鄰苯二甲酸二甲酯在離體人紅細胞內(nèi)的分布和含量研究池振興1,2,*，王東麟1,3，凌嘉佳1，宋雪梅4，王明靜4

1. 哈爾濱工業(yè)大學(威海) 海洋科學與技術(shù)學院，威海 2642092. 暨南大學環(huán)境學院 廣州市環(huán)境暴露與健康重點實驗室，廣州 5106323. 清華大學環(huán)境學院 環(huán)境模擬與污染控制國家重點聯(lián)合實驗室，北京 1000844. 威海市中心血站，威海 264200

收稿日期：2016-09-25 錄用日期：2016-11-01

鄰苯二甲酸二甲酯在離體人紅細胞內(nèi)的分布和含量研究池振興1,2,*，王東麟1,3，凌嘉佳1，宋雪梅4，王明靜4

1. 哈爾濱工業(yè)大學(威海) 海洋科學與技術(shù)學院，威海 2642092. 暨南大學環(huán)境學院 廣州市環(huán)境暴露與健康重點實驗室，廣州 5106323. 清華大學環(huán)境學院 環(huán)境模擬與污染控制國家重點聯(lián)合實驗室，北京 1000844. 威海市中心血站，威海 264200

收稿日期：2016-09-25錄用日期：2016-11-01

鄰苯二甲酸酯類污染物(PAEs)在環(huán)境中普遍存在，可沿食物鏈富集，危害人體健康。本文利用熒光光譜法和高效液相色譜法(HPLC)探究了鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)在離體人紅細胞內(nèi)的分布情況。結(jié)果表明，紅細胞在310 nm、490 nm和609 nm處各具有一個熒光特征峰，其來源分別為：紅細胞內(nèi)的蛋白；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和膜脂；鋅卟啉和原卟啉。DMP染毒后，310 nm處的熒光峰出現(xiàn)明顯下降，其原因為進入紅細胞內(nèi)的DMP與蛋白發(fā)生了結(jié)合；490 nm和609 nm處的熒光峰變化很小。高效液相色譜(HPLC)實驗結(jié)果表明，DMP能透過紅細胞膜進入細胞內(nèi)部，其進入量隨暴露量增加而增加，進入量和暴露量的比值隨暴露量增加而減少。上述研究成果能加深對PAEs在血液運輸過程中與紅細胞毒性作用的理解，可為PAEs的危險性評估和相關(guān)疾病預(yù)防提供數(shù)據(jù)參考。

鄰苯二甲酸酯；紅細胞；污染物分布；熒光光譜；高效液相色譜

Received25 September 2016accepted1 November 2016

Abstract: Phthalate esters (PAEs) is widely present in the environment. It poses a threat to human health through accumulation in the food chain. The distribution of a typical PAEs, i.e., dimethyl phthalate (DMP), in human erythrocytes in vitro was explored by using fluorescence spectroscopy and HPLC. The experimental results indicated that the fluorescence spectrum of erythrocytes have three fluorescence peaks, successively located at 310 nm, 490 nm and 609 nm, which are caused by the protein in erythrocytes; nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), flavin adenine dinucleotide (FAD) and membrane lipid; zinc porphyrin and porphyrin, respectively. After exposure to DMP, the intensity of the fluorescence peak at 310 nm significantly decreased due to the binding of DMP with the protein in erythrocytes, while no significant change in the intensity of the fluorescence peaks at 490 nm and 609 nm was observed. The experimental results of HPLC indicated that DMP could pass through the cell membrane and enter the cell. The DMP level in the cell increased with the increasing exposure level. The ratio of the DMP level in the cell to the exposure level decreased with increasing exposure level. The results will shed light on the understanding of the cytotoxicity of PAEs in the process of blood transport.

Keywords: phthalate esters (PAEs); erythrocyte; pollutant distribution; fluorescence spectroscopy; HPLC

