右美托咪啶對肺缺血/再灌注誘發(fā)小鼠腎臟超微結構改變的影響*

項冰倩, 高 慧, 羅梓垠, 方周溪, 王萬鐵△

(1. 溫州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院缺血/再灌注損傷研究所， 2. 溫州醫(yī)科大學電鏡室， 浙江 溫州 325035)

右美托咪啶對肺缺血/再灌注誘發(fā)小鼠腎臟超微結構改變的影響*

項冰倩1, 高 慧1, 羅梓垠1, 方周溪2△, 王萬鐵1△

(1. 溫州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院缺血/再灌注損傷研究所， 2. 溫州醫(yī)科大學電鏡室， 浙江 溫州 325035)

目的評價右美托咪啶對小鼠肺缺血/再灌注誘發(fā)腎臟損傷的影響。方法雄性健康SPF級C57BL/6J小鼠50只，體重20 g～24 g，8～10周齡，采用隨機數字表法，將其分為5組(n=10)：假手術組(sham組)、肺缺血/再灌注損傷組( I/R組)、肺缺血/再灌注+生理鹽水組(NS組)、右美托咪啶組(Dex組)、右美托咪啶+阿替美唑(Atip)(DA組)。采用小鼠在體左側肺門夾閉30 min再灌注180 min方法制備肺缺血/再灌注損傷(I/R)模型。Dex組在肺門阻斷前30 min腹腔注射右美托咪啶20 μg/kg，NS組為用同Dex組等體積的生理鹽水替代Dex，DA組腹腔注射右美托咪啶(20 μg/kg )+阿替美唑(250 μg/kg)，其余處理同I/R組。再灌注結束后靜脈取血ELISA法檢測血漿中IL-1β和TNF-α濃度; 取雙腎組織，透射電鏡下觀察腎組織病理學結果。結果與對照組相比，其余組血漿IL-1β和TNF-α濃度明顯升高，腎組織病理學損傷明顯加重；與I/R、NS、DA組相比，Dex組IL-1β和TNF-α濃度明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且腎組織超微結構損傷有所減輕。結論右美托咪啶預先給藥可減輕小鼠肺缺血/再灌注誘發(fā)腎臟損傷，其機制可能與抑制炎性反應有關。

右美托咪啶；缺血/再灌注損傷；腎；IL-1β; TNF-α

肺缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是圍手術期常見并發(fā)癥之一，是臨床常見的病理過程，多見于肺溶栓治療、肺移植、肺動脈袖狀切除、心肺聯(lián)合移植等手術治療。肺缺血/再灌注損傷常引發(fā)急性肺損傷，同時也伴隨遠隔器官的功能障礙和病理性損傷，如心臟、肝臟及腎臟等。腎臟毛細血管豐富，對肺I/R反應中的促炎因子較為敏感，使之容易發(fā)生急性腎損傷(acute kidney injury, AKI), 當肺I/R合并腎臟損傷時，可明顯增加死亡率。而目前為止，尚無一種有效的藥物或治療措施可以防治肺缺血/再灌注引起的腎損傷。因此，尋找有效的方法來防治肺I/R及肺I/R引起的腎損傷迫在眉睫。

右美托咪啶是高選擇性α2腎上腺素能受體激動藥，我們前期的研究結果表明，肺臟缺血前給予右美托咪啶可降低促炎介質和炎性因子，從而減輕肺缺血/再灌注損傷，具有肺臟保護作用，而其對肺I/R誘發(fā)的腎損傷是否也具有同樣的保護作用？目前國內外尚未見有關報道，還有待我們進一步探討。本研究擬觀察右美托咪啶預處理對肺I/R誘發(fā)的腎損傷的影響及可能機制，為臨床提供參考依據，也為進一步探討缺血/再灌注引發(fā)的遠隔器官損傷提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性健康SPF級C57BL/6J小鼠50只，體重20 g～24 g，8～10周齡，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供【SYXK(浙)2012-075】。采用隨機數字表法，將其分為5組(n=10)：對照組(sham組)、缺血/再灌注損傷組( I/R組)、缺血/再灌注+生理鹽水組(NS組)、右美托咪啶組(Dex組)、右美托咪啶+阿替美唑組(DA組)。

