菲和鉻(Ⅵ)單一及復(fù)合暴露對土壤微生物多樣性的影響

胡雙慶，沈根祥,*，顧海蓉，趙慶節(jié)，汪杏，張鴻飛

1. 上海市環(huán)境科學(xué)研究院，上海 2002332. 東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 2016203. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201418

菲和鉻(Ⅵ)單一及復(fù)合暴露對土壤微生物多樣性的影響

胡雙慶1，沈根祥1,*，顧海蓉1，趙慶節(jié)1，汪杏2，張鴻飛3

1. 上海市環(huán)境科學(xué)研究院，上海 2002332. 東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 2016203. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201418

有機物和重金屬已成為我國土壤環(huán)境中常見的2類污染物質(zhì)，二者間復(fù)合污染引起的土壤生態(tài)環(huán)境風(fēng)險不容忽視。本研究以多環(huán)芳烴模式物菲和典型重金屬鉻(VI)作為受試物質(zhì)，采用PCR-DGGE分子指紋圖譜技術(shù)，探討這2種污染物單一及復(fù)合暴露對土壤微生物群落多樣性的影響，并選用主成分分析、聚類分析和戴斯系數(shù)3種算法對微生物群落相似性進行了比較。結(jié)果表明，在暴露實驗第1天，菲單一暴露低濃度組中微生物群落相似性產(chǎn)生了極為明顯的變化，而到第7天時，菲和鉻(VI)單一暴露高濃度組均對微生物群落結(jié)構(gòu)相似性產(chǎn)生最大程度的影響；采用香農(nóng)指數(shù)法評價微生物群落的多樣性，發(fā)現(xiàn)在暴露實驗第7天，菲和鉻(VI)單一暴露高濃度組對微生物群落多樣性的影響比復(fù)合暴露高濃度組更強，二者復(fù)合暴露的相互作用方式表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。本研究證明低濃度菲短期暴露的效應(yīng)高于高濃度暴露結(jié)果，因而多環(huán)芳烴菲自身及其在復(fù)合暴露中所扮演的角色尤其值得關(guān)注。

菲；鉻；微生物多樣性；PCR-DGGE

Received11 January 2017accepted20 February 2017

Abstract: Organic pollutants and heavy metals are ubiquitously detected in Chinese soils, and the combined contaminative effect on the ecological risks of soil environment is of great concern. Individual and combined exposure to typical PAH pollutants phenanthrene and heavy metallic pollutants chromium(VI) was conducted to investigate their effect on the diversity of soil microbial community composition. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) of polymerase chain reaction (PCR) amplicons of 16S rDNA sequence of microorganisms in soils was used in this work. The similarity of microbial community structure was assessed using primary component analysis, clustering analysis, and Dice coefficients, respectively. Individual exposure to low-concentration of phenanthrene resulted in a significant impact on community similarity at day 1; individual exposure to phenanthrene and chromium(VI) with high-concentration manifested the maximum effect on community similarity at day 7. Shannon index was utilized to evaluate the species diversity, and the results showed that individual exposure to either phenanthrene or chromium(VI) with high-concentration resulted in greater effects than that of combined exposure to phenanthrene and chromium(VI) at day 7. Antagonism effect was identified within the combined exposure process. Our results revealed that the short-term exposure to phenanthrene with lower concentration led to greater effect than that of with higher concentration. Particular concern should be addressed to PAH compound per se, e.g. phenanthrene, and its potential effect in combined exposure processes.

Keywords: phenanthrene; chromium(Ⅵ); microbial diversity; PCR-DGGE

土壤是動物、植物和微生物賴以生存的重要環(huán)境，研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物是用來表征土壤質(zhì)量變化最敏感、最具潛力的指標(biāo)[1]。土壤微生物在生物地化循環(huán)中占有關(guān)鍵地位，對于進入土壤環(huán)境外源污染物的遷移、轉(zhuǎn)化起著極為重要的作用，反之，污染物的種類、濃度和毒性也會影響土壤微生物的生態(tài)特征[2]。據(jù)估計，有90%的污染物會最終殘留在土壤中[3]，受到污染物質(zhì)的脅迫后，土壤微生物的種群數(shù)量及其結(jié)構(gòu)將發(fā)生改變。因而，利用土壤微生物多樣性變化，從分子生物學(xué)水平反映污染物的影響程度及其機制[4-5]，已成為當(dāng)前研究熱點。

