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    4種喹諾酮類抗生素對(duì)發(fā)光菌毒性作用研究

    2017-10-13 04:01:27汪皓琦董玉瑛汪靈偉高瑋岐鄒學(xué)軍
    生態(tài)毒理學(xué)報(bào) 2017年3期
    關(guān)鍵詞:諾氟沙星類抗生素沙星

    汪皓琦,董玉瑛,汪靈偉,高瑋岐,鄒學(xué)軍

    大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,大連 116600

    4種喹諾酮類抗生素對(duì)發(fā)光菌毒性作用研究

    汪皓琦,董玉瑛*,汪靈偉,高瑋岐,鄒學(xué)軍

    大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,大連 116600

    分析了4種常見的喹諾酮類抗生素(QNs)對(duì)發(fā)光菌(Photobacterium phosphoreum)的單一毒性和等毒性比例下的聯(lián)合毒性作用,基于毒性單位法(TU)、相加指數(shù)法(AI)和混合毒性指數(shù)法(MTI)評(píng)價(jià)混合體系聯(lián)合毒性的作用類型。加替沙星、洛美沙星、左氧氟沙星和諾氟沙星4種喹諾酮類醫(yī)藥品對(duì)發(fā)光菌的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)分別為:0.084×10-3、0.137×10-3、0.129×10-3和0.151×10-3mol·L-1。不同的評(píng)價(jià)方法對(duì)4種QNs的聯(lián)合效應(yīng)評(píng)價(jià)結(jié)果具有較好的一致性,多元混合體系呈現(xiàn)為不同程度的拮抗作用。結(jié)合分子結(jié)構(gòu)特征和不同取代基相互作用,初步分析了聯(lián)合毒性機(jī)理,進(jìn)一步的毒性作用機(jī)制還需通過對(duì)生物生理生化反應(yīng)等進(jìn)行深入研究。本研究多種QNs混合體系呈現(xiàn)拮抗作用為主,揭示了此類醫(yī)藥品在環(huán)境中的聯(lián)合使用可能導(dǎo)致藥效降低以及微生物耐藥性的產(chǎn)生和傳播。

    喹諾酮類抗生素;發(fā)光菌;單一毒性;聯(lián)合毒性;毒性分析

    Received3 January 2017accepted20 February 2017

    Abstract: The single toxicity and joint toxicity under the same toxicity ratio of four quinolones (QNs) were studied to Photosbacterium phosphoreum. The action types of joint toxicity were evaluated by toxicity unit (TU), additive index (AI) and mixtures toxicity index (MTI). The acute toxicity EC50of gatifloxacin, lomefloxacin, levofloxacin and norfloxacin to Photosbacterium phosphoreum were 0.084×10-3, 0.137×10-3, 0.129×10-3and 0.151×10-3mol·L-1respectively. The results of three evaluating methods were in agreement, and the results suggested that the antagonisms of various extents existed among the multi-mixture systems. Mechanisms of joint toxicity were preliminary analyzed by characteristics of quinolones molecular structure and interaction of different substituent. The further mechanism of toxicity action need further understanding on exploring physiological and biochemical reaction of organisms. The facts that quinolone mixture systems showed almost antagonism reveal joint toxicity in the environment may induce the generation of antibiotic resistance and its spread.

    Keywords: quinolones; Photobacterium phosphoreum; single toxicity; joint toxicity; toxicity analysis

    喹諾酮類抗生素(QNs)在治療人和動(dòng)物細(xì)菌性感染方面具有良好的治療效果,但其用于救助患者的同時(shí)會(huì)給人體和環(huán)境帶來的不同程度的副作用和風(fēng)險(xiǎn)。其大部分不能被機(jī)體完全吸收,多會(huì)以原形或代謝物的形式經(jīng)患者和畜禽排泄物進(jìn)入環(huán)境,其環(huán)境殘留可對(duì)土壤微生物、水生生物、植物生長發(fā)育等方面產(chǎn)生明顯的危害或潛在的負(fù)面影響[1-3]。醫(yī)藥品混合-持久-低劑量的暴露特征產(chǎn)生的聯(lián)合毒性對(duì)水生生物及水環(huán)境系統(tǒng)產(chǎn)生很大風(fēng)險(xiǎn)[4]。單一QNs的生物學(xué)效應(yīng)研究顯然不能滿足現(xiàn)實(shí)中水體的特點(diǎn),進(jìn)行聯(lián)合毒性研究迫在眉睫。國際上關(guān)于QNs在環(huán)境中的轉(zhuǎn)歸及毒性等的研究文獻(xiàn)較少,國內(nèi)的研究尚屬剛剛起步[5-6]。因此,研究QNs生態(tài)毒性機(jī)理以及與其他環(huán)境污染物的聯(lián)合毒性效應(yīng)值得學(xué)者們加以重視。

