脂聯(lián)素后處理對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響及ADP/PI3K/Akt信號通路的作用*

趙林靜， 崔柳蘇， 張金盈， 王永玲

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科, 河南 鄭州450000)

脂聯(lián)素后處理對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響及ADP/PI3K/Akt信號通路的作用*

趙林靜1△， 崔柳蘇1， 張金盈2， 王永玲1

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科, 河南 鄭州450000)

目的探討脂聯(lián)素(ADP)后處理對大鼠心肌缺血/再灌注損傷(MIRI)的影響以及脂聯(lián)素/磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B (ADP/PI3K/Akt)通路的作用。方法SD大鼠麻醉后氣管插管連接呼吸機，開胸暴露心肌，在左心耳和肺動脈圓錐之間用帶線圓針對冠脈左前降支(LAD)穿線，LAD結(jié)扎斷流30 min后松線再灌注120 min，建立大鼠MIRI模型。大鼠隨機分為以下5組(n=12)：① 假手術(shù)組(Sham組)：LAD僅穿線不結(jié)扎；② MIRI組；③ADP后處理組(ADP組)：LAD斷流10 min時靜注ADP繼續(xù)斷流20 min，然后再灌注120 min；④ADP+LY294002組：LAD斷流10 min時靜注ADP和LY294002，其余同ADP組；⑤LY294002組：LAD斷流10 min時靜注LY294002，其余同ADP組。各組取血檢測LDH和cTnI含量，取左心室心肌測定PI3k、Akt、p-Akt、ADPmRNA、ADPR1mRNA和PI3KmRNA表達。結(jié)果與Sham組比較，MIRI組血漿LDH和cTnI均明顯升高(P<0.05)；和MIRI組相比，ADP組心肌損傷指標(biāo)明顯下降(P<0.05)，而應(yīng)用LY294002的兩組心肌損傷比ADP組加重(P<0.05)。ADP組心肌PI3K、p-Akt、ADPmRNA、ADPR1mRNA和PI3kmRNA表達比MIRI組升高(P<0.05)，應(yīng)用LY294002兩組上述5個指標(biāo)比MIRI組降低(P<0.05)。結(jié)論ADP后處理對大鼠MIRI有保護作用，ADP/PI3K/Akt通路參與了以上作用。

脂聯(lián)素；缺血后處理；心肌缺血/再灌注損傷；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；磷脂酰肌醇-3激酶；磷酸化的蛋白激酶B；大鼠

脂聯(lián)素(adiponectin, ADP)是一種由脂肪細胞分泌的細胞因子，具有保護血管內(nèi)皮、抗炎以及抗心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，M1RI)等多種生物學(xué)功能。脂聯(lián)素/磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(adiponectin/phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, ADP/PI3K/Akt)通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，不僅與細胞多種生理和調(diào)節(jié)功能相關(guān)，而且在細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和細胞凋亡中也起著重要作用，與很多疾病的發(fā)生發(fā)展都有關(guān)系。

多個實驗[1,2]證實在心肌缺血預(yù)處理中ADP 可以通過激活A(yù)DP/PI3K/Akt通路減輕大鼠MIRI，高建芝等[3]運用PI3K特異性抑制劑LY294002干預(yù)，發(fā)現(xiàn)大鼠肢體缺血預(yù)處理也是通過激活A(yù)DP/P13K/Akt通路發(fā)揮對MIRI的保護作用的。但是臨床患者心肌缺血的發(fā)生無法預(yù)測，所以臨床上針對急性心梗的靜脈溶栓和介入治療等均是在心肌缺血后實施的，因此ADP心肌缺血后處理顯然比各種缺血預(yù)處理有更廣的應(yīng)用前景，但是ADP后處理的機制目前還較少報道。

為探討ADP后處理對大鼠MIRI的作用及機制，本實驗建立大鼠MIRI模型并給予ADP后處理，采用PI3K特異性抑制劑LY294002阻斷ADP下游的PI3K/Akt通路，觀察心肌損傷指標(biāo)、PI3K、Akt和磷酸化Akt(phosphorylated-Akt, p-Akt)蛋白的變化，檢測大鼠心肌ADPmRNA、ADPR1mRNA和PI3KmRNA的表達，以期為MIRI的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級SD大鼠60只，體重220～280 g，由河南省實驗動物中心提供。所有大鼠均在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院綜合實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，實驗前禁食12 h，不禁水。