微生物群落結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究常常采用聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)方法[6-8]，它是將片段大小相同但核酸堿基組成和排列不同的DNA進行分離的一種分子生物學(xué)技術(shù)。在環(huán)境污染物對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響方面，已有不少學(xué)者報道了采用PCR-DGGE技術(shù)的研究結(jié)果，如姜允斌等[9]應(yīng)用該技術(shù)研究了多環(huán)芳烴芘污染對土壤微生物產(chǎn)電信號的影響，發(fā)現(xiàn)芘能夠抑制發(fā)電細菌的活性，改變土壤發(fā)電細菌的種群數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)。Bamborough等[10]采用DGGE圖譜分析和聚類分析，研究了重金屬鋅和鉛污染以及季節(jié)性更替對土壤細菌和放線菌群落結(jié)構(gòu)的影響。Deng等[11]為研究工業(yè)區(qū)附近耕地土壤受重金屬復(fù)合污染程度，利用該技術(shù)分析了耕地土壤植物根際微生物種群豐富度、生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性。但目前，重金屬-有機物復(fù)合污染對土壤微生物多樣性影響的報道仍然較少。

本研究以多環(huán)芳烴模式物菲和典型重金屬鉻(VI)為受試物質(zhì)，通過采集稻田土開展室內(nèi)模擬暴露實驗，利用PCR-DGGE技術(shù)研究二者單一及復(fù)合暴露對土壤微生物多樣性的影響，以期為復(fù)合污染場地的生態(tài)風(fēng)險評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

供試土壤為上海市青浦現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園區(qū)稻田土，土壤為青紫泥，其基本理化性質(zhì)見表1。采集0～20 cm表層土樣，剔除植物殘根、石礫等雜物，經(jīng)風(fēng)干、磨碎后通過1 mm篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

受試物質(zhì)重鉻酸鉀、菲均為分析純，購自中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W(xué)試劑公司；尿素為分析純，購自生工生物工程股份有限公司；過硫酸銨為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖購自Amresco公司；40%雙丙烯酰胺購自Bio-Rad公司；50×TAE緩沖液購自Invitrogen公司；甲酰胺、四甲基乙二胺購自Sigma公司；2×Mix購自Biolinker公司；DNA Marker購自Takara公司。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soils tested

1.2 菲和鉻(Ⅵ)單一及復(fù)合暴露實驗

根據(jù)前期開展的土壤微生物酶活性實驗結(jié)果[12]，菲和鉻(VI)單一暴露均設(shè)置50、800 mg·kg-12個濃度，二者按1∶1復(fù)合暴露的濃度梯度為100、200、400、800、1 600 mg·kg-1，同時設(shè)置空白對照組。每一處理組加入50 g過篩干土，重鉻酸鉀按照不同濃度梯度所需質(zhì)量稱好，溶解于去離子水，配制成溶液加入到土壤中，用玻棒反復(fù)攪拌土壤10～15 min，使重鉻酸鉀在土壤中均勻分布，再加入去離子水使其達到土壤干重的60%左右，然后充分混勻。對于難溶于水的有機物菲，先加入適量丙酮作為助溶劑，配制成母液加入到土壤中，用玻棒充分混勻，放入通風(fēng)櫥中使丙酮充分揮發(fā)，再加入去離子水使其達到土壤干重的60%左右，然后混合均勻。將處理好的土樣放入150 mL燒杯中，然后置于24 ℃人工氣候箱中恒溫培養(yǎng)。在1 d、5 d、7 d取樣進行PCR-DGGE分析。

1.3 土壤微生物DNA提取純化和PCR擴增

從各處理組中稱取0.5 g土壤樣品至裂解管中，加入978 μL磷酸緩沖液，渦旋10～15 s，再加入122 μL MT緩沖液，渦旋1 min，14 000×g離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中，加入250 μL的PBS，手搖10次，室溫下放置10 min。離心5 min后取上清液至2 mL EP管中，加入等體積Binding Matrix，手搖混勻3～5 min。取800 μL溶液至SPINTM過濾器中，離心5 min后去除收集管中的濾液，再將剩余溶液按上述操作重復(fù)進行，去除收集管中的濾液，加入500 μL SEWS-M至SPINTM過濾器中，輕輕振搖混合，離心5 min，去除濾液后再次離心5 min去除剩余溶劑。更換收集管，室溫下干燥5 min，加入100 μL DES至SPINTM過濾器中，輕輕振蕩懸浮液，室溫下放置5 min，然后離心2 min，收集濾液放于-20 ℃冰箱中保存至使用。

