石墨烯與抑癌基因p53 DNA片段相互作用的分子模擬與光譜學(xué)驗(yàn)證

吳惠豐，張明興，李斐，曹天貴，李雪花，趙建民

1. 中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 中國科學(xué)院環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，煙臺(tái) 2640032. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，青島 2662373. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 1000494. 大連理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院 工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116024

石墨烯與抑癌基因p53 DNA片段相互作用的分子模擬與光譜學(xué)驗(yàn)證

吳惠豐1,2,*，張明興1,3，李斐1，曹天貴1，李雪花4，趙建民1

1. 中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 中國科學(xué)院環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，煙臺(tái) 2640032. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，青島 2662373. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 1000494. 大連理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院 工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116024

石墨烯(graphene, G)及其衍生物由于具有獨(dú)特的理化性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于能源、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，但尚缺乏其對(duì)生物體和環(huán)境潛在危害的研究。采用分子動(dòng)力學(xué)模擬并結(jié)合光譜學(xué)方法(紫外可見吸收光譜、紫外變溫實(shí)驗(yàn)及熒光光譜)，分析了石墨烯與抑癌基因p53啟動(dòng)子區(qū)DNA片段(p53-DNA)間的相互作用，并探討了相關(guān)作用機(jī)制。石墨烯的部分芳香環(huán)與p53-DNA堿基的芳香環(huán)之間存在π-π堆積作用，兩者可以通過嵌插作用進(jìn)行結(jié)合，同時(shí)還通過溝槽作用進(jìn)一步結(jié)合。光譜實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，在石墨烯作用下，p53-DNA的熔點(diǎn)(Tm)值升高，EB-DNA體系發(fā)生靜態(tài)熒光淬滅，說明石墨烯能與p53-DNA結(jié)合；同時(shí)，p53-DNA與石墨烯結(jié)合后在260 nm處的吸光度升高，說明石墨烯對(duì)p53-DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)具有一定的破壞作用。上述研究結(jié)果從分子水平上分析了石墨烯與p53-DNA間的相互作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步闡明石墨烯的毒性作用機(jī)理。

石墨烯；p53-DNA；相互作用；分子動(dòng)力學(xué)模擬；光譜法

Received4January2017accepted2March2017

Abstract: Graphene and its derivatives have been widely used in the fields ranging from energy to biomedicine because of its peculiar physical and chemical properties. However, limited attention has been paid to potential hazards of graphene to organisms and environments. In this study, the interaction between graphene and the promoter region of p53gene (p53-DNA) was investigated using molecular dynamics simulation (MD) technology and spectroscopic methods based on the combination of UV-vis absorption, DNA melting point test and fluorescent spectra, followed by the illustration of the interaction mechanism. MD results showed that some aromatic moieties of graphene could intercalate into the p53-DNA base pairs, which relied on π-π stacking interaction between aromatic moieties of graphene and p53-DNA base, and the other parts of graphene could further combine with p53-DNA by groove binding. Moreover, spectroscopic tests exhibited that graphene could increase the melting point (Tm) of p53-DNA and lead to static fluorescence quenching of EB-DNA system, suggesting that graphene was indeed able to bind with p53-DNA. Meanwhile, the ascent of absorbance of260nm was found in the p53-DNA as a result of the combination of graphene and p53-DNA, which meant graphene posed some effect on the double helix structure of p53-DNA. In conclusion, the mechanism of interaction between graphene and p53-DNA was investigated at molecular level in this study, which contributed to a further understanding of the toxicological effects of graphene.

Keywords: graphene(G);p53-DNA;binding interaction;molecular dynamics simulations;spectroscopic methods

計(jì)算毒理學(xué)(computational toxicology)是一門將計(jì)算機(jī)技術(shù)應(yīng)用于毒理學(xué)領(lǐng)域而產(chǎn)生的新興學(xué)科，涉及到計(jì)算化學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、分子生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)等多個(gè)學(xué)科，旨在利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)和數(shù)學(xué)計(jì)算來預(yù)測和分析化學(xué)污染物的毒副作用及作用機(jī)制[1]。由于目前化學(xué)品的種類非常多，且數(shù)量還在不斷增長[2]，傳統(tǒng)的毒理學(xué)試驗(yàn)已經(jīng)很難滿足生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的需求，因此以計(jì)算機(jī)模擬為基礎(chǔ)的計(jì)算毒理學(xué)成為對(duì)有毒化合物進(jìn)行篩選和評(píng)估的高效工具[3]?；谂潴w-受體相互作用的分子模擬技術(shù)(molecular modeling)是計(jì)算毒理學(xué)研究中的一種重要手段[4]。而隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速發(fā)展，各種分子模擬技術(shù)被迅速應(yīng)用于研究環(huán)境污染物與DNA/蛋白質(zhì)等生物大分子之間的相互作用[5]。其中，分子對(duì)接(molecular docking)和分子動(dòng)力學(xué)模擬(molecular dynamics simulations, MD)技術(shù)可以模擬有機(jī)污染物與生物分子間的結(jié)合模式，有助于深入理解分子間的相互作用機(jī)制并揭示污染物的毒性作用機(jī)理，因而獲得了較為廣泛的應(yīng)用[6]。

