氯代阻燃劑得克隆對(duì)孔石莼(Ulva pertusa)繁殖及早期發(fā)育的影響

鞏寧，邵魁雙，張鈺昆，景德清，孫野青,#

1. 大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，大連1160262. 大連海事大學(xué)環(huán)境系統(tǒng)生物學(xué)研究所，大連1160263. 國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，大連116023

氯代阻燃劑得克隆對(duì)孔石莼(Ulva pertusa)繁殖及早期發(fā)育的影響

鞏寧1,2,*，邵魁雙3，張鈺昆1,2，景德清1,2，孫野青1,2,#

1. 大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，大連1160262. 大連海事大學(xué)環(huán)境系統(tǒng)生物學(xué)研究所，大連1160263. 國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，大連116023

得克隆(Dechlorane Plus, DP)是一種在全世界范圍內(nèi)廣泛使用的氯代阻燃劑，具有潛在的毒性效應(yīng)。但目前已有的生態(tài)毒理學(xué)數(shù)據(jù)還十分有限。本文選擇分布廣泛的大型綠藻孔石莼(Ulva pertusa)作為研究對(duì)象，探討不同濃度DP對(duì)孔石莼繁殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化及早期發(fā)育的影響。結(jié)果表明，低濃度(10-6～10-8mol·L-1)DP暴露不同程度地影響孔石莼繁殖細(xì)胞的形成、釋放及附著，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。與空白對(duì)照組相比，DP處理(10-6mol·L-1)分別使繁殖細(xì)胞的形成率、釋放率和附著率顯著降低了76.76%、46.26%和85.64%。在絲狀幼體階段，DP處理組(10-8和10-7mol·L-1)幼體體長(zhǎng)分別比對(duì)照組顯著減少了32.74%和38.98%。結(jié)果表明，DP暴露抑制了孔石莼的繁殖及早期發(fā)育?；诰G藻繁殖特性及早期發(fā)育的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)DP暴露較為敏感，能夠?yàn)楹Ｑ蟓h(huán)境的DP生物學(xué)效應(yīng)研究提供數(shù)據(jù)。

得克??；孔石莼；繁殖；早期發(fā)育

Received14 January 2017accepted21 March 2017

Abstract: Dechlorane Plus (DP) is a highly chlorinated flame retardant which is globally ubiquitous. However, limited information is available on its toxicity in aquatic organisms, especially for marine algae. In this study, the common green macroalgae Ulva pertusa was used to evaluate possible eco-toxicological response, including the reproduction and early development with the low-dose DP exposure (10-6to 10-8mol·L-1). The results showed that DP inhibited the reproductive cells formation, release and adhesion in dose-effect manner. After exposure to DP in the concentration of 10-6mol·L-1, the rate of formation, release and adhesion were significantly decreased by 76.76%, 46.26% and 85.64%, respectively. The length of filaments was decreased by 32.74% and 38.98%, respectively with 10-8and 10-7mol·L-1of DP treatments. Our observations firstly indicated that DP disrupted the transformation of reproductive cells of U. pertusa as well as their early development. Reproductive cells formation, release and adhesion in macroalgae were sensitive biomarkers which can be used for assessing the marine ecological risks of DP.

Keywords: Dechlorane Plus; Ulva pertusa; reproduction; early development

得克隆(Dechlorane Plus, DP)是一種人工合成的脂肪族氯代阻燃劑，化學(xué)名為雙(六氯環(huán)戊二烯)環(huán)辛烷，又名敵可燃。它呈白色粉末狀，分子量為653.72 g·mol-1，分子式為C18H12Cl12，具有順式(syn-DP)和反式(anti-DP)2種同分異構(gòu)體，在商品中以一定比例混合[1]。早在20世紀(jì)70年代，DP作為滅蟻靈的替代品被美國(guó)OxyChem化學(xué)公司發(fā)明并開(kāi)始生產(chǎn)。而后由于優(yōu)異的電化學(xué)性能、阻燃性和熱穩(wěn)定性，又被添加于電線(xiàn)、電纜、電子元器件、建材等產(chǎn)品的塑料、尼龍中。近年來(lái)，DP的年產(chǎn)量保持在500～5 000 t之間，被美國(guó)環(huán)保局(EPA)劃為高產(chǎn)量化學(xué)物(high production volume chemical, HPV)[2]。從2004年起，我國(guó)江蘇安邦電化有限公司(JiangsuAnpon Electrochemical Co.)也開(kāi)始投產(chǎn)生產(chǎn)，年產(chǎn)量大約300～1 000 t[3]。