將提取的基因組DNA作為PCR模板，選擇細菌16S rDNA V3區(qū)引物357-F-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGG GCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和517R(5′- ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)進行擴增。

PCR采用40 μL反應(yīng)體系：2×Taq BioLinker Mix 20 μL，引物上游、下游各1 μL，模板5 μL，補足滅菌雙蒸水至40 μL。擴增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；然后30個循環(huán)為94 ℃、30 s，56 ℃、30 s和72 ℃、30 s；最后72 ℃延伸5 min。復(fù)原條件PCR采用40 μL反應(yīng)體系：2×Taq BioLinker Mix 20 μL，引物上游、下游各2 μL，模板4 μL，補足滅菌雙蒸水至40 μL。擴增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；然后5個循環(huán)為94 ℃、30 s，56 ℃、30 s和72 ℃、30 s；最后72 ℃延伸5 min。16S PCR產(chǎn)物各取3 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 PCR反應(yīng)產(chǎn)物的DGGE分析

取20 mL 40% (m/V)雙丙烯酰胺，2 mL 50×TAE緩沖液，用雙蒸水定容至100 mL，制備成0%變性劑母液。取20 mL 40%雙丙烯酰胺，2 mL 50×TAE緩沖液，32 mL甲酰胺，33.6 g尿素，用雙蒸水定容至100 mL，制備成80%變性劑母液。16S DGGE變性梯度范圍在60%～78%。

將 Bio-Rad制膠裝置傾斜放，通過灌膠系統(tǒng)以從頂部注入凝膠的填充方式進行梯度灌膠。下層膠凝固1～1.5 h后，灌上層0%膠。凝膠灌制完畢后，插入梳子，放置1～1.5 h，待膠凝固后移除梳子。將凝膠裝置放入Bio-Rad水浴系統(tǒng)中，電泳緩沖液1×TAE，70 V電壓，溫度保持在60 ℃，電泳15.5 h。電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源取出凝膠裝置，放在磁鋼容器中，加入400 mL Biolinker DNA Red染色液進行染色40 min，然后置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用香農(nóng)指數(shù)(Shannon)來表征土壤樣品中微生物群落的多樣性，該指數(shù)的值越大，表明微生物群落多樣性越高。

公式中：H為香農(nóng)指數(shù)，S為DGGE膠中條帶數(shù)量，Pi為第i條帶灰度占該樣品總灰度的比率。

利用Quantity One軟件(Bio-Rad Inc.)對DGGE凝膠電泳圖進行膠條帶檢測。采用Microsoft Excel軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 土壤基因組DNA質(zhì)量控制

暴露實驗開始后的第1、5和7天，對土壤樣品微生物進行基因組DNA質(zhì)控檢測，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。其中編號0～9、10～19、20～29分別為第1、5和7天的暴露實驗濃度組，濃度順序均為空白對照、鉻(VI)單一50 mg·kg-1、菲單一50 mg·kg-1、鉻(VI)和菲1∶1復(fù)合100、200、400、800、1 600 mg·kg-1、鉻(VI)單一800 mg·kg-1、菲單一800 mg·kg-1。Marker從上到下依次為9 000 bp、5 000 bp、3 000 bp、2 000 bp、1 000 bp、500 bp，其中亮帶為30 ng·μL-1，其余為10 ng·μL-1。由于土壤微生物基因組DNA條帶部分清晰可見，表明其質(zhì)量合格可直接用于后續(xù)實驗。

2.2 PCR產(chǎn)物檢測

根據(jù)土壤基因組DNA質(zhì)量控制結(jié)果，分別在第1、5和7天對土壤樣品微生物基因組DNA進行PCR擴增及復(fù)原條件擴增，16S PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2和圖3所示。其中M為DL 2000 Marker，從上到下依次為2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp，其中亮帶為20 ng·μL-1，其余為10 ng·μL-1，以下所用Marker均為DL 2000。從圖中可以看出，PCR產(chǎn)物條帶單一，大小正確，濃度適中。調(diào)整產(chǎn)物上樣量后可繼續(xù)進行DGGE電泳。