1.2 小鼠肺缺血/再灌注模型制備

采用C57BL/6J小鼠在體左側肺門夾閉30 min再灌注180 min方法制備肺缺血/再灌注損傷(I/R)模型。100 mg/kg氯胺酮(福建古田藥業(yè)有限公司，中國)+10 mg/kg塞拉嗪(吉林長春華牧有限公司，中國)聯(lián)合腹腔注射進行麻醉。消毒胸頸部皮膚后切開并分離皮下組織和肌肉，暴露氣管行T型切口切開，置人22號動脈穿刺針針芯外套管氣管插管，接小動物呼吸機行機械通氣,調節(jié)呼吸機參數為：呼吸頻率RR=120 counts/min，吸呼比為2∶3，氧濃度100%，潮氣量0.6～0.8 ml/min。于小鼠左胸部2、3肋間心臟搏動最明顯處開胸，暴露并游離左側肺門，用無損傷動脈夾阻斷左肺門缺血缺氧30 min，期間用鹽水紗布覆蓋左胸切口，30 min后松開動脈夾再灌注180 min。術中檢測體溫，維持體溫36.5～37.5℃,按需追加麻醉藥物。灌注結束后靜脈取血，處死小鼠留取腎臟組織 。sham組僅行開胸處理，不夾閉肺門，機械通氣210 min； I/R組：開胸后行左側肺門阻斷30 min,再灌注180 min；NS組、Dex組、DA組分別在肺門阻斷前30 min腹腔注射同Dex組等體積的生理鹽水、右美托咪啶(20 μg/kg，江蘇恒瑞制藥有限公司，中國)和右美托咪啶(20 μg/kg)+阿替美唑(250 μg/kg)，其余處理同I/R組。

1.3 ELISA法檢測血漿中IL-1β和TNF-α濃度

各組小鼠分別于再灌注結束時取血3 ml，離心機3 000 r/min (4℃)，15 min，取上清液-70℃保存。BCA試劑盒對各組血漿進行蛋白定量，按白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒操作說明書分別進行IL-1β、TNF-α濃度的檢測。

1.4 電鏡下腎臟組織超微結構的觀察

各組于再灌注結束后迅速取出腎臟組織，放置于蠟板上，滴上2.5%戊二醛固定液，用雙刀切割法切取腎臟皮質部分約1 mm3大小若干塊，然后再浸入裝有2.5%戊二醛固定液的標本瓶內，并放置于4℃冰箱內固定2 h以上，依次經1%鋨酸后固定，1%醋酸鈾塊染，丙酮梯度脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋劑包埋聚合，半薄切片光鏡定位于腎小球并超薄切片，經醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，H-7500透射電鏡下觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠血漿中IL-1β和TNF-α濃度的變化

與sham組相比，其余組血漿中IL-1β和TNF-α濃度明顯上升(P<0.01)。與I/R、NS組相比，Dex組IL-1β、TNF-α濃度明顯降低(P<0.01)。與Dex組相比，DA組血漿中IL-1β、TNF-α濃度上升明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。I/R、NS和DA組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

GroupIL?1β(pg/ml)TNF?α(pg/ml)Sham3．94±3．1021．25±5．40I/R15．59±1．75??63．25±6．13??NS18．26±6．84??##61．50±4．04??##Dex7．28±3．06??ΔΔ34．25±5．85??ΔΔDA18．85±3．52??##66．75±11．87??#

IL-1β: Interleukin-1β; TNF-α: Tumor necrosis factor-α； Sham: Sham group; I/R: Lung ischemia/reperfusion group; NS: Normal saline group; Dex: Dexmedetomidine group; DA: Dexmedetomidine and atipamezole group