    結(jié)合生物發(fā)光細(xì)菌應(yīng)用范圍廣、使用簡(jiǎn)便、靈敏度高、相關(guān)性好、反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將發(fā)光菌(Photobacterium phosphoreum)作為指示物,通過測(cè)定發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度,計(jì)算發(fā)光抑制率,并對(duì)濃度和發(fā)光抑制率作圖,確定4種醫(yī)藥品單獨(dú)作用時(shí)的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)和混合體系中混合物的EC50。進(jìn)一步采用毒性單位法(TU)、相加指數(shù)法(AI)、混合毒性指數(shù)法(MTI)等聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法對(duì)聯(lián)合毒性作用類型進(jìn)行評(píng)價(jià),判斷其聯(lián)合作用機(jī)制,并簡(jiǎn)要分析聯(lián)合毒性作用機(jī)理及發(fā)光菌的作用機(jī)理。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 儀器與材料

    DXY22型生物毒性測(cè)試儀(中國科學(xué)院南京土壤研究所制造);8522型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠);THZ282型氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇儀器廠);DHP29082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);LDZX240CI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);不同量程的精密移液器(Thermo公司);SJH型潔凈工作臺(tái)(沈陽市凈化儀器廠二分廠);常規(guī)玻璃儀器。

    1.2 試劑材料1.2.1 主要試劑

    諾氟沙星膠囊購自沈陽管城制藥有限責(zé)任公司,加替沙星、鹽酸左氧氟沙星、鹽酸洛美沙星為江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。配制不同喹諾酮類抗生素暴露濃度,是經(jīng)校正后的有效成分含量,即根據(jù)藥物說明書中注明其有效成分含量,并結(jié)合單劑量藥品的總稱重量,反推計(jì)算出溶液配制時(shí)所稱重中的有效藥品成分。用3%NaCl溶液配制相應(yīng)的系列濃度梯度,待用。實(shí)驗(yàn)過程同時(shí)設(shè)置3~5份平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行生物效應(yīng)分析結(jié)果質(zhì)量控制。

    1.2.2 菌種的培養(yǎng)

    工作菌液的制備:吸取一定量培養(yǎng)好的搖瓶菌液于3% NaCl溶液中,充分?jǐn)嚢瑁♂尦潭纫钥刂瓶瞻?由2 mL的3%NaCl溶液和0.1 mL的工作菌液組成)發(fā)光強(qiáng)度在300~800為宜。明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)凍干粉購自中國科學(xué)院南京土壤研究所微生物室。有關(guān)發(fā)光菌凍干粉的復(fù)蘇、斜面菌種的培養(yǎng)、搖瓶菌液的培養(yǎng)、工作菌液的制備等操作方法見文獻(xiàn)[7]。

    1.3 急性毒性EC50的測(cè)定

    發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試經(jīng)毒性預(yù)試驗(yàn)、單一和聯(lián)合毒性分析等步驟實(shí)施實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[7]。

    1.3.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)

    選定濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn),觀察15 min發(fā)光菌的發(fā)光抑制率,找出試驗(yàn)的正確濃度范圍。

    1.3.2 單一毒性EC50的測(cè)定

    在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,將待測(cè)化合物配成適當(dāng)?shù)?個(gè)濃度梯度,各取不同梯度的溶液2 mL加入具塞磨口比色管(Φ15 cm,H 6 cm) 中,以2 mL 3%NaCl溶液作空白對(duì)照,取0.2 mL工作菌液于各比色管中,加塞上下振蕩均勻,去塞,暴露15 min,測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。每個(gè)濃度梯度設(shè)3組平行,保證標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。