鄰苯二甲酸酯類化合物(phthalate esters, PAEs)又稱酞酸酯，主要作為增塑劑，廣泛用于制造服裝、塑料玩具、皮膚護理產(chǎn)品、食品包裝材料、醫(yī)療設(shè)備、建筑材料、電纜、電線、殺蟲劑等產(chǎn)品[1]。由于在加工過程中，PAEs并未聚合到聚氯乙烯(PVC)高分子的碳鏈上，因此隨著使用時間的推移，PAEs容易通過直接釋放、浸出、蒸發(fā)、磨擦和遷移等方式由塑料轉(zhuǎn)移到空氣、土壤、地表水以及地下水等環(huán)境中[2]，對生物體造成潛在危害[3-5]。PAEs在環(huán)境中普遍存在，導致人體經(jīng)常接觸PAEs，目前在血液、臍帶血、羊水、精液和尿液等體液中均已檢測到其存在[6]。人體主要通過呼吸、皮膚接觸和攝入(包括飲食和攝入粉塵)3種方式暴露于PAEs環(huán)境中[7]，也是PAEs進入血液的主要途徑[8]。檢測表明，PAEs在普通人體血液內(nèi)的含量達到了μg·L-1數(shù)量級[9]，而在從事鄰苯二甲酸酯類增塑劑生產(chǎn)的工人血液里，PAEs濃度比普通人群要高約5～100倍[10]。進入機體血液的PAEs在隨其運輸和擴散過程中產(chǎn)生毒性。準確快速測定血液中的PAEs水平對于認識PAEs對機體健康的影響，采取防治措施和制定法規(guī)等都具有重要意義，是當前分析檢測領(lǐng)域研究的熱門課題。目前，PAEs的檢測方法有很多，普遍使用的有氣相色譜法(GC)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)和高效液相色譜法(HPLC)。

血液具有運輸、調(diào)節(jié)溫度、防御、調(diào)節(jié)滲透壓和酸堿平衡等功能，由血漿和血細胞組成。當向血液中加入適量抗凝劑(如肝素或枸櫞酸鈉)，并經(jīng)自然沉降或離心沉淀后可分出三層：上層為淡黃色的血漿，下層為紅細胞(red blood cells, RBCs)，中間有一薄層為白細胞和血小板。血液或血細胞中存在大量能夠發(fā)射熒光的基團。通過檢測和分析血液或血細胞的熒光光譜，能夠獲得一些反映血液狀態(tài)和內(nèi)部物質(zhì)構(gòu)成情況的信息[11]，這方面的研究受到廣泛關(guān)注。降雨強等[12]用波長為532 nm的激光作為激發(fā)光源，分別檢測正常人血液及其組分(血漿、血小板、紅細胞)的熒光光譜，結(jié)果表明，全血在630 nm及710 nm附近出現(xiàn)熒光峰值，其各組分的熒光光譜有明顯差異，其中血漿的熒光光譜最強，且譜線較為豐富。Gao等[13-14]系統(tǒng)地研究了光與血液相互作用的光譜學特性，分別用LED光和Ar+激光誘導實驗小白鼠的全血、紅細胞和血紅蛋白的熒光光譜，探討不同組分熒光峰的歸屬。趙研等[15]用熒光分光光度計，在276 nm光激發(fā)下測量紅細胞及血漿自體熒光發(fā)射光譜，對伴有血液黏滯綜合征和不伴有該疾病患者的血液中紅細胞與血漿自體熒光光譜特征進行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)伴有高黏血癥組與不伴有高黏血癥組紅細胞的熒光光譜均在312.2 nm和609 nm處出現(xiàn)峰，但峰值有顯著差異，高黏血癥患者紅細胞中卟啉和氨基酸含量有所增加。

目前，血液的熒光光譜研究大部分集中在其光譜特性或者血液內(nèi)大分子有機物的含量變化，在考察外源小分子進入紅細胞與紅細胞內(nèi)相關(guān)物質(zhì)發(fā)生作用方面還存在空白。紅細胞的熒光光譜可以反映紅細胞吸收光子能量以后所發(fā)生的能量轉(zhuǎn)移情況。當外源小分子與紅細胞發(fā)生作用后，其熒光光譜可能會發(fā)生相應(yīng)變化。本研究結(jié)合熒光光譜法和HPLC技術(shù)研究典型PAEs鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)在離體人紅細胞內(nèi)的分布情況：分析紅細胞熒光光譜峰的來源，通過DMP作用后紅細胞熒光峰的變化判斷DMP對紅細胞組分的影響；利用HPLC測定染毒紅細胞中DMP的含量，從而加深對DMP與紅細胞相互作用機理的理解，為進一步研究PAEs在血液中的分布情況和毒性作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