造模成功的大鼠隨機分為以下5組(n=12)：(1)假手術(shù)(Sham)組：LAD僅穿線并不結(jié)扎斷流；(2) MIRI組：LAD穿線并結(jié)扎線斷流30 min后松線再灌注120 min；(3) ADP后處理組(ADP組)：LAD結(jié)扎斷流10 min時不松結(jié)扎線經(jīng)股靜脈一次性注射ADP(180 μg/100 g)后，再繼續(xù)維持LAD斷流狀態(tài)20 min，然后松線再灌注120 min；(4) ADP+LY294002組：LAD結(jié)扎斷流10 min時不松結(jié)扎線經(jīng)股靜脈一次性注射ADP(180 μg/100 g)和LY294002[2](0.03 mg/100 g)，其余操作同ADP組；(5) LY294002組：LAD結(jié)扎斷流10 min時不松結(jié)扎線經(jīng)股靜脈一次性注射LY294002(0.03 mg/100 g)，其余操作同ADP組。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：ECL-Western blot試劑盒購自碧云天生物研究所，大鼠乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)和心肌鈣蛋白I ( cardiac troponin I ,cTnI)試劑盒購自R&D公司，RT-PCR試劑盒購自中杉金橋生物公司，Hairpin-it miRNAs qRT-PCR 試劑盒購自吉瑪生物公司，脂聯(lián)素購自Phoenix公司，LY294002購自Sigma公司。

主要儀器：DHX-150B型動物呼吸機購自特力麻醉呼吸設(shè)備公司，DYY-Ⅲ型水平凝膠電泳槽購自北京六一電器公司，762紫外分光光度計購自上海分析儀器廠，SIM凝膠成像系統(tǒng)購自美國SIM公司，Mini-V8.10垂直電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Biometra 公司，ETC811型PCR儀購自北京東勝科技公司，DYY-6C微型電泳儀購自泰州星火儀器公司。

1.3 動物模型的制備

按照本組前期操作[4]，大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后，氣管插管連接呼吸機進行機械通氣支持，開胸后鈍性剝離心包膜暴露心肌，從左心耳下方中點1～1.5 mm處用帶著無損傷縫合線的圓針，穿過心肌表層，出針點位于左心耳右緣和肺動脈圓錐之間，由此對冠脈左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)進行穿線和結(jié)扎斷流，建立大鼠MIRI模型，以結(jié)扎線以下的心肌顏色變暗和左室壁搏動減弱為LAD結(jié)扎成功的標(biāo)志。

1.4 引物序列

PCR 引物設(shè)計：登錄Genebank，查詢大鼠ADP、脂聯(lián)素受體1 (Adiponect in receptor 1, ADPR1)、PI3K和β-actin cDNA全長序列，引物序列使用primier5.0引物設(shè)計軟件進行設(shè)計，由北京三博遠志生物公司合成。

引物序列為 β-actin： 上游引物：5'- CATCATGAAGTGTGACGTTG -3', 下游引物：5'- ATCCACACAGAGTACTTGCG -3'; 脂聯(lián)素 上游引物：5'- CGCGTCACTGTCCCCAATGT -3', 下游引物：5'- AGCTGAAAGCCTGTCGCCTG -3'; ADPRR1 上游引物：5'- CTGGCCTTTATGCTGCTCGGA -3', 下游引物：5'- TGCACATGGGAAGTGTACGGC-3'; PI3K 上游引物：5'- ATGACGCACATCATGGTGGC -3', 下游引物：5'- CTGACTGTGCCATCCCATGCC -3'

1.5 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測

各組動物L(fēng)AD缺血再灌注120 min后(Sham組LAD穿線后150 min)，自頸總動脈取血2～3 ml，離心(3500 r/min)10 min后取上清液分裝入Eppendorf管待檢。用Elisa(enzyme linked immunosorbent assay, Elisa)法檢測血漿LDH和心肌cTnI含量。

待抽血后每組取6只大鼠快速摘取心臟，用冷生理鹽水反復(fù)沖洗擠壓清除殘血后，取體積約為4.5×4.5×2.0 mm3的心尖左心室部分心肌，置于無菌無熱原質(zhì)的凍存管中迅速入液氮，隨后移入-80℃超低溫冰箱中保存，用于Western blot法測定心肌PI3K、Akt和p-Akt表達以及RT-PCR法檢測ADPmRNA、ADPR1mRNA和PI3kmRNA表達。為避免環(huán)境中RNA酶對心肌的污染，減少心肌室溫下停留時間過長導(dǎo)致組織降解，以上操作應(yīng)盡量迅速，用時越短越好。