作為一種添加型的阻燃劑，DP在產(chǎn)品的使用過(guò)程或廢棄后很容易釋放到環(huán)境中。人們發(fā)現(xiàn)，由于具有與持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants, POPs)類(lèi)似的結(jié)構(gòu)特征，它可能成為廣泛存在的環(huán)境污染物。但是直到2006年，Hoh等[1]才首次在北美五大湖地區(qū)的空氣、魚(yú)體及沉積物中發(fā)現(xiàn)DP。此后，DP陸續(xù)在全球多種環(huán)境介質(zhì)中被檢測(cè)到[4-10]，并在生產(chǎn)廠(chǎng)及電子廢棄物處理廠(chǎng)附近發(fā)現(xiàn)了較高濃度的DP[11-14]，且發(fā)現(xiàn)DP具有潛在的生物富集能力[15]。在我國(guó)的海洋環(huán)境中，DP在黃海[16-18]、東海[19]的海水、沉積物及生物樣品中均有檢出，說(shuō)明這些海域的生態(tài)系統(tǒng)受到了DP污染的威脅。

分布于近岸海域的底棲海藻是基巖食物鏈的基石，是植食動(dòng)物的餌料和海洋動(dòng)物的產(chǎn)卵場(chǎng)、孵化場(chǎng)及遮蔽所，對(duì)減緩近岸富營(yíng)養(yǎng)化起到了重要作用?？资?Ulva pertusa)是溫帶海域常見(jiàn)的一種大型綠藻，在潮間帶及大干潮線(xiàn)附近常常優(yōu)勢(shì)分布[30]，是進(jìn)行水質(zhì)監(jiān)測(cè)、養(yǎng)殖污染控制及水生毒性測(cè)試的常用物種[31]。在我們的前期工作中，發(fā)現(xiàn)DP暴露(28 d)對(duì)孔石莼成體的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制，并引起細(xì)胞的氧化損傷、光合作用抑制及生物富集效應(yīng)(數(shù)據(jù)另文發(fā)表)。但是，這些毒性效應(yīng)均在遠(yuǎn)高于環(huán)境濃度的暴露條件下(100 mg·L-1)出現(xiàn)，說(shuō)明對(duì)于DP這一類(lèi)低毒的化合物來(lái)說(shuō)，要明確其生態(tài)影響，需要選擇敏感性更高的受試階段進(jìn)行低劑量的長(zhǎng)期測(cè)試，更具有實(shí)際意義。

因此，本研究以孔石莼為受試生物，基于生活史進(jìn)程中最脆弱且關(guān)鍵的早期階段，通過(guò)對(duì)不同濃度DP暴露下繁殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、發(fā)育及早期幼體生長(zhǎng)的連續(xù)觀(guān)察及相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)的測(cè)定，探討DP對(duì)潮間帶綠藻的毒理學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而分析其對(duì)孔石莼種群增長(zhǎng)及海藻群落結(jié)構(gòu)變化的影響機(jī)制，以期為評(píng)估得克隆的海洋生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 孔石莼的采集與室內(nèi)馴化

實(shí)驗(yàn)用孔石莼(Ulva pertusa)采自遼寧省大連市黑石礁海域潮間帶(N38°52’, E121°33’)。選取自然條件下生長(zhǎng)狀態(tài)良好的孔石莼成體，帶回實(shí)驗(yàn)室后立即用消毒砂濾海水進(jìn)行反復(fù)清洗，用軟毛刷去除表面的雜質(zhì)及附著物。再置于1%的KI-I2溶液(1 g I2溶于100 mL水，因?yàn)镮2的溶解度低，加入KI增加溶解度)中浸泡5 min，用過(guò)濾消毒海水漂洗2～3次以去除原生動(dòng)物及雜藻。將藻體置于光照培養(yǎng)箱中用消毒海水馴化培養(yǎng)1周，添加f/2營(yíng)養(yǎng)鹽，培養(yǎng)條件為(15±1) ℃，2 000 Lux，光暗周期為12 h∶12 h，鹽度28～30。每3天補(bǔ)充一次因揮發(fā)而減少的海水。