DMP儲備液：量取一定量的DMP(國藥集團化學試劑有限公司，AR)配制成1.0×10-3mol·L-1溶液，0～4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用時稀釋；生理鹽水：稱取0.9 g氯化鈉(滬試，AR)，用水溶解并定容到100 mL，配制成0.9%的氯化鈉溶液；DMP的生理鹽水溶液(1.5×10-4mol·L-1)：準確移取一定量的DMP溶液于100 mL容量瓶中，用生理鹽水定容，配制成1.5×10-4mol·L-1的DMP生理鹽水溶液；紅細胞母液：取1 mL新鮮人血進行離心，棄去上清液加入生理鹽水震蕩后以2 000 r·min-1離心5 min，重復3次。將清洗好的紅細胞定容到10 mL作為紅細胞母液。在普通光學顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，確定紅細胞母液濃度為4.5×108ind·L-1。DMP標準品(aladdin)；甲醇(Mreda Technology Inc., HPLC grade)；實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法1.2.1 研究DMP對紅細胞影響的熒光光譜實驗

(1)紅細胞稀釋液的熒光光譜

分別準確移取不同量紅細胞母液于4 mL離心管中，用生理鹽水稀釋至刻度，搖勻，配制成稀釋不同倍數(shù)、不同濃度的紅細胞懸浮液，用F-2700熒光分光光度計(日本，Hitachi)掃描其熒光發(fā)射光譜。設(shè)定激發(fā)波長為278 nm，發(fā)射波長掃描范圍為220～790 nm，狹縫寬度為5 nm，電壓為700 V。

(2) DMP對紅細胞熒光光譜的影響

向4 mL離心管中依次加入0.4 mL紅細胞母液，不同量的DMP生理鹽水溶液，用生理鹽水定容，搖勻。靜置染毒，每隔0.5 h搖勻一次，4 h后離心棄去上清液，加入生理鹽水搖勻，以2 000 r·min-1離心5 min，重復3次，最后用生理鹽水將紅細胞定容到3 mL。用F-2700熒光分光光度計(日本，Hitachi)掃描紅細胞懸浮液的熒光發(fā)射光譜。設(shè)定激發(fā)波長為278 nm，發(fā)射波長掃描范圍為220～790 nm，狹縫寬度為5 nm，電壓為700 V。

1.2.2 分析染毒紅細胞內(nèi)DMP含量的高效液相色譜實驗

色譜條件[16-17]：色譜柱為Inertsll ODS-3 C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流動相V(甲醇):V(水)=75:25，運行時間5 min，流速1 mL·min-1，檢測波長為225 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

標準曲線：稱取100 μL DMP標準品到100 mL容量瓶中(精確至0.01 mg)，用甲醇配成標準儲備液(1 159 mg·L-1)。準確移取不同量標準溶液于10 mL具塞刻度試管中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成一系列稀釋液，用LC-20AT高效液相色譜(日本島津)測定。以上各溶液均在4 ℃冰箱中避光保存。

樣品處理：將1.2.1中完成熒光光譜測定的染毒紅細胞樣品離心，棄去上清液，用超純水定容至3 mL，溶血5 min，超聲處理使蛋白變性，然后以2 000 r·min-1離心5 min，取上清液用0.45 μm的水系濾膜過濾，用LC-20AT高效液相色譜(日本島津)測定DMP含量。以未染毒的紅細胞樣品作為對照組。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 DMP對紅細胞影響的熒光光譜法研究2.1.1 紅細胞熒光峰的分析

將紅細胞母液稀釋10倍，用熒光分光光度計在激發(fā)波長為278 nm條件下掃描得到其熒光光譜，如圖1所示?？梢钥闯?，紅細胞懸浮液的熒光發(fā)射光譜存在5個峰，其中，278 nm和556 nm處的峰為共振峰，熒光峰分別位于310 nm、490 nm和609 nm，310 nm處的熒光峰強度最大。

圖1 紅細胞稀釋液的熒光光譜圖Fig. 1 Fluorescence spectra of red blood cell (RBC) diluent (Conditions: c(RBCs)=4.5×107 ind·L-1; T=310 K; Ex=278 nm)