2.3 土壤微生物群落DGGE電泳結(jié)果

由于DGGE電泳具有強大的分離能力，能對長度相同而序列不同的16S rDNA進行分離，且條帶信號越亮表示該種細菌數(shù)量越多[13-14]，因而從微生物群落條帶分布圖(見圖4)可清晰地看出，樣品土壤含有較為豐富的微生物物種，其群落結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。從對照組的情況看，盡管從第1天到5天，微生物物種豐富度有所上升，但到7 d時菌種數(shù)量反而有所下降，部分優(yōu)勢菌種有所顯現(xiàn)。菲和鉻(VI)單一及復(fù)合暴露改變了土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)，引起菌種數(shù)量和優(yōu)勢菌種發(fā)生不同程度的變化。

2.4 微生物群落主成分分析

菲、鉻(VI)單一及復(fù)合暴露下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主成分分析如圖5所示，可以發(fā)現(xiàn)在暴露第1天，鉻(VI)單一低濃度暴露組(編號1)對菌群結(jié)構(gòu)的影響比較小，與對照組(編號0)相似度較高；而菲單一低濃度暴露組(編號2)則對群落結(jié)構(gòu)影響較大。第7天時，菲和鉻(VI)復(fù)合暴露對微生物群落的影響趨向于一致，均不十分明顯，而這2種污染物單一暴露的高濃度組(編號28和29)相差極大，影響最為顯著；相對于各自單一暴露，二者復(fù)合暴露表現(xiàn)出一定的“抵消”特征。

2.5 微生物群落相似性聚類分析

同樣以第1天和7天菲、鉻(VI)單一及復(fù)合暴露土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相似性開展聚類分析(見圖6)。在第1天時，鉻(VI)單一低濃度暴露組(編號1)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與對照組(編號0)相似度較高，與高濃度的復(fù)合暴露組(編號8和9)也比較相似。相比較而言，菲低濃度單一暴露(編號2)和最低濃度的復(fù)合暴露組(編號3)差異最大。因此，第1天時發(fā)生樹的分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果比較一致，但在第7天時，發(fā)生樹結(jié)果與主成分結(jié)果出現(xiàn)一些不同。

圖2 不同暴露濃度組土壤微生物16S PCR產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis for 16S PCR product in the soil microorganisms exposed to different test groups

圖3 不同暴露濃度組土壤微生物16S PCR產(chǎn)物復(fù)原條件擴增的電泳檢測結(jié)果Fig. 3 Agarose gel electrophoresis for 16S reconditioning PCR product in the soil microorganisms exposed to different test groups

圖4 土壤微生物群落的條帶分布和強度示意圖Fig. 4 Strip distribution and intensity representing soil microbial community

圖5 土壤微生物群落的主成分分析圖Fig. 5 Primary component analysis of soil microbial community

圖6 不同組別樣品土壤微生物群落相似性聚類分析Fig. 6 Clustering analysis of soil microbial community from different samples

表2 菲和鉻(VI)單一及復(fù)合暴露第1天的戴斯系數(shù)值Table 2 Dice coefficients of individual and joint exposure of phenanthrene and chromium(VI) on day 1

2.6 微生物群落戴斯系數(shù)分析

表2和表3分別代表利用戴斯系數(shù)分析不同暴露方式在第1天和7天對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。在第1天時，戴斯系數(shù)分析與主成分分析和發(fā)生樹分析結(jié)果均比較一致，對照組(編號0)主要與編號1、8和9組別樣品相似；而在第7天時，戴斯系數(shù)分析的結(jié)果相對而言更類似于主成分分析結(jié)果。

2.7 微生物群落多樣性的香農(nóng)指數(shù)

衡量微生物群落多樣性的指標(biāo)包括香農(nóng)指數(shù)、均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)和辛普森指數(shù)等[15-17]，這里使用香農(nóng)指數(shù)作為代表性指標(biāo)分析暴露后土壤微生物群落的生物多樣性。通過分析第1、5和7天各組別土壤微生物群落的香農(nóng)指數(shù)，結(jié)果如圖7所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，暴露持續(xù)到第5和7天時，菲和鉻(VI)高濃度單一暴露對土壤微生物群落的影響最大，程度甚至超過最高濃度的復(fù)合暴露組(暴露濃度為2個單一暴露組的濃度和)，再次印證了菲和鉻(VI)復(fù)合暴露在高濃度下可能發(fā)生拮抗效應(yīng)。

3 討論(Discussion)