1.1.2 DP測(cè)試液的配制

實(shí)驗(yàn)用得克隆(DP)由江蘇安邦電化公司生產(chǎn)(純度> 99%)。通過(guò)丙酮助溶法，獲得濃度為10-3mol·L-1的DP母液。配制方法為：在200 mL丙酮(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)中加入130.74 mg DP，置于磁力攪拌器上攪拌至全部溶解后轉(zhuǎn)移到棕色試劑瓶中于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

暴露實(shí)驗(yàn)時(shí)，吸取一定量母液加入已添加營(yíng)養(yǎng)鹽的消毒過(guò)濾海水中，配制成10-6～10-8mol·L-1的測(cè)試液。因此，測(cè)試液中助溶劑丙酮的最高用量為0.1%(在前期實(shí)驗(yàn)中確定，體積分?jǐn)?shù)< 0.1%丙酮不會(huì)對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)產(chǎn)生影響)。

1.2 孔石莼繁殖細(xì)胞的制備及早期發(fā)育過(guò)程觀(guān)察

挑選經(jīng)人工馴化后健康的孔石莼藻體，在藻體邊緣用手術(shù)刀片切割出邊長(zhǎng)< 5 mm的小片段，加入已添加營(yíng)養(yǎng)鹽的消毒過(guò)濾海水培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為(22±1) ℃，3 000 Lux，光暗周期為12 h∶12 h，鹽度28～30，每周更換一次培養(yǎng)液。定期將外植體片段置于顯微鏡(NIKON TE2000)下觀(guān)察，拍照記錄孔石莼繁殖細(xì)胞產(chǎn)生及發(fā)育進(jìn)程。

1.3 DP的毒性暴露實(shí)驗(yàn)

挑選經(jīng)人工馴化后健康的孔石莼藻體，在藻體邊緣用打孔器打出直徑約3 mm的藻片若干。選擇邊緣完整的藻片隨機(jī)分成5組，放入6 cm培養(yǎng)皿中，每組30片，分別加入不同濃度的DP(0、10-6、10-7和10-8mol·L-1)測(cè)試液進(jìn)行毒性暴露。同時(shí)設(shè)定助溶劑對(duì)照組(丙酮最高添加量0.1%)。每周更換一次測(cè)試液。

1.4 孔石莼繁殖細(xì)胞的形成與形成率的測(cè)定

培養(yǎng)1周左右后，藻片邊緣營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞開(kāi)始轉(zhuǎn)化為繁殖細(xì)胞。二者在細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)上有顯著差異，可通過(guò)鏡下觀(guān)察進(jìn)行有效區(qū)分。在空白對(duì)照組藻片中有超過(guò)40%的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，開(kāi)始對(duì)各組的繁殖細(xì)胞形成率進(jìn)行測(cè)定。每組觀(guān)察30枚藻片，每枚藻片拍攝10張照片。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，利用Image J軟件對(duì)所有照片進(jìn)行分析、測(cè)定，劃定繁殖細(xì)胞形成區(qū)域。將該區(qū)域面積記為S1，觀(guān)察區(qū)域總面積記為S2。每枚藻片的繁殖細(xì)胞形成率(reproductive cellsformationrate, RCF)可表示為：

RCF% =S1/S2×100%

(1)

1.5 孔石莼繁殖細(xì)胞的放散與放散率的測(cè)定

孔石莼繁殖細(xì)胞成熟后會(huì)陸續(xù)放散。已放散的區(qū)域藻片呈白色，未放散區(qū)域藻片呈綠色，可通過(guò)肉眼及鏡下觀(guān)察有效區(qū)分。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)的觀(guān)察，選擇在DP暴露后10 d，利用體視顯微鏡(Motic SMZ-168)對(duì)藻片進(jìn)行觀(guān)察和拍照。利用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理和分析。通過(guò)顏色差異對(duì)已放散和未放散區(qū)域進(jìn)行識(shí)別和面積計(jì)算。已放散面積記為S3，觀(guān)察區(qū)域總面積記為S4。繁殖細(xì)胞放散率(reproductive cells release rate, RCR)可表示為：

RCR% =S3/S4×100%

(2)

1.6 孔石莼繁殖細(xì)胞的附著與相對(duì)附著率的測(cè)定

孔石莼繁殖細(xì)胞放散后會(huì)很快附著。在培養(yǎng)皿底部放置載玻片，選擇DP暴露后14 d將載玻片取出置于顯微鏡下觀(guān)察計(jì)數(shù)。每個(gè)載玻片上隨機(jī)選取30個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)附著的細(xì)胞數(shù)量。將空白對(duì)照組的附著率記為100%，計(jì)算其他各組的相對(duì)附著率(relative adhesion rate, RA)。

