞的RNAi。因此，很明顯WCR在不生成次級siRNA的情況下對環(huán)境RNA具有強的系統(tǒng)性RNAi，也有可能是WCR產(chǎn)生的次級siRNA不能被標準的測序方法檢測到。因此，有必要進一步研究是否有其他潛在的目前未知的機制介導(dǎo)的次級dsRNA產(chǎn)生途徑，來解釋W(xué)CR體內(nèi)RNAi自我維持特性和活性。

除了WCR消化系統(tǒng)對dsRNA的最初吸收外，dsRNA或siRNA必須在細胞間擴展。Lvashuta等人檢測了馬鈴薯甲蟲和WCR取食長dsRNA后組織中的長dsRNA，結(jié)果為長dsRNA能夠轉(zhuǎn)移到昆蟲的遠端組織。如上所述，人們認為RNAi在昆蟲體內(nèi)的擴展不依賴于dsRNA的擴增以及RNA的復(fù)制機制，因此，取食后未經(jīng)變化的dsRNA或被加工過的dsRNA一定介導(dǎo)RNAi的擴展。雖然研究表明長dsRNA序列是WCR取食RNAi的必須條件，但仍然不確定是否短dsRNA對最初的吸收和細胞間RNAi的擴展重要。離體方法表明WCR中腸細胞只吸收長dsRNA，脂肪體能吸收dsRNA和siRNA。另一方面，把以V-ATPase(致死性dsRNA靶標)為靶標的siRNA注射到WCR的血腔中沒有致死性。這些發(fā)現(xiàn)表明siRNA被吸收到細胞是可能的，而注射siRNA后無昆蟲死亡表明siRNA細胞吸收途徑可能不足以啟動強的RNAi。

如2.1中討論，昆蟲中腸吸收dsRNA的機制也可能是RNAi效應(yīng)在生物體內(nèi)系統(tǒng)性擴展的原因。比較取食傳遞與注射和WCR組織直接離體吸收dsRNA的情況，明確了中腸與其他組織和細胞吸收dsRNA的差異性，但是其在細胞間的擴展可能不同。標記單個分子檢測其擴展和下一代測序技術(shù)可能會獲得擴展到遠端組織的RNAi分子的特性。總之，WCR對環(huán)境RNAi(environmentalRNAi)有強的反應(yīng)，而最常用的昆蟲模型果蠅體內(nèi)RNAi不是系統(tǒng)性的。因此，WCR可能是調(diào)查dsRNA初期吸收和RNAi效應(yīng)的擴展是相同或不同機制的適當(dāng)?shù)霓r(nóng)業(yè)害蟲和模型生物。

2.5 RNAi的競爭性

應(yīng)用RNAi管理WCR的主要問題之一就是要搞清楚2個dsRNA是協(xié)同還是拮抗作用。最近進行了染色生測試驗測定了WCR體內(nèi)的RNAi，發(fā)現(xiàn)同時飼喂非致死dsRNA和報道dsRNA，報道基因顯型表現(xiàn)受到抑制，表明dsRNA間可能存在競爭性。它們之間作用取決于dsRNA的濃度。WCR脂肪體離體試驗也表明未標記dsRNA在競爭中優(yōu)勝于Cy3標記的dsRNA。競爭也可被解釋為dsRNA吸收的飽和。潛在的dsRNA競爭可能影響田間RNAi的性狀。必須權(quán)衡堆積2個RNAi性狀的利與潛在競爭的弊。然而表面應(yīng)用或混入人工飼料飼喂的dsRNA劑量高可能不能說明植物提供的用于表達dsRNA的dsRNA量的多少。對擬谷盜的研究表明需要100倍的競爭性dsRNA來“戰(zhàn)勝”靶標dsRNA。此研究也表明競爭發(fā)生于dsRNA進入細胞時。進一步調(diào)查2個dsRNA競爭的條件或研究如何避免競爭，將有助于開發(fā)RNAi性狀和防治WCR的IRM策略。

有關(guān)dsRNA競爭的另一問題，就是其他來源的dsRNA，如植物、真菌、細菌或病毒的dsRNA與玉米中轉(zhuǎn)基因表達的以特定WCR mRNA為靶標的dsRNA是否存在競爭作用。Ivashuta等人研究了WCR體內(nèi)的植物源siRNA，發(fā)現(xiàn)WCR體內(nèi)12%siRNA(21 nt)來自玉米，但是植物源siRNA對WCR的轉(zhuǎn)錄組物幾乎沒有影響。這些發(fā)現(xiàn)表明昆蟲在取食寄主植物或相關(guān)非植物生物的情況下，也就是dsRNA濃度約為田間情況時，siRNA的競爭不可能發(fā)生。但是需要進一步研究WCR對外源dsRNA的吸收情況和dsRNA競爭的潛力。