采用3種算法對菲和鉻(VI)單一及復(fù)合暴露下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進行了比較分析，其規(guī)律性結(jié)果總結(jié)如下：第1天時，低濃度鉻(VI)單一暴露對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響較為輕微，相似性與對照組較高，然而低濃度菲單一暴露卻迅速影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)；至第7天時，高濃度菲和鉻(VI)單一暴露相較于二者復(fù)合暴露，對微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生更加劇烈的影響，這與二者復(fù)合污染對土壤酶活性表現(xiàn)為的拮抗作用[12]相一致，分析原因可能與二者相互干擾微生物生理活動及生物大分子的合成有關(guān)[18]；各濃度復(fù)合暴露在第1天時與2種污染物單一暴露的微生物群落相似性沒有明顯差別，但在第7天時更類似于菲單一暴露微生物群落多樣性呈現(xiàn)出的結(jié)果。

圖7 不同組別樣品的香農(nóng)指數(shù)對比注：50 Cr(VI)表示50 mg·kg-1 Cr(VI)，50 Phe表示50 mg·kg-1菲，50 Cr(VI) 50 Phe表示50 mg·kg-1 Cr(VI)和50 mg·kg-1菲聯(lián)合暴露，余同。Fig. 7 The comparison of Shannon index among different samplesNote: 50 Cr(VI) indicated individual exposure to 50 mg·kg-1 Cr(VI); 50 Phe indicated individual exposure to 50 mg·kg-1 phenanthrene; 50 Cr(VI) 50 Phe indicated joint exposure to 50 mg·kg-1 Cr(VI) and 50 mg·kg-1 phenanthrene. The same below.

表3 菲和鉻(VI)單一及復(fù)合暴露第7天的戴斯系數(shù)值Table 3 Dice coefficients of individual and joint exposure of phenanthrene and chromium (VI) on day 7

有研究表明，不同濃度的重金屬對微生物影響各異，但高濃度重金屬對大多數(shù)微生物具有毒性效應(yīng)[19]。Li等[20]對Cu、Zn冶煉廠周圍土壤采樣并用PCR-DGGE分析，發(fā)現(xiàn)微生物多樣性隨重金屬濃度增加而降低。Joynt等[21]研究發(fā)現(xiàn)，受Pb、Cr污染40年左右的場地，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)雖然發(fā)生改變，但仍保留了種群系統(tǒng)多樣性。在高濃度重金屬存在下，某些微生物仍能存活或生長，是因為微生物對污染物產(chǎn)生抗性，有些菌還可通過生物轉(zhuǎn)化作用或生理代謝活動使重金屬由高毒狀態(tài)變?yōu)榈投緺顟B(tài)[22]。

從土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化來看，多環(huán)芳烴菲自身及其在復(fù)合暴露中所扮演的角色尤其值得關(guān)注，低濃度菲短期暴露的效應(yīng)可能反而高于高濃度暴露結(jié)果。沈國清等[23]研究發(fā)現(xiàn)，50 mg·kg-1菲暴露已可對土壤中的細菌、真菌和放線菌產(chǎn)生約50%的抑制率。而在另一項研究中，2 000 mg·kg-1的菲暴露在第4天時也不會對細菌總量產(chǎn)生顯著影響[24]。

PCR-DGGE是一種高度敏感的DNA指紋圖譜技術(shù)，但是它本身缺乏對微生物種屬的鑒定能力[25]。因此，需要將電泳后的優(yōu)勢條帶切膠回收后，通過16S測序獲得優(yōu)勢條帶相對應(yīng)微生物的序列信息，再利用BLAST工具對菌種進行比對識別。通過識別優(yōu)勢菌種構(gòu)成及其變化，將有利于更深入地理解菲和鉻(VI)對土壤生態(tài)環(huán)境的污染機制。

綜上所述，菲和鉻(VI)單一及復(fù)合暴露均會對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性和相似性產(chǎn)生影響，二者復(fù)合暴露的相互作用方式表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)，研究結(jié)果可為多環(huán)芳烴和重金屬復(fù)合污染場地的生態(tài)風(fēng)險評價提供重要參考依據(jù)。

[1] 程金金, 宋靜. 利用微生物活性和酶活性評價土壤鎘污染[C]. 面向未來的土壤科學(xué)(中冊)—中國土壤學(xué)會第十二次全國會員代表大會暨第九屆海峽兩岸土壤肥料學(xué)術(shù)交流研討會論文集, 2012

[2] 劉霞, 劉樹慶, 王勝愛, 等. 重金屬復(fù)合污染對土壤微生物生態(tài)特征的影響研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2007, 26(增刊): 17-21