1.7 孔石莼幼體早期生長(zhǎng)發(fā)育的觀(guān)察及幼體生長(zhǎng)率的測(cè)定

附著在載玻片上的孔石莼繁殖細(xì)胞萌發(fā)后，會(huì)進(jìn)行縱向分裂形成早期絲狀幼體。將幼體(外植體培養(yǎng)約30 d)暴露于不同濃度的DP測(cè)試液中(組別設(shè)置同1.3)，每周更換一次測(cè)試液。于暴露后15 d將載玻片取出置于體視顯微鏡下觀(guān)察孔石莼幼體生長(zhǎng)情況并拍照。利用Motic Images Advanced 3.2軟件測(cè)量孔石莼幼體的長(zhǎng)度。測(cè)量記錄指定區(qū)域內(nèi)30個(gè)孔石莼幼體的長(zhǎng)度，計(jì)算每組長(zhǎng)度的平均值。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用EXCEL軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。采用ANOVA方法分析空白對(duì)照組與丙酮對(duì)照組及各DP暴露組之間的差異，P < 0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 孔石莼繁殖細(xì)胞的誘導(dǎo)及早期發(fā)育過(guò)程觀(guān)察

野外采集的孔石莼成體(圖1，a)進(jìn)行室內(nèi)馴化，選取健康的藻體切割成邊長(zhǎng)5 mm以下的外植體片段，在(22±1) ℃，3 000 Lux的條件下培養(yǎng)5～7 d。外植體由邊緣細(xì)胞開(kāi)始，逐漸出現(xiàn)原生質(zhì)濃縮、質(zhì)壁分離的現(xiàn)象。隨后，這些濃縮的原生質(zhì)開(kāi)始分裂，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為繁殖細(xì)胞(圖1，b)。當(dāng)繁殖細(xì)胞成熟后，放散到水中，具有2根鞭毛，可以游動(dòng)(圖1，c)。放散后的繁殖細(xì)胞很快附著變圓并失去鞭毛(圖1，d)，細(xì)胞體積增大并開(kāi)始萌發(fā)，進(jìn)行第一次分裂(圖1，e)。第一次分裂后的細(xì)胞出現(xiàn)了藻體的極性分化(圖1，f)，其中一個(gè)細(xì)胞形成假根，另外一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次橫分裂形成十幾個(gè)細(xì)胞組成的單列絲狀體(圖1，g)。以上為孔石莼外植體的早期發(fā)育過(guò)程。再經(jīng)過(guò)幾十天的培養(yǎng)，單列絲狀體通過(guò)縱分裂形成膜狀體，進(jìn)一步發(fā)育形成肉眼可見(jiàn)的孔石莼幼苗(圖1，h)。

通過(guò)以上連續(xù)培養(yǎng)，確定在孔石莼外植體片段培養(yǎng)的第7、10及14天進(jìn)行觀(guān)察，分別測(cè)定繁殖細(xì)胞的形成率、放散率和附著率，選擇孔石莼早期發(fā)育的單列絲狀體階段(外植體培養(yǎng)45 d)測(cè)定幼體體長(zhǎng)。

圖1 孔石莼繁殖細(xì)胞的誘導(dǎo)及早期發(fā)育過(guò)程注：a，h中標(biāo)尺為1 cm；b～g中標(biāo)尺為=10 μm。a，野外采集的孔石莼成體；b，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞由邊緣向內(nèi)，逐漸轉(zhuǎn)化成繁殖細(xì)胞； c，帶兩根鞭毛的繁殖細(xì)胞；d，游動(dòng)細(xì)胞附著后，鞭毛消失，細(xì)胞變圓；e，細(xì)胞萌發(fā)，進(jìn)行第一次分裂；f，第二次分裂，底部細(xì)胞形成假根； g，上層細(xì)胞多次分裂形成十幾個(gè)細(xì)胞的單列絲狀體；h，孔石莼幼苗。Fig. 1 The formation of reproductive cells and early development of U. pertusaNote: a and h, Scale = 1 cm; b-g, Scale = 10 μm. a. Adult U. pertusa; b. The formation of reproductive cells; c. Reproductive cell with 2 flagella; d. Adhesion of reproductive cell; e. The first cell division; f. The second cell division; g. The filament of U. Pertusa; h. The germling of U. pertusa.