提取心肌細胞蛋白后用BCA法測定蛋白含量，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，經(jīng)轉(zhuǎn)膜和封閉后，將膜放入雜交袋中，加入濃度為1：500目的蛋白一抗，4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液加Tween-20洗膜3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1.5 h。經(jīng)過ECL顯色和X光片顯影后，最后使用Image-J軟件，β-actin為內(nèi)參，以條帶與β-actin灰度值相比定量分析心肌PI3K、Akt和p-Akt蛋白的相對表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血漿LDH和cTnI的含量

MIRI組血漿LDH和cTnI含量均高于Sham組(P<0.05)，ADP組兩個指標(biāo)均低于MIRI組(P<0.05)，ADP+LY294002組和LY294002組中兩個指標(biāo)均高于ADP組(P<0.05)，和MIRI組比較無差別(P>0.05，表1)。

GroupLDH(IU/L)cTnI(μg/ml)Sham314．33±56．054．96±0．99MIRI735．21±110．92?37．96±5．97?ADP579．25±69．01?#21．07±5．77?#ADP+LY294002709．22±89．01?△35．55±4．78?△LY294002715．15±56．97?△31．73±6．64?△

MIRI: Myocardial ischemia/reperfusion injury; ADP: Adiponectin; LDH: Dehydrogenase; cTnI: Troponin I

*P<0.05vssham;#P<0.05vsMIRI;△P<0.05vsADP

2.2 各組大鼠心肌PI3K、Akt和p-Akt的表達

5組大鼠心肌Akt表達無差異(P>0.05)。MIRI組心肌PI3K和p-Akt表達比Sham組降低 (P<0.05)，ADP組兩種蛋白表達比MIRI組升高(P<0.05)，ADP+LY294002組和LY294002組兩種蛋白表達均比MIRI組降低(P<0.05)，兩組間無差異(P>0.05，表2，圖1-2)。

GroupPI3K/β?actinAkt/β?actinp?Akt/β?actinSham1．20±0．031．07±0．0040．96±0．09MIRI0．72±0．04?1．06±0．080．69±0．07?ADP1．05±0．05#1．10±0．041．11±0．16#ADP+LY2940020．40±0．06?#△1．09±0．070．22±0．05?#△LY2940020．38±0．11?#△1．07±0．080．17±0．03?#△

PI3K: Phosphatidylinositol 3 kinase; MIRI: Myocardial ischemia/reperfusion injury; ADP: Adiponectin; Akt: Protein kinase B(PKB/Akt); p-Akt: Phosphorylated-protein kinase B

*P<0.05vssham；#P<0.05vsMIRI；△P<0.05vsADP

Fig.1Expressions of Akt in myocardial tissue in different groups Akt: Protein kinase B; 1: Sham; 2: Myocardial ischemia/reperfusion injury(MIRI); 3: Adiponectin(ADP); 4: ADP+LY294002; 5: LY294002

Fig.2Expressions of p-Akt in myocardial tissue in different groups 1: Sham; 2: MIRI; 3: ADP; 4: ADP+LY294002; 5: LY294002; p-Akt: Phosphorylated-protein kinase B

2.3各組大鼠心肌ADPmRNA、ADPR1mRNA和PI3kmRNA的表達

MIRI組心肌ADPmRNA、ADPR1mRNA和PI3kmRNA的表達均比Sham組降低 (P<0.05)，ADP組3指標(biāo)均比MIRI組升高(P<0.05)，ADP+LY294002組和LY294002組的3指標(biāo)均較MIRI組下降(P<0.05, 表3，圖3-6)

3 討論

3.1 脂聯(lián)素后處理可以減輕MIRI

LDH是傳統(tǒng)的心肌損傷標(biāo)志物，主要存在于心肌和骨骼肌中，如果心肌損傷則被釋放入血。cTnI是重要的心肌調(diào)節(jié)蛋白，分子量小，所以在心肌受損初期即可入血，由于敏感性強和血中持續(xù)時間長，又稱作心肌受損的“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]并且其升高水平與心肌損傷程度一致[6]。實驗中ADP組心肌損傷指標(biāo)明顯下降，而應(yīng)用LY294002的兩組心肌損傷比ADP組加重，提示ADP后處理對大鼠MIRI有保護作用，而LY294002則抑制這種保護作用。

GroupADPmRNA/β?actinADPR1mRNA/β?actinPI3kmRNA/β?actinSham0．71±0．071．14±0．040．21±0．01MIRI0．45±0．01?0．73±0．02?0．12±0．01?ADP0．69±0．001#1．00±0．07#0．29±0．02#ADP+LY2940020．32±0．01#△0．48±0．02#△0．07±0．03#△LY2940020．24±0．01#△0．39±0．03#△0．05±0．002#△