p53基因是目前已知的人類腫瘤基因中最主要的腫瘤抑制基因，許多腫瘤的發(fā)生都與其突變有關(guān)[7]。當(dāng)某種污染物分子與p53基因相互作用并結(jié)合時(shí)，DNA的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄就會(huì)受到影響，如果這種作用力很強(qiáng)(嵌插或共價(jià)結(jié)合)，則很可能會(huì)導(dǎo)致p53基因的突變，從而增加發(fā)生癌變的幾率[8]。p53基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA片段(p53-DNA)是研究p53與污染物相互作用模式的常用基因片段[9]。

石墨烯(graphene, G)是一種新型二維碳納米材料，由于具有獨(dú)特的熱學(xué)、光學(xué)、電學(xué)、力學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)在材料、能源、催化及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[10-12]。隨著生產(chǎn)工藝的改進(jìn)，石墨烯及其衍生物的生產(chǎn)成本逐漸降低，其使用領(lǐng)域和生產(chǎn)規(guī)模隨之不斷擴(kuò)大[13-14]，但在生產(chǎn)、使用和廢舊材料處理的過程中也會(huì)產(chǎn)生更多的含石墨烯衍生物的垃圾，進(jìn)而在空氣、水體、土壤中轉(zhuǎn)移和積累，對(duì)生物體和人類產(chǎn)生潛在的威脅[15-16]。已有研究表明石墨烯及其衍生物具有一定的生物毒性，因此石墨烯及其衍生物對(duì)生物體和環(huán)境的影響受到了越來越多的關(guān)注[17-19]。Mu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯橫向尺寸的大小對(duì)其穿過細(xì)胞膜的難易程度有直接影響。Ma等[21]研究也表明，當(dāng)石墨烯尺寸較大時(shí)更容易吸附到細(xì)胞表面，而小尺寸的石墨烯則很容易通過胞吞作用或者直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。因此當(dāng)生物體或細(xì)胞暴露于石墨烯時(shí)，較小尺寸的石墨烯很有可能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并與DNA發(fā)生相互作用，影響DNA的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，并可能進(jìn)一步導(dǎo)致基因突變。所以在分子水平上研究石墨烯與p53-DNA相互作用的機(jī)制可以為進(jìn)一步研究石墨烯的毒理效應(yīng)提供一定的依據(jù)。

光譜學(xué)方法(如熒光光譜、紫外可見吸收光譜、圓二色光譜和拉曼光譜等)是研究小分子污染物與DNA分子間相互作用的常用實(shí)驗(yàn)方法[22]，但每種光譜都存在著一定的局限性，而基于計(jì)算機(jī)技術(shù)的分子模擬方法則可以預(yù)測分子間的相互作用模式，分析分子間的相互作用機(jī)制，能夠彌補(bǔ)光譜學(xué)方法的不足。相對(duì)有機(jī)小分子，石墨烯有較大的尺寸，不利于與DNA的結(jié)合，但由于其厚度在納米尺度并且邊緣活性較高，所以很可能會(huì)通過邊緣部分與DNA結(jié)合。本研究使用p53-DNA作為研究對(duì)象，通過分子動(dòng)力學(xué)模擬研究了石墨烯與p53-DNA之間的相互作用機(jī)制，分析了石墨烯對(duì)p53-DNA可能造成的影響，并通過紫外可見吸收光譜、紫外變溫實(shí)驗(yàn)以及熒光光譜等手段檢測了石墨烯與p53-DNA的結(jié)合作用，對(duì)分子模擬的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：U-3900H型紫外/可見分光光度計(jì)(日本Hitachi)；LS55型熒光光度計(jì)(美國Perkin Elmer)；MultiMode 8型原子力顯微鏡(AFM, 美國Veeco)。

試劑：p53-DNA(中國，上海生工生物技術(shù)有限公司)；石墨烯(水溶液，濃度為1.0 g·L-1)購自美國Sigma-Aldrich(貨號(hào)：799092)；溴化乙錠(EB，純度>99%，美國Sigma-Aldrich)；磷酸緩沖液(PBS, 0.1 mol·L-1, pH = 7.4)由Na2HPO4和NaH2PO4配制。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，超純水使用Cascada LS(美國Pall)超純水機(jī)生產(chǎn)。