Liu X, Liu S Q, Wang S A, et al. Influence on ecological characteristics of microorganisms in soils polluted by compound heavy metals [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2007, 26(supplement): 17-21 (in Chinese)

[3] Wild S R, Jones K C. Polynuclear aromatic hydrocarbons in the United Kingdom environment: A preliminary and budget [J]. Environmental Pollution, 1995, 88: 91-108

[4] Moreno B, Nogales R, Macci C, et al. Microbial eco-physiological profiles to estimate the biological restoration of a trichloroethylene-contaminated soil [J]. Ecological Indicators, 2011, 11: 1563-1571

[5] Hassan W, David J. Effect of lead pollution on soil microbiological index under spinach (Spinacia oleracea L.) cultivation [J]. Journal of Soils and Sediments, 2014, 14: 44-59

[6] Muyzer G, Smalla K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology [J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 1998, 73(1): 127-141

[7] Muyzer G. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems [J]. Current Opinion in Microbiology, 1999, 2: 317-322

[8] Ercolini D. PCR-DGGE fingerprinting:Novel strategies for detection of microbes in food [J]. Journal of Microbiological Methods, 2004, 56: 297-314

[9] 姜允斌, 鐘文輝, 薛洪婧, 等. 土壤微生物產(chǎn)電信號評價芘污染毒性的研究[J]. 土壤學(xué)報, 2014, 51(6): 1332-1341

Jiang Y B, Zhong W H, Xue H J, et al. Evaluation of toxicity of pyrene pollution by electrical signals generated by soil micro-organisms [J]. Acta Pedologica Sinica, 2014, 51(6): 1332-1341 (in Chinese)

[10] Bamborough L, Cummings S P. The impact of zinc and lead concentrations and seasonal variation on bacterial and actinobacterial community structure in a metallophytic grassland soil [J]. Folia Microbiologica, 2009, 54(4): 327-334

[11] Deng L J, Zeng G M, Fan C Z, et al. Response of rhizosphere microbial community structure and diversity to heavy metal co-pollution in arable soil [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(19): 8259-8269

[12] 汪杏, 沈根祥, 胡雙慶, 等. 鉻(Ⅵ)和菲單一及復(fù)合污染對土壤微生物酶活性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2016, 35(7): 1300-1307

Wang X, Shen G X, Hu S Q, et al. Effects of single and joint pollution of chromium (VI) and phenanthrene on microbiological enzyme activities in soil [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2016, 35(7): 1300-1307 (in Chinese)

[13] 趙興青, 楊柳燕, 陳燦, 等. PCR-DGGE技術(shù)用于湖泊沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性研究[J]. 生態(tài)學(xué)報, 2006, 26(11): 3610-3616

Zhao X Q, Yang L Y, Chen C, et al. Study on the microbial diversity in lake sediments by the method of PCR-DGGE [J]. Acta Ecologica Sinica, 2006, 26(11): 3610-3616 (in Chinese)

[14] 陳會海, 許修宏, 李洪濤. 刺參腸道及養(yǎng)殖池塘菌群組成的PCR-DGGE指紋圖譜分析[J]. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2010, 31(3): 119-122

Chen H H, Xu X H, Li H T. PCR-DGGE analysis of bacterial community composition in the intestine and aquaculture pond of Apostichopus japonicus [J]. Progress in Fishery Sciences, 2010, 31(3): 119-122 (in Chinese)

[15] 王軼南, 朱世偉, 常亞青. 應(yīng)用PCR-DGGE分析三江濕地土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性[J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 2012, 25(11): 1272-1278

Wang Y N, Zhu S W, Chang Y Q. Diversity analysis of soil fungal community structure in Sanjiang wetland by PCR-DGGE [J]. Research of Environmental Sciences, 2012, 25(11): 1272-1278 (in Chinese)

[16] 劉紹雄, 王明月, 王娟, 等. 基于PCR-DGGE技術(shù)的劍湖濕地湖濱帶土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2013, 32(7): 1405-1412

Liu S X, Wang M Y, Wang J, et al. Analyzing soil microbial community structure diversity from Jianhu wetland lakeside zone using PCR-DGGE technique [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2013, 32(7): 1405-1412 (in Chinese)

[17] 王麗娟, 李剛, 趙建寧, 等. 轉(zhuǎn)基因大豆對根際土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2013, 32(2): 290-298