**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsDex group;ΔΔP<0.01vsI/R group

2.2各組小鼠透射電鏡下腎組織超微結構變化情況

2.2.1 Sham組腎臟無明顯損傷，腎組織超微結構無明顯改變 電鏡下可見腎小球結構正常，毛細血管腔充盈完好，內皮細胞結構基本正常，吞飲小泡較豐富，內皮窗孔清晰?；啄ず癖【鶆?，足突排列整齊、裂孔清晰，足細胞結構基本正常。系膜區(qū)及系膜細胞結構基本正常。近曲小管基膜完整，細胞間連接緊密。上皮細胞核膜清晰，線粒體呈長桿狀，數目豐富，嵴清晰，高爾基體、核糖體較豐富；微絨毛豐富，排列整齊。遠曲小管上皮細胞結構基本正常，線粒體較豐富，微絨毛較多(圖1-1A-1D)。

2.2.2 I/R組腎臟有較明顯的損傷，腎組織超微結構可見損傷性變化 電鏡下可見腎小球結構局部損傷，可見部分毛細血管腔有狹窄和淤血現象，有的可見中性粒細胞附壁現象，部分內皮細胞出現腫脹現象，個別細胞空泡化較明顯，有的出現與基底膜局部分離現象，吞飲小泡比假手術組略微增多，內皮窗孔增大?；啄ぢ杂懈淖?，局部出現隆凸、疏松和厚薄不均現象；足細胞結構尚正常，僅見局部足突腫脹，或存在輕微融合現象，排列較不規(guī)則，裂孔尚清晰。系膜區(qū)及系膜細胞未見明顯改變。近曲小管基膜基本完整，部分上皮細胞腫脹較明顯，部分核膜模糊，線粒體散在分布，部分出現腫脹現象，部分基質濃聚，嵴斷裂；高爾基體、核糖體略微減少；微絨毛排列紊亂、稀疏，部分腔內可見板層樣小體沉積；細胞間連接較為疏松。遠曲小管上皮細胞基膜基本完整，個別細胞出現水腫或線粒體腫脹等現象。腎間質可見炎細胞局部浸潤(圖1-2A-2D)。

2.2.3 NS組腎臟亦有損傷，腎組織超微結構與肺I/R組相近 電鏡下腎臟超微結構的改變與肺缺血/再灌注組相近，可見腎小球局部損傷，部分毛細血管腔狹窄閉塞，部分內皮細胞腫脹、空泡化，胞漿疏松水腫，吞飲小泡較假手術組略微增多，內皮窗孔增大。基底膜局部隆凸、松解；局部足突腫脹、融合，排列紊亂。系膜區(qū)及系膜細胞未見明顯改變。近曲小管基膜基本完整，部分上皮細胞腫脹明顯，線粒體腫脹、空泡化，高爾基體、核糖體略微減少；微絨毛形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，部分小管腔內有蛋白和紅細胞滲出。細胞間連接較疏松。遠曲小管上皮細胞基膜基本正常，部分細胞出現線粒體腫脹，內質網擴張等現象。腎間質炎細胞局部浸潤(圖1-3A-3D)。

2.2.4 Dex組腎損傷減輕，腎組織超微結構可見輕微的損傷性變化 與肺缺血/再灌注組和生理鹽水組相比，右美托咪啶組腎組織損害減輕較明顯，電鏡下表現為：腎小球結構基本正常，局部有輕微的損傷，毛細血管腔充盈完好，個別內皮細胞出現腫脹、空泡等現象，吞飲小泡數目較多，內皮窗孔基本清晰。基底膜大體上呈連續(xù)完整厚薄一致的形態(tài)，部分模糊、融合；足細胞結構尚正常，足突基本完整，排列整齊，無明顯腫脹。系膜區(qū)及系膜細胞未見明顯改變。近曲小管基膜基本完整，上皮細胞損傷、壞死、刷狀緣的脫落減少；線粒體數目較多，個別線粒體膜稍模糊，略微腫脹變形；微絨毛數目略微減少，排列稍紊亂，少部分出現腫脹、空泡變性；細胞間連接較為緊密；遠曲小管上皮細胞基膜基本完整，細胞水腫或線粒體腫脹等現象明顯減輕，腎間質未見明顯改變，有少量炎細胞浸潤(圖1-4A-4D)。