2.6 穩(wěn)定性/植物體內(nèi)的加工

應(yīng)用轉(zhuǎn)基因RNAi玉米有效防治WCR的重要因素之一為dsRNA在玉米根部穩(wěn)定表達和積累。人工飼料生測試驗表明飼料中要有充足的長鏈dsRNA分子，昆蟲攝取60 nt或更長的dsRNA才能啟動有效的RNAi，以及昆蟲不能積累植物產(chǎn)生的siRNA。2種轉(zhuǎn)基因RNA在表達dsRNA的抗蟲RNAi玉米組織中出現(xiàn)。一種RNA是完整的長鏈dsRNA，被WCR取食后啟動致死性RNAi，另一種為21~24 nt siRNA混合物，是植物體內(nèi)長鏈dsRNA被類Dicer剪切產(chǎn)生。飼喂人工飼料后，植物源siRNA序列不能觸發(fā)昆蟲體內(nèi)的RNAi。此外，Ivashuta等人注意到取食植物的WCR和CPB主要積累21~23 nt siRNA，而植物中重要的siRNA為24-mers。CPB和WCR主要積累植物源21-mer siRNA，這些豐富的21-mers對應(yīng)于植物dsRNA loci，表明昆蟲體內(nèi)積累的21-mers是植物體內(nèi)長鏈dsRNA序列經(jīng)加工而來。Elane Fishilevich等認為昆蟲體內(nèi)活性RNAi對轉(zhuǎn)基因RNAi性狀設(shè)計很重要。由于siRNA不能有效啟動WCR體內(nèi)的RNAi，所以維持玉米中完好的發(fā)夾dsRNA(hpRNA)的有效水平和減少或克服植物中類Dicer加工很重要。這可以通過選擇dsRNA啟動序列和優(yōu)化表達而獲得。除了表達水平外，hpRNA的亞細胞定位也可能重要。最近，dsRNA在馬鈴薯葉綠體中穩(wěn)定表達，能保護馬鈴薯不受CPB的危害。

長dsRNA是最初的RNAi啟動者，這對定量測定轉(zhuǎn)基因植物中RNAi活性分子也很重要。把定量的dsRNA混入飼料或用于食物表面來防治昆蟲可能相對簡單，而此用量與植物表達的hpRNA或昆蟲從植物獲得的dsRNA的量的關(guān)系還未知。

3 RNAi風(fēng)險評估

3.1 生態(tài)風(fēng)險評估

3.1.1 對非靶標節(jié)肢動物的影響

已有研究表明取食的殺蟲dsRNA對靶標具有高度特異性，具有序列特異性反應(yīng)，當(dāng)品種間進化距離和序列間差異增加時，反應(yīng)降低。首次研究RNAi對非靶標節(jié)肢動物的影響中評估了赤擬谷盜、豌豆蚜和煙草天蛾取食未被保護的dsRNA和黑腹果蠅取食被脂質(zhì)體保護的dsRNA后品種特異性和非特異性V-ATPase dsRNA的作用。當(dāng)取食特異性V-ATPase dsRNA，靶標昆蟲敏感，取食非特異性dsRNA的昆蟲死亡率非常低。此外，飼喂以易變基因區(qū)域為靶標的-微管蛋白dsRNA選擇性地殺死果蠅屬的昆蟲。最初對WCR靶標基因的研究評估了dsRNA對南方玉米根蟲、黃瓜十一星葉甲食根亞種、馬鈴薯甲蟲和棉鈴象甲體內(nèi)V-ATPase-A和V-ATPase-E的作用。WCR dsRNA能使黃瓜十一星葉甲食根亞種和馬鈴薯甲蟲有低的但顯著的死亡率，但對棉鈴象甲沒有影響。評估了以WCR Snf7為靶標的dsRNA對4個目10個科的昆蟲的致死和亞致死影響。結(jié)果為WCR Snf7 dsRNA殺蟲活性譜窄，僅對葉甲科螢葉甲亞科甲蟲有作用，預(yù)示在實踐中WCR Snf7 dsRNA的暴露對非靶標節(jié)肢動物副作用可能性非常低。