1.2 分子模擬

通過make-na server網(wǎng)站(http://structure.usc.edu/make-na/server.html)獲得p53-DNA的三維結(jié)構(gòu)。該網(wǎng)站內(nèi)置了Nucleic Acid Builder (NAB)程序，目前廣泛應(yīng)用于核酸(DNA和RNA)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測[23-24]。本研究使用Discovery Studio 2.5(簡稱DS 2.5)軟件中的CDOCKER算法進(jìn)行分子模擬。CDOCKER算法是一種基于格點(diǎn)的分子對(duì)接方法，可以通過CHARMm優(yōu)化力場進(jìn)行柔性對(duì)接，采用高溫動(dòng)力學(xué)模擬產(chǎn)生配體分子的空間構(gòu)象，并使用模擬退火對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，可以精確地計(jì)算受體-配體的相互作用能和配體的張力[25-26]。參數(shù)設(shè)置中設(shè)定輸出10個(gè)平均構(gòu)象，其他參數(shù)不作更改，根據(jù)對(duì)接能量進(jìn)行打分和篩選，受體與配體的對(duì)接親和力越大則對(duì)接能的負(fù)絕對(duì)值越大。通過分子對(duì)接，可以獲得石墨烯與p53-DNA復(fù)合物的構(gòu)象，從而分析石墨烯與p53-DNA間的關(guān)鍵相互作用。

在DS 2.5軟件中使用CHARMm力場對(duì)石墨烯與p53-DNA復(fù)合物體系進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬(MD)。為了保證對(duì)復(fù)合物體系進(jìn)行模擬時(shí)有足夠的構(gòu)象變化空間，使用TIP3P水模型作為溶劑，并在溶質(zhì)外層空間加上厚度為7 ?的水分子層。同時(shí)，需要在體系中添加適量的鈉離子，用來平衡多余的負(fù)電荷，從而保證體系為電中性。在MD模擬之前，先使用最陡下降法對(duì)體系進(jìn)行一次能量優(yōu)化(設(shè)置最大的優(yōu)化步數(shù)為6 000步)，以消除高能碰撞的影響。分2步進(jìn)行MD模擬：首先在設(shè)定溫度從50 K緩慢升高到300 K的情況下對(duì)p53-DNA分子進(jìn)行20 ps的MD模擬；然后再對(duì)整個(gè)復(fù)合物體系進(jìn)行500 ps的MD模擬，恒溫恒壓下進(jìn)行，不作任何約束條件，每0.5 ps存寫一次三維構(gòu)象。在上述MD模擬過程中，將步長設(shè)置為2 fs，靜電和范德華等非成鍵相互作用的截?cái)嘀蛋霃皆O(shè)為14 ?。

1.3 制備雙鏈p53-DNA

p53-DNA的2條單鏈序列分別為：5′-CCTCCTCCCCAACTCC-3′，5′-GGAGTTGGGGAGGAGG-3′。使用PBS緩沖液將2條單鏈互補(bǔ)DNA溶解(5×10-4mol·L-1)，于85 ℃保持12 min，之后緩慢冷卻至室溫，即得5×10-4mol·L-1的雙鏈p53-DNA溶液。檢測所得p53-DNA樣品在260 nm和280 nm處的紫外吸收，其吸光度的比值A(chǔ)260/A280達(dá)到1.84，表明已合成DNA雙鏈，符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.4 紫外光譜檢測

在進(jìn)行光譜學(xué)研究之前，首先使用原子力顯微鏡(AFM)對(duì)石墨烯納米顆粒進(jìn)行尺寸表征，測量其厚度和橫向尺寸的大小。由于石墨烯沒有標(biāo)準(zhǔn)的分子量，無法得知其摩爾濃度，故通過尺寸大小大致估計(jì)其分子量，然后使用質(zhì)量濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

將p53-DNA分別與不同濃度的石墨烯混合，使p53-DNA終濃度為1×10-6mol·L-1，石墨烯終濃度依次為0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg·L-1，實(shí)驗(yàn)前將石墨烯超聲震蕩30 min以使納米顆粒均勻分散。靜置反應(yīng)2 h后，檢測其紫外可見吸收光譜，參比溶液為PBS緩沖液，掃描范圍220～340 nm。

1.5 紫外變溫實(shí)驗(yàn)

將p53-DNA分別與石墨烯混合，使p53-DNA終濃度為1×10-6mol·L-1，石墨烯終濃度為1.0 mg·L-1，然后程序升溫(25℃ ～95 ℃)，測定不同溫度下純DNA及混合溶液在260 nm處的吸光度，參比溶液為PBS緩沖液。