圖2 得克隆(DP)暴露對(duì)孔石莼繁殖細(xì)胞形成的影響Fig. 2 The effect of Dechlorane Plus (DP) on the formation of reproductive cells in U. pertusa

2.2 DP暴露對(duì)孔石莼繁殖細(xì)胞形成的影響

圖2為不同濃度DP暴露下孔石莼繁殖細(xì)胞的形成率。與空白對(duì)照組相比，助溶劑對(duì)照組的形成率略低，但二者沒(méi)有顯著性差異(P = 0.13)。說(shuō)明0.1%丙酮對(duì)孔石莼繁殖細(xì)胞形成沒(méi)有顯著影響。與空白對(duì)照組相比，不同濃度DP處理使形成率均有降低，隨著暴露濃度的增加，形成率降低得更為明顯，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。但只有10-6mol·L-1的DP處理組呈顯著下降(P < 0.05)，比空白對(duì)照組降低了76.76%。

2.3 DP暴露對(duì)孔石莼繁殖細(xì)胞放散的影響

圖3為不同濃度DP暴露下孔石莼繁殖細(xì)胞的放散率。空白對(duì)照組與助溶劑對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P = 0.22)，因此以空白對(duì)照作為參照。與空白對(duì)照相比，10-8mol·L-1的DP處理組的放散率略有下降，但差異不顯著，而10-7和10-6mol·L-1的DP處理均使放散率顯著低于空白對(duì)照(P< 0.05)，分別下降了41.85%和46.26%。

圖3 DP暴露對(duì)孔石莼繁殖細(xì)胞放散的影響Fig. 3 The effect of DP on the release of reproductive cells in U. pertusa

2.4 DP暴露對(duì)孔石莼繁殖細(xì)胞附著的影響

圖4為不同濃度DP暴露下孔石莼的繁殖細(xì)胞的相對(duì)附著率?？瞻讓?duì)照組與助溶劑對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P = 0.42)。與空白對(duì)照相比，DP處理組中附著的繁殖細(xì)胞數(shù)量均有所下降，并且在本試驗(yàn)暴露濃度范圍內(nèi)存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。在10-7和10-8mol·L-1處理組中，相對(duì)附著率呈現(xiàn)顯著性降低(P < 0.05)，分別僅為對(duì)照組的36.30%和14.36%。

圖4 DP暴露對(duì)孔石莼繁殖細(xì)胞附著的影響Fig. 4 The effect of DP on the adhesion of reproductive cells in U. pertusa

2.5 DP暴露對(duì)孔石莼絲狀幼體生長(zhǎng)的影響

圖5是不同濃度DP暴露下孔石莼絲狀幼體的體長(zhǎng)?？瞻讓?duì)照組與助溶劑對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P = 0.18)。與空白對(duì)照組相比，DP暴露抑制了孔石莼絲狀體的生長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)中，10-8和10-7mol·L-1處理組中的絲狀幼體體長(zhǎng)分別減少了32.74%和38.98%，并呈現(xiàn)顯著性差異(P< 0.05)。

圖5 DP暴露對(duì)孔石莼絲狀幼體生長(zhǎng)的影響Fig. 5 The effect of DP on the length of filaments in U. pertusa

3 討論(Discussion)

3.1 DP對(duì)藻類(lèi)的毒理學(xué)效應(yīng)及其生態(tài)影響

DP作為一種廣泛使用的氯代阻燃劑已在多種環(huán)境介質(zhì)中被檢出。在污染源(DP生產(chǎn)廠(chǎng))附近的沉積物中，含量甚至可高達(dá)13 400 ng·g-1[13]。說(shuō)明DP已成為環(huán)境中廣泛存在的有機(jī)污染物。

2010年，M?ller等[32]首次報(bào)道了DP在海洋環(huán)境中的含量，證明DP易于通過(guò)大氣被遠(yuǎn)程傳輸。近年來(lái)，多篇報(bào)道結(jié)果顯示，DP在我國(guó)黃海和東海海域的海水(1.8 ng·L-1)[17, 19]、沉積物(2.9～69.9 pg·g-1dw)[17]、以及海洋生物中均有分布(如牡蠣中為4.1 ng·g-1ww，孔石莼中為4.84 ng·g-1ww)[17-18]，并且DP的水平分布從近岸海域向深海逐漸減少。因此，位于海陸過(guò)渡區(qū)域的潮間帶以及潮下帶很可能成為DP的一個(gè)重要匯聚區(qū)[19]，在這一區(qū)域生存的海洋生物具有很大的DP暴露風(fēng)險(xiǎn)。但目前關(guān)于潮間帶生物對(duì)DP污染的生物學(xué)響應(yīng)的報(bào)道還十分缺乏。