其他評估WCR dsRNA對非靶標節(jié)肢動物影響的研究結(jié)果也表明其具有較低的副作用風(fēng)險。種植轉(zhuǎn)基因WCR Snf7 dsRNA和Cry3Bb1(MON 87 411)玉米進行田間試驗，以驗證實驗室得到的結(jié)果。為此評估了多種環(huán)境條件和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中試驗的非靶標節(jié)肢動物的數(shù)量和非靶標害蟲對植物的危害程度。結(jié)果表明暴露于MON 87411玉米對非靶標節(jié)肢動物沒有副作用。評估WCR dsRNA對蜜蜂影響的研究結(jié)果與此相似：高劑量WCR Snf7 dsRNA和V-ATPase-A dsRNA的暴露對蜜蜂幼蟲和成蟲沒有影響。更有趣的為，沒有發(fā)現(xiàn)高劑量蜜蜂特異性V-ATPase dsRNA的作用。其他目昆蟲相似的結(jié)果表明一些類群昆蟲對取食的dsRNA具有固有的敏感性差的特性。這些結(jié)果表明除了dsRNA序列特異性，昆蟲對靶標特異性和非靶標特異性RNAi都具有固有的“障礙”。

目前，抗蟲轉(zhuǎn)基因作物(例如表達.殺蟲蛋白的植物)的生態(tài)風(fēng)險評估方法是評估RNAi介導(dǎo)的抗蟲作物潛在風(fēng)險的基礎(chǔ)。然而，由于RNAi作用機制獨特，已建議修改此風(fēng)險評估方法以適用RNAi轉(zhuǎn)基因抗蟲作物。例如，應(yīng)很好地評估RNAi轉(zhuǎn)基因抗蟲作物對生態(tài)重要的且與靶標密切相關(guān)的非靶標生物的影響，因為這些生物很可能對RNAi轉(zhuǎn)基因抗蟲作物敏感。風(fēng)險評估員也一致認為應(yīng)評估啟動RNAi的每種dsRNA對非靶標生物的風(fēng)險，就像對待其他殺蟲轉(zhuǎn)基因性狀一樣。有人也開始關(guān)注隨機序列同源性可能導(dǎo)致非靶標基因被抑制，以及對非靶標的免疫病毒應(yīng)答的潛在影響。昆蟲持續(xù)暴露于自然條件中各種來源的非昆蟲dsRNA中，因此與植物天然產(chǎn)生或轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)能防御病毒或提供其他性狀的dsRNA相比，以沉默昆蟲基因為目標的dsRNA同樣也可能會影響非靶標基因或節(jié)肢動物免疫應(yīng)答功能。如2.5所述，WCR能較易地吸收和加工野生型植物內(nèi)生的dsRNA，而不會顯著地改變它們的轉(zhuǎn)錄性狀。這些發(fā)現(xiàn)也適用于其他種類，但考慮到對RNAi IR性狀的研究還處于初級階段，還需要進一步研究RNAi對非靶標節(jié)肢動物的影響，這將進一步充實其環(huán)境風(fēng)險評估數(shù)據(jù)。

3.1.2和RNAi的相互作用

美國和其他國家的管理者要求研究轉(zhuǎn)入同一植物的幾種轉(zhuǎn)基因殺蟲性狀間協(xié)同作用的潛力。如果不同性狀間沒有相互作用或很微弱，研究單個性狀對非靶生物的影響，作為對此多性狀體的風(fēng)險評估。對于同時表達WCR dsRNA和殺蟲蛋白的玉米，與dsRNA間的相互作用潛力被認為是環(huán)境風(fēng)險評估的一部分。到目前為止，只評估了Cry蛋白和dsRNA(Cry3Bb1和WCR Snf7 dsRNA)間潛在的相互作用，此研究以黃瓜十一星葉甲食根亞種為試驗昆蟲，具體進行了以下工作：⑴分別研究了Cry3Bb1和WCR Snf7 dsRNA單獨作用效果以及二者綜合作用；⑵研究一個成分亞致死濃度減少另一成分中濃(LC50)的潛力。2個方面的研究都表明在MON 87411體內(nèi)表達的Cry3Bb1和WCRSnf7 dsRNA間沒有增效作用，二者獨立作用，也支持對MON 87411進行風(fēng)險評估時分別獨立評估Cry3Bb1和WCRSnf7 dsRNA對非靶標節(jié)肢動物的風(fēng)險。蛋白(結(jié)合到中腸受體，形成氣孔，產(chǎn)生胞溶作用)和dsRNA(靶標mRNA沉默)不同的作用機制，預(yù)示著二者不存在相加效應(yīng)。此外對RNA發(fā)夾和WCR活性蛋白聯(lián)合作用研究進一步證實二者獨立作用。