2.2.5 DA組腎損傷較明顯，電鏡下可見損傷性變化 電鏡下可觀察到，腎小球結構局部損傷明顯，部分毛細血管腔有輕微狹窄，部分內皮細胞出現水腫、空泡和溶解，且有與基底膜局部分離現象，內皮窗孔略微增大?；啄こ霈F局部隆凸、疏松分層和厚薄不均的現象；局部足突腫脹、空泡變性，排列不規(guī)則，足細胞核輕微固縮；系膜區(qū)及系膜細胞結構未見明顯改變。近曲小管基膜大致完整，部分上皮細胞水腫，空泡變性以及壞死脫落，線粒體腫脹疏松，內質網擴張；微絨毛排列紊亂、稀疏，數目較右美托咪啶組減少；細胞間連接較為疏松。遠曲小管上皮細胞基膜基本完整，部分細胞水腫、線粒體腫脹。腎間質有局灶性炎性細胞浸潤(圖1-5A-5D)。

Fig.1The changes of kidney tissue ultrastructure in each group (×10000) 1: Sham group; 2: Lung ischemia/reperfusion group; 3: Normal saline group; 4: Dexmedetomidine group; 5: Dexmedetomidine and atipamezole group; A, B: Glomerulus; C, D: Kidney tubule

3 討論

右美托咪啶為高選擇性α2腎上腺素能受體激動藥，具有劑量依賴性的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮作用，同時降低交感神經張力，間接提高迷走神經張力，激活膽堿能抗炎通路，具有抗炎、器官保護作用[1-2]。實驗研究結果表明，右美托咪啶有很好的圍術期器官保護作用，能夠有效改善術中缺血對器官的損傷，對缺血/再灌注損傷器官有很好的保護作用[3-5]。

本實驗顯示，與假手術組相比，肺I/R組血漿中IL-1β和TNF-α濃度明顯升高，透射電鏡下腎組織明顯損傷，腎小球足突與基底膜局部腫脹、隆凸；腎小管上皮細胞和線粒體腫脹，微絨毛大部分消失，說明肺缺血/再灌注的確引發(fā)了遠隔器官腎臟的損傷。NS組和DA組的血漿IL-1β和TNF-α濃度升高亦較顯著，腎組織電鏡下超微結構的變化與肺I/R組相近。與肺I/R組相比，Dex組的血漿IL-1β和TNF-α濃度明顯下降，且腎組織損害亦明顯減輕，電鏡下可觀察到腎小球足突與基底膜基本完整，腎小管微絨毛部分輕微腫脹、空泡變性。說明右美托咪啶預處理能夠抑制炎癥反應，降低促炎介質IL-1β、TNF-α水平，減輕肺I/R誘發(fā)的腎損傷，對腎臟有一定的保護作用。而這一保護作用能被選擇性α2-腎上腺素受體阻滯劑阿替美唑所阻斷，提示右美托咪啶保護肺缺血/再灌注誘發(fā)的腎損傷可能與激動α2-腎上腺素能受體有關。與此同時，Chen等[6]研究發(fā)現，肺缺血/再灌注不僅可導致自身受損，還可損害肺外遠端多種器官如心、腦、腎、肝臟和胃腸道等。肺缺血/再灌注誘發(fā)腎臟損傷的機制可能與炎性反應增強有關。炎癥反應是缺血/再灌注損傷最主要特征之一, 在肺缺血/再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關鍵的作用，急性腎損傷的發(fā)生可能與多種炎癥因子激活密切相關。肺缺血/再灌注后，會產生大量促炎細胞因子和趨化因子，促炎因子有助于激活炎癥因子的大量釋放，包括TNF-α、IL-1和IL-6等，TNF-α可誘發(fā)其他炎性因子如IL-8的釋放。IL-6可誘發(fā)中性粒細胞釋放大量彈性蛋白酶損傷腎組織。細胞因子釋放入血后可加劇應激反應，干擾免疫系統(tǒng)功能，從而導致遠隔器官腎臟受損[7],引發(fā)如急性腎損傷為特征的多器官功能衰竭，是最終導致全身炎癥反應綜合征(SIRS)的重要因素之一。并且研究發(fā)現[8-13]，通過激動α2-腎上腺素能受體，抑制TLR4/NF-κB通路的活化能夠減輕炎癥反應，對組織損傷有一定積極的保護作用。簡言之，在肺缺血/再灌注誘發(fā)的腎損傷中，腎組織發(fā)生的失控性炎癥反應、大量致炎因子和活性氧物質的產生以及多形核中性粒細胞(PMN)在腎臟大量聚集是其發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[14]。中性粒細胞激活、氧自由基釋放及炎性細胞因子釋放等機制是肺缺血/再灌注累及遠隔重要臟器損傷的主要病理生理機制[15-18]。

