駝峰藤組織培養(yǎng)及快速繁殖

侯俊+王彩云+張翔宇+阮培均

摘要：以駝峰藤（Merrillanthus hainanensis）帶芽莖段為外植體，研究不同消毒方法及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)其離體培養(yǎng)及植株再生的影響，建立了駝峰藤離體快繁技術(shù)體系。結(jié)果表明，帶芽莖段的最佳消毒滅菌方法為75%乙醇浸泡20 s，0.1% HgCl2浸泡10 min；腋芽誘導(dǎo)的最適宜培養(yǎng)基為MS+2.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.10 mg/L GA3，誘導(dǎo)率可達(dá)81.11%；適宜腋芽增殖的培養(yǎng)基為MS+3.50 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA，增殖系數(shù)可達(dá)6.24；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.30 mg/L NAA，生根率為84.44%，該結(jié)果為駝峰藤的快繁提供了一條新途徑。

關(guān)鍵詞：駝峰藤（Merrillanthus hainanensis）；帶芽莖段；組織培養(yǎng)；快速繁殖

中圖分類號(hào)：Q813.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）17-3345-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.040

Tissue Culture and Rapid Propagation of Merrillanthus hainanensis

HOU Jun1， WANG Cai-yun2， ZHANG Xiang-yu2， RUAN Pei-jun2

（1.Poverty Alleviation and Development Office of Dafang County，Bijie 551700，Guizhou，China；

2.Bijie Institute of Traditional Chinese Medicine，Bijie 551700，Guizhou，China）

Abstract： In order to establish the tissue culture and rapid propagation system of Merrillanthus hainanensis，the effects of different disinfection method and plant growth regulators on plant regeneration in vitro were studied using stems with axillary buds as explants. The results showed that the better disinfection method for stems with axillary buds was to use 75% alcohol immersion 20 s，then use 0.1% HgCl2 immersion 10 min；the fittest medium for germination of stem axillary bud was MS+2.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.10 mg/L GA3，with a 81.11% germination rate of axillary bud. The best medium for shoot multiplication was MS+3.50 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA，the multiplication coefficient could reach 6.24. The best rooting medium was 1/2MS+0.30 mg/L NAA，with a 84.44% rooting rate. The research supplied a new way for rapid propagation of Merrillanthus hainanensis.

Key words： Merrillanthus hainanensis；stems with axillary buds；tissue culture；rapid propagation

駝峰藤（Merrillanthus hainanensis）是蘿藦科駝峰藤屬木質(zhì)藤本植物，為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，中國(guó)特有物種[1-3]，生長(zhǎng)于低海拔至中海拔山地林谷中，主要分布于高要、保亭、萬(wàn)寧和白沙等地[4-6]，具有一定的觀賞和藥用價(jià)值[7]。駝峰藤作為一種稀少的藤本植物，保護(hù)其種群、開(kāi)發(fā)其價(jià)值意義深遠(yuǎn)。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于駝峰藤的研究甚少，主要集中于形態(tài)學(xué)研究及野生資源調(diào)查，有關(guān)駝峰藤的組織培養(yǎng)及獲得再生植株的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以駝峰藤的莖段為試驗(yàn)材料，研究了外植體的消毒、初代培養(yǎng)、繼代增殖、生根等一系列過(guò)程，獲得了完整的駝峰藤組培苗，為駝峰藤的物種保存和快速繁殖提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)，也為駝峰藤的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

駝峰藤莖段采自海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院熱帶珍稀植物保護(hù)與利用實(shí)驗(yàn)室種植的無(wú)病蟲(chóng)害植株上。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 將采集的莖段去除葉片，用自來(lái)水沖洗10～15 min，然后在適量的洗潔精水中浸泡15 min，用自來(lái)水沖洗干凈后置于超凈工作臺(tái)中，用75%的乙醇及0.1%HgCl2消毒滅菌，設(shè)置不同時(shí)間梯度消毒處理，如表1所示。消毒過(guò)程中用鑷子不斷攪動(dòng)，無(wú)菌水沖洗6～7遍，用無(wú)菌濾紙吸干莖段表面的水分，再用無(wú)菌刀片切掉兩端后，將帶芽莖段接種到初代培養(yǎng)基中，15 d后統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率及成活率。為防止交叉污染，每個(gè)組培瓶接種1個(gè)外植體，每個(gè)組合接種30瓶，重復(fù)3次。污染率=（污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%；死亡率=（死亡不污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%；成活率=（萌發(fā)不污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。endprint