3.1.3 dsRNA環(huán)境穩(wěn)定性

對殺蟲分子生態(tài)風(fēng)險評估的重要一部分是測定殺蟲物質(zhì)在環(huán)境中殘留的潛力和對非靶生物種群的影響。測定活性殺蟲分子在環(huán)境中的穩(wěn)定性來確定其是否可能對敏感非靶標生物存在長期風(fēng)險；對于作物，要分析土壤和作物殘留對靶標的活性。Dubelman等人進行了實驗室降解研究，來確定來源于孟山都玉米品系MON 87411的WCR Snf7 dsRNA生物降解潛力。研究者測試了粉沙壤土、壤質(zhì)沙土、黏壤土的不同物化特性，把黃瓜十一星葉甲食根亞種暴露于接種于土壤中的dsRNA，來評估其生物活性(即昆蟲的死亡率)。此研究表明48 h后在3種土壤中都檢測不到Snf7 dsRNA。Snf7 dsRNA的半衰期不到30 h，而蛋白的半衰期為1 d到數(shù)天。此外，在2 d內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)黃瓜十一星葉甲食根亞種死亡。這些結(jié)果表明Snf7 dsRNA和其他dsRNA不可能在土壤中殘留和積累。如果證實在土壤中殘留，就有必要研究是否有益土壤生物暴露于dsRNA會敏感，是否有益土壤生物具有必要的吸收和加工dsRNA的RNAi機器(machinery)以及匹配的靶標基因序列。

對殺蟲蛋白的室內(nèi)研究已表明(即使蛋白在環(huán)境中的半衰期因蛋白質(zhì)和環(huán)境的不同而不同，為數(shù)小時到幾天到1月多)一些蛋白質(zhì)能夠結(jié)合到土壤中的黏土顆粒上。評估蜜蜂飼料中dsRNA的穩(wěn)定性試驗表明dsRNA能結(jié)合到蜂王漿成分上，表明其結(jié)果與相似。有趣的是，dsRNA結(jié)合到其他分子后，非靶標生物可能無法獲得，因此暴露風(fēng)險降低。

3.2 昆蟲抗性管理

靶標害蟲種群易于對抗蟲轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生抗性，導(dǎo)致抗蟲物質(zhì)有效利用時間縮短，相關(guān)利益損失。靶標害蟲降解或“隔離”殺蟲物質(zhì)，作用機制中任一步發(fā)生異常，靶標點敏感性下降，或規(guī)避物質(zhì)影響的補償性變異，通過這些方式害蟲抗藥性產(chǎn)生。對于RNAi，雖然還沒有確定，但人們認為有許多潛在的抗性機制。例如，對食物中dsRNA的抗性可能是由于取食(可能避免取食含有高含量dsRNA的植物組織)后吸收的降低而產(chǎn)生，dsRNA分子在昆蟲消化系統(tǒng)中的降解增加，細胞吸收dsRNA的屏障的產(chǎn)生，Dicer核糖核酸酶加工能力下降，含有siRNA分子的RISC復(fù)合體識別能力降低，RISC復(fù)合體不能降解靶標mRNA，RNAi系統(tǒng)性擴展受阻。昆蟲也可能具有補償機制，通過增加靶標基因序列的轉(zhuǎn)錄率或上調(diào)與靶標基因(沉默)具有相同或相似功能的其他基因，規(guī)避基因被沉默。也可能是由于靶標基因序列發(fā)生點突變，導(dǎo)致與mRNA匹配的21-mer減少或消失。

如果相對較長鏈dsRNA序列的轉(zhuǎn)基因表達下調(diào)了WCR的必須基因，那么靶標點介導(dǎo)的抗性好像不可能發(fā)生。對于秀麗隱桿線蟲，在核心途徑基因中以及與RNAi系統(tǒng)性擴展有關(guān)基因中已確定RNA缺乏型突變。對WCR來說，是否具有相似的情況還需要進行研究以確定。然而，人們可以預(yù)見RNAi吸收機制可能發(fā)生突變，但WCR是否存在多個dsRNA吸收途徑或補償性途徑(例如類SID系統(tǒng)和內(nèi)吞作用)仍然未知。如果RNAi對外源dsRNA有防御作用，那么長時間病毒的暴露所帶來的選擇壓會導(dǎo)致核心RNAi機器突變，影響防治根蟲的RNAi性狀持久性。昆蟲最可能產(chǎn)生的抗性機制可能取決于基因序列和調(diào)控元件突變的數(shù)量，以及適合度代價。與RNAi吸收減少有關(guān)的適合度代價可能與取食和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力下降有關(guān)，RNAi機器活性的下降可能導(dǎo)致對病毒病的敏感性增加，基因調(diào)控的變化可能會改變其他細胞代謝功能，靶標基因序列的變化可能會導(dǎo)致其表達的蛋白的活性或特異性下降。