由于紅細胞成分較為復雜，含有多種熒光團，熒光峰的位置和強度會因紅細胞所處的物理、化學環(huán)境而變化，使熒光峰具有寬譜帶特征[15]。相關(guān)研究表明[18-19]，310 nm處的熒光峰由紅細胞內(nèi)的蛋白發(fā)出。蛋白質(zhì)的熒光來自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[18]，其熒光峰分別位于340 nm、303 nm和282 nm[19]，由此推斷，紅細胞懸浮液在310 nm處的熒光峰是3種氨基酸共同作用的結(jié)果。能發(fā)射位于490 nm波長附近熒光的紅細胞組分有以下幾種：1)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，其激發(fā)發(fā)射對為340-460 nm[11,20]；2)黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，其激發(fā)發(fā)射對為450-520 nm[11,20]；3)膜脂，在430-560 nm波段發(fā)射熒光[11]。由此推斷，490 nm處產(chǎn)生的熒光峰是NADPH、FAD和膜脂共同作用的結(jié)果。能發(fā)射位于609 nm波長附近熒光的紅細胞組分有以下2種[15]：1)鋅卟啉，吸收光子后發(fā)射590 nm的熒光，相應(yīng)的能級躍遷為1S1,0→0S0,0；2)原卟啉，吸收光子后發(fā)射630 nm和690 nm的熒光，相應(yīng)的能級躍遷為1S1,0→0S0,0和1S1,0→0S1,0，以630 nm熒光為主。因此，609 nm處出現(xiàn)的熒光峰應(yīng)為鋅卟啉和原卟啉二者發(fā)射的熒光疊加形成。紅細胞組分中蛋白含量較高，因此和490 nm和609 nm處熒光峰相比較，310 nm處熒光峰強度明顯要大。

另外，310 nm處熒光峰附近存在一個小峰(360 nm處)，其原因可能是：1)熒光發(fā)射過程中發(fā)生了共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)[20]；2)紅細胞所在生理鹽水溶液的拉曼光譜干擾紅細胞熒光光譜的結(jié)果[11]。具體原因還需要進一步的研究考證。

圖2 紅細胞濃度對紅細胞310 nm處熒光峰的影響Fig. 2 Effect of concentration of RBCs on the fluorescence peak at 310 nm (Conditions: T=310 K; Ex=278 nm)

2.1.2 紅細胞濃度對其熒光峰的影響

不同濃度的紅細胞懸浮液，其熒光峰強度不同。由圖2可以看出，紅細胞懸浮液位于310 nm處熒光峰的熒光強度隨濃度的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當細胞濃度為4.5×106ind·L-1(紅細胞母液稀釋100倍)時，熒光強度最大。圖3表明，隨著紅細胞懸浮液濃度增大，490 nm處熒光峰的峰強度逐漸下降，熒光強度與濃度存在相關(guān)關(guān)系，表明發(fā)生了濃度猝滅，其原因為[11]：1)此熒光峰對應(yīng)的激發(fā)態(tài)分子在發(fā)出熒光之前和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞導致自猝滅；2)對于紅細胞懸浮液，490 nm波長附近是強吸收波段。紅細胞濃度越低，發(fā)射的熒光相對于吸收光越占優(yōu)勢，檢測到的熒光強度越強。另外，隨紅細胞濃度增加，熒光光譜出現(xiàn)“紅移”現(xiàn)象(峰位置向長波方向移動)，這是由于濃度變化對熒光團電子能級產(chǎn)生的微擾發(fā)生變化導致[21]。

圖3 紅細胞濃度對紅細胞490 nm處熒光峰的影響Fig. 3 Effect of concentration of RBCs on the fluorescence peak at 490 nm (Conditions: T=310 K; Ex=278 nm)

對于由紅細胞內(nèi)蛋白發(fā)出的310 nm處熒光峰，雖然采用稀釋100倍的紅細胞懸浮液可以獲得最大峰強度，但考慮到采用HPLC技術(shù)檢測染毒后紅細胞內(nèi)的DMP，需要保證一定的紅細胞數(shù)量，因而后續(xù)DMP染毒體系采用稀釋10倍的紅細胞稀釋液，細胞濃度為4.5×107ind·L-1。

2.1.3 DMP對紅細胞熒光峰的影響

DMP染毒前后紅細胞的熒光光譜變化情況如圖4所示。隨著DMP濃度增大，310 nm處熒光峰強度明顯下降，490 nm、609 nm處熒光峰強度也出現(xiàn)下降，但幅度很小。結(jié)合2.1.1部分對紅細胞熒光峰的歸屬分析推測，DMP對紅細胞的NADPH、FAD和膜脂(490 nm處熒光峰)，以及鐵卟啉和鋅卟啉(609 nm處熒光峰)的影響可能較小，主要影響紅細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)(310 nm處熒光峰)。我們選擇來源廣泛、價格低廉的牛血紅蛋白BHb代替人血紅蛋白HHb(二者結(jié)構(gòu)差別較小，其氨基酸序列同源性高達85%)，研究了包括DMP在內(nèi)的PAEs與血紅蛋白(Hb)的結(jié)合機理[22]。結(jié)果表明[22]，在最佳激發(fā)波長(280 nm)激發(fā)下，BHb的最強熒光發(fā)射峰在340 nm附近(由于受蛋白種類、所處微環(huán)境等因素影響，有別于紅細胞蛋白熒光發(fā)射峰的位置310 nm)。進一步分析發(fā)現(xiàn)[22]，DMP能與Hb結(jié)合形成復合物，從而使其熒光發(fā)生猝滅(圖5)。因此，我們認為，310 nm處特征熒光光譜峰強度下降的原因為DMP與紅細胞內(nèi)的蛋白發(fā)生了結(jié)合。