研究表明，在水生生物中，DP暴露可影響?hù)~(yú)類(lèi)肝臟的蛋白質(zhì)表達(dá)，引起氧化損傷和細(xì)胞凋亡[26-27]，并對(duì)海洋貝類(lèi)產(chǎn)生繁殖毒性[29]。但對(duì)海洋初級(jí)生產(chǎn)者藻類(lèi)的生物學(xué)影響還未見(jiàn)報(bào)道。

與陸地上的孢子植物一樣，底棲海藻也表現(xiàn)出r-生態(tài)策略生物所普遍具備的特征：繁殖力強(qiáng)但早期死亡率高[33]。在底棲海藻的生活史進(jìn)程中，從繁殖細(xì)胞釋放到早期幼體形成是最脆弱的環(huán)境篩選期。面對(duì)高強(qiáng)度的環(huán)境壓力(如波浪海流的沖擊、對(duì)附著基質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)、捕食壓力和環(huán)境污染等)，底棲海藻需要通過(guò)提高繁殖細(xì)胞的產(chǎn)量和成活率來(lái)實(shí)現(xiàn)種群的增長(zhǎng)，即繁殖細(xì)胞的數(shù)量決定其存活的幾率[34]。因此，繁殖細(xì)胞的形成及放散率可用來(lái)考量底棲海藻的繁殖能力。但如果放散后的繁殖細(xì)胞不能在短時(shí)間內(nèi)附著并形成牢固的假根(表現(xiàn)為附著率下降)，則可能被敵害生物捕食或者死亡，從而影響種群的擴(kuò)張。因此，繁殖細(xì)胞的形成、放散、附著以及早期幼體的生長(zhǎng)是反映環(huán)境壓力強(qiáng)度的關(guān)鍵指標(biāo)，對(duì)成體形成至關(guān)重要[35]。

基于以上的認(rèn)識(shí)及本文的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，隨著DP濃度升高，孔石莼繁殖細(xì)胞的附著率和幼體生長(zhǎng)速度均表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)。說(shuō)明DP暴露對(duì)孔石莼的早期發(fā)育過(guò)程存在不利影響，并通過(guò)抑制其附著能力，造成繁殖細(xì)胞流失，影響種群數(shù)量的補(bǔ)充。而DP對(duì)早期幼體生長(zhǎng)速度的抑制，可能使孔石莼在與生態(tài)位相似物種的競(jìng)爭(zhēng)中處于下風(fēng)，影響種群的擴(kuò)張。在自然環(huán)境中，這種狀況如果長(zhǎng)期存在，可能引起孔石莼種群的衰退及空間生態(tài)位的釋放，導(dǎo)致海藻群落結(jié)構(gòu)的改變，甚至可能通過(guò)食物鏈傳遞改變捕食者的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，引起海藻生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。因此，有關(guān)DP對(duì)海洋生物的毒理學(xué)效應(yīng)及其生態(tài)影響，需要引起重視，有必要開(kāi)展更深入的研究，如對(duì)DP抑制生殖細(xì)胞附著的生物學(xué)機(jī)制的探討以及競(jìng)爭(zhēng)物種對(duì)DP污染不同響應(yīng)能力的研究等。

3.2 孔石莼繁殖特性在水生毒性測(cè)試中的應(yīng)用潛力

孔石莼廣泛分布，易于獲得，常被用作環(huán)境指示生物。近些年來(lái)，陸續(xù)有學(xué)者以孔石莼成體作為測(cè)試對(duì)象，從生理學(xué)變化、氧化應(yīng)激效應(yīng)和分子水平開(kāi)展了石油烴、三苯基氯化錫(TPTC)、重金屬Cu和Cd的毒理學(xué)研究[31, 36-37]。與成體相比，海藻的幼體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，對(duì)污染物的響應(yīng)更為敏感。因此，Han等[38-40]建立了基于孔石莼繁殖細(xì)胞形成抑制的毒性測(cè)試方法，通過(guò)藻體顏色的變化確定細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程度。Girling等[41]建立了綠藻(Ulva intestinalis)和褐藻(Fucus spiralis)早期幼體生長(zhǎng)的毒性測(cè)試方法，開(kāi)展了防污涂料的毒理學(xué)測(cè)試，證明海藻幼體可以作為模式材料在化學(xué)品的毒性測(cè)試中加以應(yīng)用。