通常通過以下2種方式延遲昆蟲對殺蟲轉(zhuǎn)基因作物抗性的進化：⑴種植可避難植物(不含有殺蟲物質(zhì)的作物，因此對殺蟲物質(zhì)敏感的昆蟲可以在其中生存)；⑵聯(lián)合應(yīng)用不同作用機制的多個殺蟲物質(zhì)。避難所為種植對已知性狀沒有選擇壓的作物場所，因此沒有高頻抗性等位基因的昆蟲在其間可存活。這些敏感昆蟲和在抗蟲轉(zhuǎn)基因作物田中存活的抗性昆蟲交配，其后代抗性等位基因雜合。如果這些雜合體也能被抗蟲轉(zhuǎn)基因作物防治，那最初稀有的抗性等位基因在害蟲種群內(nèi)的擴展就被大大地延遲。如果抗蟲轉(zhuǎn)基因作物同時產(chǎn)生2種或更多的具有不同作用機制的殺蟲物質(zhì)，交互抗性發(fā)生的可能性就小，攜帶其中一種物質(zhì)的抗性等位基因的昆蟲將會被其他的殺蟲物質(zhì)防治住，就不會把抗性等位基因傳遞給下一代。避難所和能產(chǎn)生多個殺蟲物質(zhì)的抗蟲轉(zhuǎn)基因作物聯(lián)合應(yīng)用是有效的抗性管理策略，目前，此策略已較多地用于不同蛋白抗性的防治。為此，已聯(lián)合應(yīng)用多種蛋白管理玉米根蟲(如Cry3Bb1+Cry34Ab1/Cry35Ab1和Cry34Ab1/Cry35Ab1+ mCry3A)，雖然在靶標害蟲種群對其中的一個活性成分產(chǎn)生抗性的田中它們的長期防效可能會降低。

已認識到RNAi用于玉米根蟲防治時應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用其他作用機制的性狀以延長RNAi的有效期。第一個可能商業(yè)化的產(chǎn)品MON 87411能產(chǎn)生WCR Snf7 dsRNA和Cry3Bb1蛋白。有報道稱在美國玉米帶的許多田間已發(fā)現(xiàn)Cry3Bb1抗性，故想把這2種作用機制性狀和Cry34AB1/Cry35Ab1聯(lián)合應(yīng)用以延長轉(zhuǎn)基因作物有效期。到目前仍然沒有是否RNAi產(chǎn)品能提供對玉米“高劑量保護”的信息。EPA定義“高劑量”為在田間條件下，引起99.99%幼蟲死亡，因此預(yù)期RNAi產(chǎn)品的抗性將是隱性性狀。在田間很難直接測量玉米根蟲幼蟲的死亡率，而已被作為代表物的成蟲的出現(xiàn)，受變化的幼蟲侵染率和生物和非生物致死因素的影響。應(yīng)該開發(fā)防治WCR的“高劑量”RNAi產(chǎn)品，預(yù)期其有較長的有效期。

Parental RNAi(pRNA)能阻礙產(chǎn)卵或使卵的生存力下降，具有增加RNAi和其他機制的抗蟲轉(zhuǎn)基因作物有效防蟲時間的潛力。pRNAi阻礙暴露的昆蟲產(chǎn)生后代，進而阻礙了其他殺蟲物質(zhì)(例如)的抗性等位基因傳遞給下一代。因此，pRNAi和作用于同一害蟲的一個或多個蛋白(或其他殺蟲物質(zhì))聯(lián)用能延長抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的壽命。與避難所作物相比，轉(zhuǎn)基因作物中抗蛋白的昆蟲以較高的比率出現(xiàn)，故以上方法的優(yōu)勢凸顯。如果傳遞給下一代抗性等位基因與敏感等位基因的比率在pRNAi昆蟲中低于非pRNAi昆蟲中，那么抗性的進化會緩慢。能產(chǎn)生parental dsRNA和1個其他殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因作物與只能產(chǎn)生一個殺蟲性狀的轉(zhuǎn)基因作物相比“壽命”更長。