    1.3.3 聯(lián)合毒性EC50的測(cè)定

    根據(jù)單一毒性的測(cè)試結(jié)果,繪制每種醫(yī)藥品對(duì)發(fā)光菌作用的效應(yīng)-劑量曲線,以獲得單一毒性EC50,;并將待測(cè)物加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、諾氟沙星按等毒性比例配制二元及多元混合體系,每組濃度設(shè)置3個(gè)平行,以3%NaCl為空白對(duì)照,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)6個(gè)濃度梯度(半數(shù)抑制率附近) ,測(cè)定混合體系對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性EC50值。確保3組平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    鑒于污染物濃度與其對(duì)應(yīng)發(fā)光抑制率的關(guān)系在EC50附近呈良好的線性分布,故本實(shí)驗(yàn)采用Excel繪圖,將化合物濃度(x) 和發(fā)光抑制率(y) 進(jìn)行回歸分析,求得回歸方程:y(發(fā)光抑制率)= ax(化合物濃度) +b。根據(jù)線性方程求出發(fā)光抑制率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的化合物濃度,即為化合物單獨(dú)作用時(shí)EC50?;衔餄舛群退劳雎手g的相關(guān)系數(shù)r,經(jīng)顯著水平檢驗(yàn),置信區(qū)間范圍大于95%。

    1.5 聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法

    多種污染物與生物體的聯(lián)合毒性作用,可以分為獨(dú)立、相加、協(xié)同和拮抗4種作用類型,采用毒性單位法(TU)、相加指數(shù)法(AI)、混合毒性指數(shù)法(MTI)等方法可對(duì)這些類型進(jìn)行定量判別和分析[8-9]。表1為聯(lián)合毒性作用類型量化評(píng)價(jià)依據(jù)。

    2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

    2.1 單一毒性作用測(cè)試分析

    綜合比較4種醫(yī)藥品(加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、諾氟沙星)對(duì)發(fā)光細(xì)菌的急性毒性測(cè)試曲線見圖1。由圖1可見:曲線表征的是典型的毒性濃度-效應(yīng)關(guān)系。4種醫(yī)藥品的濃度在0~0.2×10-3mol·L-1范圍內(nèi)增長時(shí),對(duì)發(fā)光菌發(fā)光的抑制作用急劇增加;0.2×10-3mol·L- 1以上時(shí),對(duì)發(fā)光菌的抑制范圍達(dá)到了70%~90%??梢娫诃h(huán)境中,抗生素殘留即便處于較低濃度,其對(duì)微生物的影響也不容忽視。

    4種化合物對(duì)發(fā)光菌有不同程度的抑制作用,對(duì)發(fā)光菌的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)值分別為:0.084×10-3、0.137×10-3、0.129×10-3和0.151×10-3mol·L- 1,其毒性作用強(qiáng)弱為:加替沙星﹥左氧氟沙星﹥洛美沙星﹥諾氟沙星,即加替沙星的生物毒性最大,以下依次是左氧氟沙星、洛美沙星和諾氟沙星。4種喹諾酮類抗生素分子結(jié)構(gòu)如圖2,從結(jié)構(gòu)上看,4種QNs母環(huán)相同,各自的取代基的種類和數(shù)量皆不同,即母

    體相同的醫(yī)藥品,不同的取代官能團(tuán)對(duì)其毒性效應(yīng)影響較顯著。翟麗華[11]選取17個(gè)部分取代苯化合物對(duì)發(fā)光菌的急性毒性研究得取代基對(duì)發(fā)光菌的毒性貢獻(xiàn)大小順序?yàn)椋?NO2>-Cl>-CH3>-NH2>-OH。李曉等[12]研究10種苯并噻唑類污染物對(duì)青海弧菌Q67 毒性效應(yīng)得各取代基對(duì)青?;【拘耘判?yàn)閹€基取代>氨基> 2羥苯基>羧酸乙酯>溴>氟>甲基>氯>甲硫基>苯并噻唑。上述作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)論均是在各同系物取代基單一的情況下取得,對(duì)本實(shí)驗(yàn)有借鑒參照的意義??赏茢?種喹諾酮類抗生素抑制發(fā)光菌發(fā)光的差別,來源不同取代基影響作用于微生物靶點(diǎn)的效應(yīng)程度。若獲得各取代基對(duì)藥物的毒性貢獻(xiàn),則需要進(jìn)一步分子相互作用機(jī)制的相關(guān)理論和研究支持。

    圖1 4種抗生素對(duì)發(fā)光細(xì)菌的急性毒性測(cè)試曲線Fig. 1 The acute toxicity curve of four quinolones to Photobacterium phosphoreum

    圖2 4種抗生素結(jié)構(gòu)式Fig. 2 Structural formula of four quinolones

    表1 不同評(píng)價(jià)指數(shù)的聯(lián)合作用類型判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The joint toxicity types and standards of different evaluating methods

    2.2 二元混合體系的聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)