如上文所述，孔石莼的繁殖歷程包括繁殖細(xì)胞形成、放散、附著和早期幼體生長(zhǎng)4個(gè)連續(xù)的關(guān)鍵階段，而上述研究大多只是選擇了該過(guò)程中的某一階段而忽略了發(fā)育的連續(xù)性，尤其是忽視了“附著”這個(gè)關(guān)鍵的時(shí)期，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明經(jīng)過(guò)前面幾個(gè)發(fā)育進(jìn)程，DP的毒性效應(yīng)得到了積累，表現(xiàn)在“附著”階段劑量效應(yīng)關(guān)系更為明顯。將“附著率”作為毒理學(xué)測(cè)試指標(biāo)，更能反映DP的生態(tài)毒理效應(yīng)。

與成體不同，利用早期發(fā)育階段的孔石莼開(kāi)展毒理學(xué)測(cè)試，快速大量地獲得繁殖細(xì)胞是關(guān)鍵。在以往研究中，大多采用處于繁殖期的成熟藻體來(lái)獲得繁殖細(xì)胞[42]。這種方法主要有2點(diǎn)不足：一是受季節(jié)限制，不能隨時(shí)獲得實(shí)驗(yàn)材料；二是獲得的繁殖細(xì)胞同步性差，不適于進(jìn)行毒理學(xué)測(cè)試。邵魁雙等[43]曾通過(guò)調(diào)整外植體大小的方法誘導(dǎo)孔石莼營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞向繁殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但所采用的實(shí)驗(yàn)材料為孔石莼不育株，獲得的繁殖細(xì)胞比率較低，難以滿(mǎn)足大規(guī)模毒性測(cè)試需要。在此基礎(chǔ)上，本文經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，確定了以處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的野生孔石莼成體作為受試材料，通過(guò)外植體培養(yǎng)的方法，誘導(dǎo)藻體邊緣細(xì)胞向繁殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量游動(dòng)繁殖細(xì)胞，用于后期實(shí)驗(yàn)。該方法不受季節(jié)限制，材料易于獲得和誘導(dǎo)，測(cè)試過(guò)程不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，便于推廣應(yīng)用。

綜上所述，可知：1)低濃度DP暴露對(duì)孔石莼繁殖細(xì)胞的形成、放散和附著產(chǎn)生影響；2)DP暴露顯著抑制了孔石莼早期幼體的生長(zhǎng)；3)DP對(duì)孔石莼繁殖及早期發(fā)育的抑制作用在試驗(yàn)暴露濃度范圍內(nèi)具有劑量效應(yīng)；4)DP對(duì)孔石莼繁殖及早期發(fā)育的干擾可能會(huì)影響其在潮間帶的種群密度；5)基于孔石莼早期發(fā)育的毒性測(cè)試方法可用于DP的海洋生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

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◆

EffectsofDechloranePlusonReproductionandEarlyDevelopmentofUlvapertusa

Gong Ning1,2,*, Shao Kuishuang3, Zhang Yukun1,2, Jing Deqing1,2, Sun Yeqing1,2,#

1. School of Environmental Science and Engineering, Dalian Maritime University, Dalian 116026, China2. Institute of Environmental Systems Biology, Dalian Maritime University, Dalian 116026, China3. National Marine Environmental Monitoring Center, Dalian 116023, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170114013

2017-01-14錄用日期2017-03-21

1673-5897(2017)3-556-08

X171.5

A

鞏寧(1975-)，女，海洋生物學(xué)博士，副教授，主要研究方向?yàn)樗鷳B(tài)毒理學(xué)。

通訊作者簡(jiǎn)介：孫野青(1959-)，女，教授，主要研究方向?yàn)橛泻Νh(huán)境的系統(tǒng)生物學(xué)。

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目“滸苔著生機(jī)理與防控技術(shù)”(2016YFC1402104)；國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 41301560)

鞏寧(1975-)，女，海洋生物學(xué)博士，副教授，研究方向?yàn)樗鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail: cospar06@dlmu.edu.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: cospar06@dlmu.edu.cn

#共同通訊作者(Co-corresponding author)， E-mail: yqsun@dlmu.edu.cn

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