Snf7和其他基因作為防治玉米根蟲的靶標時，需要重點考慮1個RNAi抗性賦予其他RNAi分子交互抗性的潛力。破壞RNAi機器的抗性機制似乎更可能導(dǎo)致整個dsRNA介導(dǎo)的RNAi家族產(chǎn)生抗性。然而，特別的機制，如改變靶標基因序列或補償基因的上調(diào)不會賦予其他靶標基因的RNAi交互抗性。目前，還不明確田間將會出現(xiàn)何種抗性機制，因此難以預(yù)測交互抗性發(fā)生情況。同時表達的2個或多個RNAi分子可能為對靶標害蟲具有多個作用機制，如果抗性是序列特異性，那么交互抗性低；如果抗性為RNAi機器的變化所致，交互抗性就高。

4 挑戰(zhàn)和未來發(fā)展方向

WCR適應(yīng)害蟲管理措施的能力強，如轉(zhuǎn)基因性狀。目前，只有2種不同作用機制的蛋白，即來源于的Cry3和Cry34/35，商業(yè)化用于防治WCR。Cry3Bb和Cry34/35Ab1玉米雜合體已以商品名SmartStax用于WCR抗性管理，然而，田間WCR已對基于Cry的IR性狀產(chǎn)生抗性，這可能增加WCR種群對Cry34/35抗性的選擇壓。此情形急需新作用機制代替Cry3和Cry34/35性狀。轉(zhuǎn)基因dsRNA能成功地保護玉米根免受WCR取食危害，這催化了整個工業(yè)以新穎作用機制的RNAi與技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的興趣，以降低田間WCR對當(dāng)前市場化性狀抗性進化的可能性。當(dāng)前對Snf7以及vATPase的研究結(jié)果預(yù)示，RNAi產(chǎn)品不久將被成功開發(fā)用于管理抗性WCR。

目前還有一些問題沒有明確，這阻礙了RNAi和性狀雜合商業(yè)化的應(yīng)用。⑴在不同田間季節(jié)RNAi性狀的效力和商業(yè)化雜合體產(chǎn)量潛力；⑵評估dsRNA殺蟲性狀安全性的法規(guī)框架可能在某些方面不同于已建立的殺蟲劑性狀的。有報道表明當(dāng)前蛋白性狀環(huán)境安全評價準則適用于評價RNAi作物。RNA是食物和飼料的成分，一般認為對哺乳動物安全。Petrick等人最近綜述了評估生物技術(shù)性狀對人類健康安全的研究，提出目前認可的評估生物技術(shù)作物安全的原則適用于RNA性狀，如RNAi。最近，美國EPA登記了MON 87411，此產(chǎn)品能產(chǎn)生Snf7 dsRNA和Cry3Bb1蛋白，在登記前廣泛評估了其哺乳動物毒性和環(huán)境風(fēng)險。美國農(nóng)業(yè)部豁免了對此產(chǎn)品的監(jiān)管，按照美國食品和藥品管理局的食品和飼料安全準則完成了對此產(chǎn)品的評估。Mon 87411在加拿大也已完成對食品、飼料和栽培作物安全的登記審查。在澳大利亞、新西蘭和臺灣批準用于食品和/或飼料。⑶和所有殺蟲劑一樣，RNAi田間抗性的選擇是人們關(guān)注的重要問題。RNAi性狀的抗性可能來自靶標點突變或有關(guān)dsRNA吸收、dsRNA轉(zhuǎn)化為siRNA和RNAi的擴展——RNAi途徑的突變。更多研究RNAi性狀抗性在實驗室的選擇或在田間進化的潛力將有助于理解用RNAi進行抗性管理的長期價值和性狀的持久性。雜合RNAi性狀和對玉米根蟲有效的蛋白質(zhì)性狀將有助于緩和抗性風(fēng)險的發(fā)展。

總之，不久種植者就可能利用第一代RNAi性狀防治WCR。研究者將不斷致力于提高第一代防治玉米根蟲RNAi保護根和“高劑量”的效力。還可應(yīng)用pRNAi進行跨代防治根蟲種群以及局部應(yīng)用或用于誘餌。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.02.01

TQ450

A

1009-6485(2017)02-0001-08

葉萱，女，工程師。Tel: 021-64387891-201。

2016-03-29。