    二元混合體系的EC50值和聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)結(jié)果見表2。等毒性比例混合時(shí),加替沙星+左氧氟沙星、諾氟沙星+洛美沙星、加替沙星+諾氟沙星、加替沙星+洛美沙星、左氧氟沙星+諾氟沙星和左氧氟沙星+洛美沙星6組二元混合體系的M值均大于M0值;AI均小于0;MTI均小于0。因此,6組二元混合體系均表現(xiàn)出拮抗作用。AI值越接近于0,越靠近相加作用,而MTI值越接近于0,越靠近獨(dú)立作用,根據(jù)6組二元混合體系的MTI和AI值大小的不同,可判斷其拮抗作用的強(qiáng)度有所不同,由此獲得不同體系拮抗作用的排序?yàn)椋杭犹嫔承?洛美沙星﹥左氧氟沙星+諾氟沙星﹥加替沙星+諾氟沙星﹥諾氟沙星+洛美沙星﹥加替沙星+左氧氟沙星﹥左氧氟沙星+洛美沙星。

    在現(xiàn)實(shí)環(huán)境的污染評(píng)價(jià)中,不能將各污染物毒性通過簡(jiǎn)單疊加來判斷其綜合毒性[13]。實(shí)驗(yàn)獲得聯(lián)合毒性類型為拮抗作用,與前人研究結(jié)果相一致。聯(lián)合作用的拮抗效應(yīng),可能是由于喹諾酮類抗生素分子間相互作用機(jī)制引起的。叢永平等[14]研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類抗生素和氯霉素類抗生素對(duì)發(fā)光菌(Photobacterium phosphoreum)的聯(lián)合急性毒性亦均表現(xiàn)出拮抗作用。蘇麗敏等[15]測(cè)定了苯胺與取代苯胺在3 種毒性配比下對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性,主要表現(xiàn)為相加作用或弱的拮抗作用;翟麗華[11]選取5種有機(jī)化合物苯、苯酚、苯胺、硝基苯、對(duì)氯酚等比毒性進(jìn)行聯(lián)合毒性研究。其中,聯(lián)合作用類型以拮抗為主,其次為加和作用,協(xié)同作用最少。本實(shí)驗(yàn)4種喹諾酮類抗生素都屬于同一種類化合物,一般認(rèn)為,同系物的作用機(jī)理類似,當(dāng)同時(shí)存在時(shí),多發(fā)生相加作用[15],但上述幾個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:拮抗作用在同類化合物發(fā)生的概率較高。

    表2 二元混合體系的EC50值和聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)參數(shù)及作用類型Table 2 Joint toxicity evaluating parameters and types for different binary systems

    表3 多元混合體系的EC50值和聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)參數(shù)及作用類型Table 3 Joint toxicity evaluating parameters and types for different multi-mixture systems

    2.3 多元混合體系的聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)

    三元和四元混合體系聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)參數(shù)和作用類型見表3。等毒性比例混合時(shí),多元混合體系的M值大于M0值;AI小于0;MTI小于0。4種喹諾酮類抗生素三元及四元體系的聯(lián)合毒性作用均表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。

    由于二元混合體系聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為拮抗作用,由此猜測(cè)喹諾酮類抗生素分子間的相互作用可導(dǎo)致體系聯(lián)合毒性降低,多個(gè)二元拮抗體系累加,各分子間相互作用增強(qiáng)可導(dǎo)致多元混合體系呈現(xiàn)拮抗作用。因此,多元混合體系聯(lián)合作用類型在多數(shù)情況下呈現(xiàn)為拮抗作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與假設(shè)相符,證實(shí)猜測(cè):多元混合體系聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗的原因是多種拮抗體系累加的結(jié)果。方章順等[16]研究典型抗生素與群體感應(yīng)抑制劑對(duì)費(fèi)氏弧菌的三元慢性聯(lián)合毒性證明了三元混合體系為拮抗效應(yīng)是其中2個(gè)較強(qiáng)的拮抗體系疊加的結(jié)果。任皓等[17]在鹽酸吉他霉素與金霉素、鹽霉素、黃霉素對(duì)發(fā)光細(xì)菌聯(lián)合毒性作用實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明:在多個(gè)混合體中,拮抗作用表現(xiàn)較強(qiáng)的分子混合體系起主導(dǎo)作用。由此可見,醫(yī)藥品在環(huán)境中經(jīng)過各途徑混合后,其相互作用可能導(dǎo)致毒性減弱,造成微生物耐藥性的產(chǎn)生和傳播,以及微生態(tài)平衡的破壞。