1.2.2 腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 將消毒好的腋芽莖段接種在含6-BA（1.00、2.00、3.00 mg/L）、NAA（0.05、0.10、0.15 mg/L）和GA3（0、0.05、0.10 mg/L）的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)（表2），暗培養(yǎng)5 d后轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)腋芽誘導(dǎo)率及腋芽生長(zhǎng)情況，每個(gè)組合接種10瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，重復(fù)3次。腋芽誘導(dǎo)率=（萌芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)的腋芽切下后轉(zhuǎn)接到含6-BA（1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mg/L）和NAA（0.15 mg/L）的繼代增殖培養(yǎng)基中（表3），在光照條件下培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。每個(gè)處理接種30瓶，每瓶接種1個(gè)不定芽，重復(fù)3次。增殖系數(shù)=增殖后獲得的芽數(shù)/接種時(shí)的芽數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng) 切取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致（高2～3 cm）的芽苗接種在分別含NAA（0、0.10、0.30、0.50 mg/L）的1/2MS、MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)（表4），光照培養(yǎng)下30 d后統(tǒng)計(jì)生根率、生根數(shù)及根長(zhǎng)。每個(gè)處理接種30瓶，每瓶接種1個(gè)芽，重復(fù)3次。生根率=（生根的芽總數(shù)/接種芽總數(shù)）×100%。

1.2.5 培養(yǎng)條件 以MS為基本培養(yǎng)基，含蔗糖30 g/L（生根培養(yǎng)基蔗糖含量為20 g/L），卡拉膠7 g/L，pH為5.8～6.0，121 ℃高溫滅菌20 min。光照度 1 500～2 000 lx，光照時(shí)間為10～12 h/d，培養(yǎng)溫度24～26 ℃。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Excel及IBM SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒處理

如表1所示，消毒時(shí)間過(guò)短污染率較高，消毒時(shí)間較長(zhǎng)外植體死亡率較高，不利于腋芽的萌發(fā)。當(dāng)乙醇消毒時(shí)間為20 s時(shí)，隨著HgCl2消毒時(shí)間的增長(zhǎng)，污染率逐漸下降，但莖段死亡數(shù)量逐漸增加；當(dāng) HgCl2消毒時(shí)間10 min時(shí)，隨著乙醇消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，莖段死亡率逐漸增加，污染率下降。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，A6的平均成活率與其他處理差異極顯著，且平均污染率最低，平均成活率最高，消毒效果最好。因此，最適合駝峰藤莖段的滅菌消毒方法為75%乙醇浸泡20 s，0.1%HgCl2浸泡10 min。

2.2 初代培養(yǎng)

將消毒好的駝峰藤莖段接種在腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（表2），光照條件下培養(yǎng)15 d左右，腋芽開(kāi)始萌發(fā)（圖1A、C），繼續(xù)培養(yǎng)15 d后腋芽高度可達(dá)2 cm左右。由表2可知，B5組誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽莖較粗壯，葉色濃綠，形態(tài)與實(shí)生苗相似，長(zhǎng)勢(shì)良好（圖1B），且腋芽誘導(dǎo)率與其他處理差異達(dá)極顯著水平，不定芽誘導(dǎo)率為81.11%，誘導(dǎo)效果最好。因此，適合駝峰藤莖段腋芽萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為MS+2.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.10 mg/L GA3。

2.3 繼代增殖培養(yǎng)

將初代培養(yǎng)的腋芽切下接種到繼代增殖培養(yǎng)基中，由表3可知，當(dāng)NAA濃度不變時(shí)，6-BA濃度在1.50～3.50 mg/L范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的不斷升高，芽的增殖系數(shù)逐漸升高，腋芽逐漸變細(xì)、顏色逐漸變淺，當(dāng)6-BA濃度達(dá)2.50 mg/L時(shí)，腋芽顏色深綠，莖桿較粗（圖2A）；當(dāng)6-BA濃度達(dá)3.50 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)最大，為6.24，且與其他處理的增殖系數(shù)差異達(dá)極顯著水平，此時(shí)腋芽顏色偏黃，莖桿較細(xì)（圖2B）；當(dāng)6-BA濃度達(dá)4.00 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)開(kāi)始下降。

2.4 生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)中2～3 cm的腋芽接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行根系誘導(dǎo)（表4），15 d后基部有根系產(chǎn)生，繼續(xù)培養(yǎng)15 d后根系較長(zhǎng)。由表4可知，在未加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的D1組中，腋芽的生根率為0，在培養(yǎng)基中添加0.10 mg/L NAA時(shí)，開(kāi)始有根系長(zhǎng)出，但根系不發(fā)達(dá)，表現(xiàn)為根短而少；同等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑條件下，1/2MS培養(yǎng)基的生根效果高于MS培養(yǎng)基的生根效果；隨著NAA濃度的升高，根系越長(zhǎng)，其中D4處理駝峰藤平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)，為2.49 cm，與其他處理差異達(dá)到極顯著水平；在1/2MS培養(yǎng)基中加入0.30 mg/L NAA后，生根率和生根數(shù)整體增加，生根的組培苗長(zhǎng)勢(shì)最好。因此，適合駝峰藤腋芽生根的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.30 mg/L NAA，其生根率最高，為84.44%，平均生根數(shù)為5.25條，與其他生根處理差異極顯著，此時(shí)的平均根長(zhǎng)為1.87 cm。