Wang L J, Li G, Zhao J N, et al. Effects of transgenic soybeans on the microbial functional diversity in the rhizosphere [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2013, 32(2): 290-298 (in Chinese)

[18] 谷盼妮, 王美娥, 陳衛(wèi)平. 環(huán)草隆與鎘復(fù)合污染對城市綠地重金屬污染土壤有機氮礦化量、基礎(chǔ)呼吸和土壤酶活性的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2015, 10(4): 65-87

Gu P N, Wang M E, Chen W P. Combined effects of siduron and cadmium on organic nitrogen mineralization, basal respiration and enzyme activities in heavy metal polluted urban soil [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(4): 65-87 (in Chinese)

[19] 張妍, 崔驍勇, 羅維. 重金屬污染對土壤微生物生態(tài)功能的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2010, 5(3): 305-313

Zhang Y, Cui X Y, Luo W. Effects of heavy metal pollutions on the ecological functions of soil microbes: A review [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2010, 5(3): 305-313 (in Chinese)

[20] Li Z J, Xu J M, Tang C X, et al. Application of 16S rDNA-PCR amplification and DGGE fingerprinting for detection of shift in microbial community diversity in Cu-, Zn- and Cd-contaminated paddy soils [J]. Chemosphere, 2006, 62: 1374-1380

[21] Joynt J, Bischoff M, Turco R, et al. Microbial community analysis of soils contaminated with lead, chromium and petroleum hydrocarbons [J]. Microbial Ecology, 2006, 51: 209-219

[22] 傅麗君, 劉智任, 楊磊. 鎘、銅、鉛復(fù)合污染對枇杷園土壤微生物的生態(tài)毒理效應(yīng)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2009, 4(6): 881-888

Fu L J, Liu Z R, Yang L. Ecotoxicological effect of Cd-Cu-Pb compound pollution on loquat soil microbe [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2009, 4(6): 881-888 (in Chinese)

[23] 沈國清, 陸貽通, 洪靜波, 等. 菲和鎘復(fù)合污染對土壤微生物的生態(tài)毒理效應(yīng)[J]. 環(huán)境化學(xué), 2005, 24(6): 662-665

Shen G Q, Lu Y T, Hong J B, et al. Ecotoxicological effect of phenanthrene and Cd combined pollution on soil microbe [J]. Environmental Chemistry, 2005, 24(6): 662-665 (in Chinese)

[24] Ibarrolaza A, Coppotelli B M, Del Panno M T, et al. Dynamics of microbial community during bioremediation of phenanthrene and chromium(VI)-contaminated soil microcosms [J]. Biodegradation, 2009, 20: 95-107

[25] 辜運富, 張小平, 涂仕華. 變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用[J]. 土壤, 2008, 40(3): 344-350

Gu Y F, Zhang X P, Tu S H. Application of denaturing gradient gel electrophoresis to the study of soil microbial diversity [J]. Soils, 2008, 40(3): 344-350 (in Chinese)

◆

EffectsofSingleandCombinedExposuretoPhenanthreneandChromium(Ⅵ)onMicrobialDiversityinSoils

Hu Shuangqing1, Shen Genxiang1,*, Gu Hairong1, Zhao Qingjie1, Wang Xing2, Zhang Hongfei3

1. Shanghai Academy of Environmental Sciences, Shanghai 200233, China2. College of Environmental Science and Engineering, Donghua University, Shanghai 201620, China3. School of Chemical and Environmental Engineering, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170111003

2017-01-11錄用日期2017-02-20

1673-5897(2017)3-535-09

X171.5

A

沈根祥(1965—)，男，環(huán)境工程博士，教授級高級工程師，主要研究方向生態(tài)毒理學(xué)和農(nóng)村環(huán)境保護。

上海市2014年度“科技創(chuàng)新行動計劃”社會發(fā)展領(lǐng)域項目(14231200500)

胡雙慶(1978-)，男，博士，高級工程師，研究方向為生態(tài)毒理學(xué)，E-mail: husq@saes.sh.cn；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: shengx@saes.sh.cn

胡雙慶, 沈根祥, 顧海蓉, 等. 菲和鉻(Ⅵ)單一及復(fù)合暴露對土壤微生物多樣性的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2017, 12(3): 535-543

Hu S Q, Shen G X, Gu H R, et al. Effects of single and combined exposure to phenanthrene and chromium (Ⅵ) on microbial diversity in soils [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 535-543 (in Chinese)