MIRI: Myocardial ischemia/reperfusion injury; ADP: Adiponectin; ADPR1: Adiponectin receptor 1; PI3k: Phosphatidylinositol 3-kinase

*P<0.05vssham；#P<0.05vsMIRI；△P<0.05vsADP

Fig.3Expressions of ADPR1 mRNA in myocardial tissue in different groups(366 bp) 1: Sham; 2: Myocardial ischemia/reperfusion injury(MIRI); 3: Adiponectin(ADP); 4: ADP+LY294002; 5: LY294002; ADPR 1mRNA: Adiponectin receptor 1mRNA

Fig.4Expressions of ADP mRNA in myocardial tissue in different groups(331 bp) ADP: Adiponectin

Fig.5Expressions of PI3K mRNA in myocardial tissue in different groups(255 bp) PI3K: Phosphatidylinositol 3-kinase

Fig.6Expressions of β-actin mRNA in myocardial tissue in different groups(168 bp) 1: Sham; 2: MIRI; 3: ADP; 4: ADP+LY294002; 5: LY294002

針對MIRI，心肌缺血預(yù)處理被認為是最強大的心肌保護方法。但臨床針對急性心梗的各種治療均是在心肌缺血后實施的，所以在2003年提出的缺血后處理貼近臨床，成為MIRI的研究熱點。多個實驗證實心肌缺血后處理對大鼠[7,8]和兔[9]MIRI均具有保護作用，但由于單純?nèi)毖筇幚韺儆谟袚p操作，臨床上并不可行，于是藥物后處理得到更多關(guān)注。在眾多中西藥物中，ADP很受關(guān)注。近年發(fā)現(xiàn)高血壓和冠心病患者ADP水平明顯降低，并且大鼠MIRI越嚴(yán)重，ADP 水平下降越明顯，提示ADP具有心臟保護作用。

通過ADP后處理對MIRI的作用和機制研究，未來臨床有可能對急性心梗再灌注前或者不具備再灌注條件的患者采取類似藥物保護措施，以保護心肌和提高心臟功能，本實驗以期從藥物后處理角度為MIRI的防治提供實驗依據(jù)。

3.2 脂聯(lián)素和PI3K/Akt通路

ADP的受體包括ADPRl、ADPR2和T-鈣粘蛋白(T-Cadherin)等，其中ADPRl是心臟中的主要受體[10]。有學(xué)者[11]發(fā)現(xiàn)阻止ADP和ADPRl結(jié)合會對抗ADP對MIRI的保護作用，所以ADP和其受體結(jié)合后的ADP/PI3K/Akt通路吸引學(xué)者進行后續(xù)深入的研究。

ADP/PI3K/Akt通路是體內(nèi)重要的促細胞生存激酶途徑，也是與心肌細胞存活相關(guān)的信號通路，被稱為心肌再灌注損傷存活激酶通路[12,13]。PI3K分子量約為57 KD，是細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶家族的重要成員，也是位于細胞質(zhì)膜上的第二信使[14]。Akt是PI3K通路下游的效應(yīng)分子，是PI3K直接的下游作用靶點[15]。當(dāng)PI3K活化后可使Akt轉(zhuǎn)位到細胞膜引起級聯(lián)反應(yīng)來調(diào)節(jié)細胞凋亡[16]。只有Akt磷酸化形成p-Akt才有活性[13]，Akt的磷酸化包括Thr308位點磷酸化和Ser473羧基端磷酸化。陳珊珊等[17]報道PI3K/Akt通路被激活后磷酸化的p-Akt可以刺激大鼠心肌細胞增殖并抑制細胞凋亡，此外在心外器官也有報道[18]PI3K/Akt信號通路的激活對大鼠肺動脈平滑肌細胞有促進增殖的正向調(diào)節(jié)作用。

由于ADP/PI3K/Akt是一個有著上下游關(guān)系的信號通路，并且Akt形成p-Akt才有生物學(xué)作用，所以目前探討ADP/PI3K/Akt通路在MIRI中的作用時多采用ADP后處理。

3.3ADP/PI3K/Akt通路在ADP后處理保護MIRI中的作用

Guo J等[19]對新生大鼠的心肌細胞給予缺氧復(fù)氧干預(yù)，發(fā)現(xiàn)用ADP處理可減輕心肌細胞損傷，可能是通過上調(diào)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶的活性和降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來實現(xiàn)的。針對上述實驗，如果事先用PI3K特異性抑制劑LY294002進行預(yù)處理，則ADP的這種保護作用也就不存在，實驗結(jié)果提示了ADP/PI3K/Akt通路在大鼠心肌細胞保護中的作用。