綜上所述，肺缺血/再灌注前給予右美托咪啶可減輕肺缺血/再灌注誘發(fā)的腎臟損傷，其機制可能與激動α2-腎上腺素能受體，抑制炎癥反應，降低促炎因子IL-1β和TNF-α，減輕全身炎癥反應對腎組織的損傷有關。

[1] 羅梓垠, 郭長滿, 項冰倩, 等. 右美托咪定對肺缺血/再灌注損傷小鼠內質網應激相關分子Caspase-12表達的影響[J].中國應用生理學雜志, 2016, 32(2): 164-168.

[2] Mantz J, Josserand J, Hamada S. Dexmedetomidine:new insights[J].EurJAnaesthesiol, 2011, 28(1): 3-6.

[3] 何金波, 宋 冬, 羅梓垠, 等. 右美托咪定對大鼠I/R損傷肺組織TLR4表達及保護作用的影響[J]. 中國應用生理學雜志, 2016, 32(4): 356-360.

[4] Luan HF, Zhao ZB, Feng JY.etal. Prevention of etomidate-induced myoclonus during anesthetic induction by pretreatment with dexmedetomidine[J].BrazJMedBiolRes, 2015, 48(2): 186-190.

[5] Gertler R, Brown HC, Mitchell DH,etal. Dexmedetomidine:a novel sedative- analgesic agent[J].ProcBaylUnivMedCent, 2001, 14(1): 13-21.

[6] Park SW, Chen SW, Kim M,etal. Cytokines induce small intestine and liver injury after renal ischemia or nephrectomy[J].LabInvest, 2011, 91(1): 63-84.

[7] Riker RR, Shehabi Y, Bokesch PM,etal. Dexmedetomidine vs midazolam for sedation of critically ill patients: a randomized trial[J].JAMA, 2009, 301(5): 489-498.

[8] Mancek-Keber M, Jerala R. Postulates for validating TLR4 agonists[J].EurJImmunol, 2015, 45(2): 356-370.

[9] 黃翠源， 潘靈輝， 林 飛， 等. 肺泡巨噬細胞TLR4/MyD88信號通路參與并介導了機械通氣所致的肺損傷[J]. 細胞分子免疫學雜志， 2015， 31(2): 182-185.

[10]劉亞坤， 何金波， 陳海娥， 等. 血必凈注射液對缺氧/復氧大鼠心肌TLR4-NF-κB-TNF-α通路的影響[J]. 中國中西醫(yī)結合雜志， 2014, 34(12): 1463-1468.

[11]Xing B, Chen H, Wang L,etal. Ozone oxidative preconditioning protects the rat kidney from reperfusion injury via modulation of the TLR4-NF-κB pathway[J].ActaCirBras, 2015, 30(1): 60-66.