2.2 染毒紅細胞內(nèi)DMP含量的HPLC分析

應(yīng)用HPLC技術(shù)，依據(jù)查得的最優(yōu)色譜條件測定紅細胞中的DMP濃度，DMP出峰時間為3.277 min。DMP標準品測得的標準曲線如圖6所示，回歸方程為：y=0.00656+0.20599x(可決系數(shù)R2=0.9994)。根據(jù)標準曲線得到染毒紅細胞內(nèi)DMP的含量，見表1。

圖4 鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)對紅細胞熒光峰的影響Fig. 4 Effect of dimethyl phthalate (DMP) on the fluorescence peak of RBCs (Conditions: c(RBCs)=4.5×107 ind·L-1; T=310 K; Ex=278 nm)

圖5 不同DMP濃度條件下血紅蛋白(BHb)的熒光光譜圖[22]Fig. 5 BHb fluorescence under different DMP concentrations[22] (Conditions: c(BHb)=3×10-6 mol·L-1; c(DMP) from a to f is 0, 0.75, 1.5, 2.25, 3, 4.5×10-5 mol·L-1; pH 7.4; T=293 K; Ex=280 nm)

從表1中可以看出，在經(jīng)DMP染毒后的紅細胞樣品內(nèi)檢測到了DMP，表明DMP可以進入紅細胞，其進入量C隨暴露量C0增加而增加，但進入量和暴露量的比值C/C0隨暴露量增加而減少，其原因還需要進一步深入探究。

綜上所述，本文應(yīng)用熒光光譜法和高效液相色譜法(HPLC)從細胞水平上探究了DMP在離體人紅細胞內(nèi)的分布，主要結(jié)論如下：(1) 熒光光譜實驗結(jié)果表明，紅細胞在310 nm、490 nm和609 nm處各具有一個熒光峰，分別歸屬于：紅細胞內(nèi)的蛋白；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和膜脂；鋅卟啉和原卟啉；

圖6 DMP的HPLC標準曲線Fig. 6 The standard curve for DMP determined by HPLC

表1 紅細胞中DMP的濃度Table 1 Concentration of DMP in RBCs

(2) 經(jīng)DMP染毒后，紅細胞位于310 nm處的熒光峰強度明顯下降，表明DMP與紅細胞內(nèi)的蛋白發(fā)生了結(jié)合；490 nm和609 nm處熒光峰強度下降不明顯；(3) HPLC實驗結(jié)果表明，DMP可以進入紅細胞，其進入量隨暴露量增加而增加，進入量和暴露量的比值隨暴露量增加而減少。

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◆

DistributionandLevelofDimethylPhthalateinErythrocytesinVitro

Chi Zhenxing1,2,*, Wang Donglin1,3, Ling Jiajia1, Song Xuemei4, Wang Mingjing4

1. School of Marine Science and Technology, Harbin Institute of Technology, Weihai, Weihai 264209, China2. Guangzhou Key Laboratory of Environmental Exposure and Health, School of Environment, Jinan University, Guangzhou 510632, China3. State Key Joint Laboratory of Environment Simulation and Pollution Control, School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China4. Weihai Blood Center, Weihai 264200, China

10.7524/AJE.1673-5897.20160925001

1673-5897(2017)3-446-07

X171.5

A

池振興(1983—)，男，博士，講師，主要研究方向為環(huán)境污染與健康。

國家自然科學基金(21707026)；廣州市環(huán)境暴露與健康重點實驗室開放基金(GZKLEEH201613)

池振興(1983-)，男，博士，研究方向為環(huán)境污染與健康，E-mail: zhenxingchi@gmail.com

池振興, 王東麟, 凌嘉佳, 等. 鄰苯二甲酸二甲酯在離體人紅細胞內(nèi)的分布和含量研究[J]. 生態(tài)毒理學報，2017, 12(3): 446-452

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