    在研究喹諾酮類抗生素對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性作用中,TU法、AI法與MTI法3種評(píng)價(jià)方法對(duì)一元或多元混合體系的聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)結(jié)論一致為:拮抗作用,3種評(píng)價(jià)方法具有良好的一致性,其中AI法所得數(shù)值絕對(duì)值最大,參數(shù)物理意義較明確,評(píng)價(jià)結(jié)果便于理解,表征判斷其對(duì)聯(lián)合毒性的靈敏度最高。AI法和TU法都是以濃度相加為基礎(chǔ)模式的,所以得出的結(jié)果基本一致,周虹等[18]運(yùn)用TU法研究磺胺和Meo-NPs的聯(lián)合作用大多為協(xié)同效應(yīng)。修瑞琴等[19]運(yùn)用這2種方法處理硒與氟對(duì)猛水蚤的聯(lián)合毒性時(shí)發(fā)現(xiàn),2種方法的結(jié)果都是拮抗作用。董玉瑛[20]運(yùn)用這2種方法處理十二烷基硫酸鈉(SDS)和苯酚及SDS和甲苯對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)2種方法的結(jié)果也一致,均為協(xié)同作用。MTI作為評(píng)價(jià)毒性聯(lián)合作用的方式之一,與AI法得出的拮抗作用強(qiáng)弱有所不同。孟慶俊等[21]在測(cè)定苯胺與甲基苯胺混合物對(duì)大型蚤的聯(lián)合毒性時(shí)發(fā)現(xiàn),2種方法所判斷的結(jié)果均為協(xié)同作用,但2種方法所判斷出作用方式的強(qiáng)弱有所不同。

    2.4 毒性作用機(jī)制初步探討及其類型評(píng)價(jià)

    綜合分析二元、三元及四元混合體系聯(lián)合毒性,同為拮抗效應(yīng),對(duì)于呈現(xiàn)的聯(lián)合作用效應(yīng),可從喹諾酮類抗生素不同取代基的特性及其相互作用、發(fā)光菌發(fā)光原理進(jìn)行初步的聯(lián)合毒性機(jī)理分析。大部分發(fā)光細(xì)菌發(fā)光機(jī)制是基本相同的,都必須有細(xì)菌熒光素酶(LE)、還原性的黃素單核苷酸(FMNH2)、氧氣(O2)、長鏈脂肪醛(RCHO)的參與,大體發(fā)光反應(yīng)過程如下[22-23]:

    實(shí)驗(yàn)中4種藥品存在較大電負(fù)性、含孤電子對(duì)的元素(F、O、N),它們所在的基團(tuán)氨基(-NH2)、羥基(-OH)等都易與黃素單核苷酸結(jié)合形成氫鍵,阻礙或阻止FMNH2在氧化和還原形式之間的氫傳遞,影響發(fā)光反應(yīng),從而抑制發(fā)光[12]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)4種QNs聯(lián)合毒性作用類型,拮抗作用引起發(fā)光菌發(fā)光變化是由于在明亮發(fā)光桿菌的發(fā)光反應(yīng)中,還原態(tài)的黃素單核甘酸(FMNH2)被氧化成黃素單核甘酸(FMN)的過程中起到了傳遞氫的作用,由于加替沙星、洛美沙星、左氧氟沙星,諾氟沙星的分子中均含有N元素,對(duì)于FMNH2是一種營養(yǎng)元素,可在一定程度上促進(jìn)氫的傳遞,進(jìn)而降低抑制發(fā)光的程度[24-25]。若進(jìn)一步分析引起拮抗作用的原因,還需要對(duì)毒物聯(lián)合作用機(jī)制以及對(duì)發(fā)光菌生理生化反應(yīng)等進(jìn)行深入研究。在此研究基礎(chǔ)上可開展混合抗生素聯(lián)合毒性定量結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)分析,多元抗生素的急性毒性與慢性毒性的比較,實(shí)現(xiàn)對(duì)混合毒性和作用機(jī)制的定量預(yù)測(cè),為該類污染物全生命周期影響評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

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    TheToxicityofFourQuinolonestoPhotobacteriumphosphoreum

    Wang Haoqi, Dong Yuying*, Wang Lingwei, Gao Weiqi, Zou Xuejun

    College of Environment & Resources, Dalian Minzu University, Dalian 116600, China

    10.7524/AJE.1673-5897.20170103002

    2017-01-03錄用日期2017-02-20

    1673-5897(2017)3-453-07

    X503.2

    A

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21477001); 中央高?;究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(DC201502070302)

    汪皓琦(1994—), 女, 碩士研究生, 研究方向?yàn)榄h(huán)境化學(xué), E-mail: 787802120@qq.com

    *通訊作者(Corresponding author), E-mail: dong_yuying@163.com

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