本實驗結(jié)果和ADP組相比，ADP+LY294002組和LY294002組心肌損傷加重而p-Akt等表達明顯降低，應(yīng)用LY294002兩組指標(biāo)組間比較并無差別，單獨LY294002組的設(shè)置相當(dāng)于一組陰性對照，提示LY294002可以對抗ADP的心肌保護作用。

Wang T等[20]制作了大鼠MIRI模型，證實N-乙酰半胱氨酸和別嘌呤醇兩種藥物分別對大鼠MIRI的保護作用是通過ADP/PI3K/Akt通路來完成的。在糖尿病大鼠心肌細胞培養(yǎng)的缺氧和復(fù)氧干預(yù)下，他們使用了另一種PI3K抑制劑-渥曼青霉素(Wortmannin，即奧特曼寧)同樣可以使以上兩種藥物對心肌細胞缺氧的保護作用消失。在實驗中Wang還使脂聯(lián)素受體的基因沉默，結(jié)果上述兩種藥物的心肌保護作用同樣消失，更提示ADP/PI3K/Akt通路在保護大鼠MIRI中的重要作用，此通路不僅僅是ADP保護大鼠MIRI的重要通路，也可能是其他心肌保護藥物和保護因子的共同通路，從側(cè)面也說明了ADP/PI3K/Akt通路在大鼠心肌保護中的重要位置。

本實驗在制備大鼠MIRI模型基礎(chǔ)上，通過ADP后處理使心肌損傷明顯減輕，PI3K和p-Akt等表達升高；而采用PI3K特異性抑制劑LY294002阻斷ADP/PI3K/Akt通路后，ADP保護作用消失，心肌損傷加重和p-Akt等表達降低，提示ADP后處理對大鼠MIRI有保護作用，ADP/PI3K/Akt通路參與了以上作用。

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Effectofadiponectinpostconditioningagainstmyocardialischemia/reperfusioninjuryinratsandroleofADP/PI3K/Aktpathwayinadiponectinpostconditioning

ZHAO Lin-jing1△, CUI Liu-su1, ZHANG Jin-ying2, WANG Yong-ling1

(1. School of Basic Medicine, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003; 2. Department of Vasculocardiology, First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China)

Objective: To investigate the effects of adiponectin(ADP) postconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury(MIRI) in rats and role of ADP/PI3K/Akt pathway in ADP postconditioning.MethodsSD rat was connected to ventilator by tracheal intubation under anesthesia, then left anterior descending coronary artery (LAD) was threaded between left auricle and pulmonary artery cone after exposing heart by surgery. MIRI model was induced by ligation of LAD for 30 min and the following reperfusion for 120 min. Rats were divided randomly into 5 groups (n=12):① Sham group: LAD was threaded without ligation; ② MIRI group; ③ADP group (ADP postconditioning) were subjected to intravenous injection of ADP when LAD ligation for 10 min and the ligation held for 20 min after that, then reperfusion for 120 min; ④ ADP+LY294002 group were subjected to injection of ADP and LY294002 when LAD ligation for 10 min, the other steps were the same as ADP group; ⑤ LY294002 group were subjected to injection of LY294002 when LAD ligation for 10 min, the other steps were the same as ADP group. Titers of lactate dehydrogenase(LDH) and cardiac troponin I(cTnI) in plasma were observed, expressions of PI3K, Akt, phosphorylated-Akt(p-Akt), ADP mRNA , ADPR1 mRNA and PI3k mRNA in myocardial tissue were measured.ResultsCompared with sham group, the levels of LDH and cTnI in MIRI group were increased (P<0.05); Compared with MIRI group, the levels of LDH and cTnI in ADP group were decreased (P<0.05); Compared with ADP group, the levels of LDH and cTnI were increased in LY294002 applying groups(P<0.05). Compared with MIRI group, the expressions of PI3K, p-Akt, ADP mRNA, ADPR1 mRNA and PI3K mRNA were increased in ADP group (P<0.05), the above mentioned 5 parameters in LY294002 applying groups were decreased(P<0.05).ConclusionADP postconditioning could reduce MIRI in rats, the protective effect might have relation to ADP/PI3k/Akt pathway.

adiponectin; ischemic postconditioning; myocardial ischemia/reperfusion injury; signalling pathway; PI3K; p-Akt; rat

R363.2

A

1000-6834(2017)04-308-06

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金資助(XYBSKYZZ 201634)

2016-11-28

2017-05-15

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Tel： 15893803331； E-mail： nic315@sina.com

10.12047/j.cjap.5531.2017.075