[12]何金波， 包財盈， 葉玉柱， 等. 缺氧/復氧大鼠心肌中IL-1β濃度的動態(tài)變化及意義[J]. 中國應用生理學雜志,2015, 31(1): 27-30.

[13]Hua F, Tang H, Wang J,etal. TAK-242, an antagonist for Toll-like receptor 4, protects against acute cerebral ischemia/reperfusion injury in mice[J].JCerebBloodFlowMetab, 2015, 35(4): 536-542.

[14]Carden DL, Granger DN. Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury[J].JPathol, 2000, 190(3): 255-266.

[15]Estebe JP, Davies JM, Richebe P. The pneumatic tourniquet: mechanical,ischaemia-reperfusion and systemic effects[J].EurJAnaesthesiol, 2011, 28(6): 404-411.

[16]陳 月， 張加強， 孟凡民. 右美托咪定對肢體缺血/再灌注誘發(fā)肺損傷的影響[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志, 2015, 35(12): 1113-1115.

[17]Matthay MA, Folkesson HG, Clerici C. Lung epithelial fluid transport and the resolution of pulmonary edema[J].PhysiolRev, 2002, 82(3): 569-600.

[18]張莉莉, 毛仲霞, 趙 敏, 等. 右美托嘧啶復合芬太尼對心臟手術麻醉誘導期間血流動力學的影響[J]. 中國醫(yī)藥指南, 2012, 10(13): 132-133.

Effectofdexmedetomidineonrenalinjuryinducedbylungischemia/reperfusioninmice

XIANG Bing-qian1, GAO Hui1, LUO Zi-yin1, FANG Zhou-xi2△, WANG Wan-tie1

(1. Ischemia/Reperfusion Injury Research Institute, Wenzhou Medical University; 2. Department of Electron Microscopy, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

Objective: To evaluate the effect of dexmedetomidine(Dex) on renal injury induced by lung ischemia/reperfusion(I/R) in mice.MethodsFifty healthy SPF male C57BL/6J mice， weighing 20 g～24 g，aged 8～10 weeks，were randomly divided into five groups(n=10 each)：sham operation group(sham group)，lung ischemia/reperfusion group(I/R group), lung ischemia/reperfusion and normal saline group (NS group), dexmedetomidine group(Dex group) , dexmedetomidine and atipamezole group (DA group). Lung ischemia / reperfusion model was established by occlusion of the left pulmonary artery for 30 min followed by 180 min reperfusion in mice. In Dex and DA groups, dexmedetomidine 20 μg/kg and dexmedetomidine 20 μg/kg plus atipamezole 250 μg/kg were injected intraperitoneally respectively at 30 min before establishment of the model, isopyknic normal saline instead of Dex were injected intraperitoneally in NS group. After the experiment the mice were killed and plasma IL-1 beta and tumor necrosis factor α(TNF-α) concentration were detected by ELISA; the renal tissues were harvested to observe ultra structure under electron microscope.ResultsCompared with sham group, the concentrations of IL-1β and TNF-α in other groups were increased significantly and the structure damages of renal tissues observed under electron microscope in other groups were more serious than those of sham group. Compared with I/R group, NS groups and DA group, the concentrations of IL-1β and TNF-α in Dex group were significantly lower(P<0.05)and the structure damages of renal tissues observed under electron microscope in Dex group were slighter.ConclusionDexmedetomidine pretreatment can attenuate renal injury induced by lung ischemia/reperfusion and the mechanism may be related to inhibition of inflammatory responses.

dexmedetomidine; ischemia/reperfusion injury; renal; IL-1β; TNF-α

R363

A

1000-6834(2017)04-380-05

浙江省公益技術應用研究項目(2013C33168)；浙江省新苗人才計劃項目(2014R413043)；溫州市公益性科技計劃項目(Y20140652)

2016-10-08

2017-05-08

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Tel： 0577-86689817， 0577-86689818； E-mail： wwt@wmu.edu.cn， E-mail： fzx@wmu.edu.cn

10.12047/j.cjap.5500.2017.092