3 結(jié)論與討論

外植體的選擇在植物離體快繁體系的建立中至關(guān)重要[8]，而外植體的消毒及無(wú)菌材料的獲得是植物組織培養(yǎng)成功的前提[9]。本研究預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)第四節(jié)以下的莖段消毒非常困難，其污染率非常高，可能是在環(huán)境中生長(zhǎng)的時(shí)間較長(zhǎng)，且老莖表面較粗糙，造成消毒困難。因此，在正式試驗(yàn)階段，選用的莖段均從長(zhǎng)勢(shì)良好的植株上切下，并選用前四節(jié)作為外植體，在很大程度上減輕了消毒的難度，但部分莖段在培養(yǎng)20 d以后，仍會(huì)出現(xiàn)污染現(xiàn)象，可能是外植體本身含有內(nèi)生菌的緣故。前人研究表明，多年生木本植物和生長(zhǎng)在高溫多雨的亞熱帶、熱帶植株容易表現(xiàn)內(nèi)源細(xì)菌污染，且內(nèi)生菌污染在前期會(huì)導(dǎo)致組培苗增殖率低、生長(zhǎng)緩慢，更會(huì)導(dǎo)致組培苗死亡及后期移栽困難[10-13]。本研究發(fā)現(xiàn)駝峰藤木質(zhì)化程度較高的莖段帶有內(nèi)生菌，因此盡量選擇半木質(zhì)化的莖段作為外植體，在后期繼代過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有污染的腋芽，應(yīng)及時(shí)剔除，以防影響其他無(wú)菌苗，至于內(nèi)生菌的抑制及清除還需在后續(xù)的抗生素選擇試驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

在植物組織培養(yǎng)中，內(nèi)源性激素形成速度慢，一般無(wú)法滿足植株生長(zhǎng)需求，因此植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用是誘導(dǎo)植物分化芽和根的關(guān)鍵[14]。本試驗(yàn)中，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2.00 mg/L 6-BA、0.10 mg/L NAA、0.10 mg/L GA3后駝峰藤腋芽的誘導(dǎo)率最高，且此時(shí)的腋芽粗壯，葉色濃綠，形態(tài)與實(shí)生苗相似，長(zhǎng)勢(shì)良好，這與吳玲利等[15]對(duì)白木通（Akebia trifoliata）的快速繁殖研究結(jié)果類似。endprint

繼代增殖是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，找到適宜的增殖培養(yǎng)基配方，才能達(dá)到組培快速繁殖的目的[16]。在腋芽繼代增殖過(guò)程中，6-BA和NAA組合是最常用的方法[17，18]。在駝峰藤腋芽繼代增殖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，添加6-BA和NAA能促進(jìn)腋芽增殖，且6-BA對(duì)腋芽增殖誘導(dǎo)的效果明顯，但使用過(guò)程中需要控制好濃度，過(guò)高濃度會(huì)抑制小芽生長(zhǎng)，并導(dǎo)致腋芽增殖率的降低及玻璃化苗的出現(xiàn)，這與遆衛(wèi)國(guó)等[19]在鹽節(jié)木（Halocnemum strobilaceum）中的研究結(jié)果相符。

在生根培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，葉片較多、幼嫩、健壯的腋芽是生根的基礎(chǔ)，培養(yǎng)時(shí)間太久的芽苗木質(zhì)化程度高，不利于生根培養(yǎng)，這與譚曉風(fēng)等[20]在油桐（Vernicia fordii）試管苗生根的結(jié)果相似。本研究選用1/2MS、MS兩種營(yíng)養(yǎng)成分及濃度差異較大的基本培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)駝峰藤組培苗在1/2MS培養(yǎng)基中的生根效果優(yōu)于MS培養(yǎng)基，說(shuō)明降低無(wú)機(jī)鹽的濃度更有利于根的誘導(dǎo)，這與付姝穎等[21]在藥用植物猴耳環(huán)（Pithecellobium clypearia）生根試驗(yàn)中的結(jié)果相一致。

適宜的生長(zhǎng)素水平和種類可以促進(jìn)植株根系的良好分化，而不同植物對(duì)生長(zhǎng)素的濃度和種類需求不同。在本試驗(yàn)中，NAA對(duì)駝峰藤叢生芽根系分化的誘導(dǎo)效果較好，最佳濃度為0.30～0.50 mg/L，能快速分化根系，且形成的根系多且粗壯，這與黃賽等[22]在土田七（Stahlianthus involucratus）中的研究結(jié)果相符；但NAA濃度過(guò)高生根率反而降低，這與洪震等[23]在秀麗野海棠（Bredia amoena）試管苗生根過(guò)程中的研究結(jié)果相一致。

本研究首次從莖段無(wú)菌材料的獲得、腋芽誘導(dǎo)、繼代增殖及生根培養(yǎng)整個(gè)過(guò)程成功建立了駝峰藤帶芽莖段的再生體系，為駝峰藤的工廠化育苗及物種保護(hù)打下基礎(chǔ)。

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