1.6 熒光光譜檢測

將EB加入p53-DNA溶液，使溶液中EB和DNA的濃度比為6∶1，避光反應(yīng)30 min，從而得到EB-DNA復(fù)合物體系。將EB-DNA體系分別與不同濃度的石墨烯混合，使p53-DNA終濃度為1×10-6mol·L-1，石墨烯終濃度分別為0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg·L-1，混合前將石墨烯超聲震蕩30 min?；旌暇鶆蚝蟊芄夥磻?yīng)2 h，然后進(jìn)行熒光光譜掃描，激發(fā)波長設(shè)為480 nm，發(fā)射波長掃描范圍設(shè)為500～800 nm。

2 結(jié)果(Results)

2.1 分子模擬結(jié)果

有機(jī)小分子與DNA之間的結(jié)合通常為非共價(jià)模式，主要包括靜電結(jié)合、嵌插結(jié)合及溝槽結(jié)合等3種方式[27]。在這3種方式中，靜電結(jié)合不具備選擇性，但嵌插和溝槽結(jié)合卻具有選擇性，均對(duì)DNA分子的構(gòu)象有一定的影響，且嵌插作用的影響更大[28-29]。分子對(duì)接可以獲得石墨烯與p53-DNA復(fù)合物的空間構(gòu)象，選擇其最佳結(jié)合構(gòu)象，進(jìn)行了近300 ps的MD研究。圖1所示為石墨烯與p53-DNA相互作用的模型圖，可以看出，石墨烯的部分芳香環(huán)與p53-DNA堿基的芳香環(huán)具有很強(qiáng)的π-π堆積作用，能夠嵌插到p53-DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，使石墨烯與p53-DNA牢固結(jié)合。同時(shí)，石墨烯的其余部分在p53-DNA的溝槽中沿著磷酸骨架伸展，通過溝槽作用增強(qiáng)了兩者的結(jié)合。圖2顯示了復(fù)合物碳骨架的均方根誤差(RMSD)隨時(shí)間變化的趨勢，從中可以看出石墨烯與p53-DNA復(fù)合物的RMSD在50 ps后趨于平衡，說明復(fù)合物形成后逐漸趨于穩(wěn)定。

圖1 石墨烯與p53-DNA相互作用的分子模擬圖注：黃色線表示π-π作用。Fig. 1 The molecular simulation of graphene and p53-DNANote: Yellow lines indicate π-π stacking interaction.

2.2 紫外可見吸收光譜和變溫實(shí)驗(yàn)

通過AFM掃描結(jié)果，可知實(shí)驗(yàn)中所使用的石墨烯的厚度約為1 nm，尺寸為10～50 nm。

圖3為不同濃度的石墨烯作用前后p53-DNA的紫外可見吸收光譜。從圖3可以看出，p53-DNA在260 nm附近出現(xiàn)最大光吸收峰，石墨烯作用后其260 nm處的吸光度升高，且隨著石墨烯濃度的增加而不斷升高，產(chǎn)生增色效應(yīng)，最大增色幅度達(dá)到11.5%。當(dāng)DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞導(dǎo)致氫鍵斷裂形成單鏈時(shí)，其260 nm處的吸光度就會(huì)升高[30]。因此，紫外可見吸收光譜測定結(jié)果表明，石墨烯能夠?qū)53-DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的破壞作用。

圖4為在1.0 mg·L-1的石墨烯加入前后p53-DNA的紫外變溫曲線(熔解曲線)。連續(xù)升溫可以使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致氫鍵斷裂形成單鏈，從而使DNA溶液在260 nm處的吸光度升高。加熱過程中使DNA雙螺旋解開的溫度范圍中點(diǎn)處的溫度稱為DNA的熔點(diǎn)(Tm)，可由熔解曲線計(jì)算得出。小分子通過嵌插作用與DNA結(jié)合后能夠改變其雙螺旋結(jié)構(gòu)，最高可使Tm增加5 ℃ ～8 ℃，其他結(jié)合方式則不會(huì)對(duì)Tm產(chǎn)生顯著影響[22]。經(jīng)計(jì)算，純p53-DNA的Tm值為65 ℃，加入1.0 mg·L-1的石墨烯后Tm值升高到66.5 ℃。說明石墨烯的部分結(jié)構(gòu)通過嵌插作用與p53-DNA結(jié)合，并改變了p53-DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。

圖2 石墨烯與p53-DNA復(fù)合物碳骨架RMSD 隨時(shí)間變化的趨勢圖Fig. 2 The RMSD changing trend of graphene and p53-DNA complex

圖3 石墨烯作用前后p53-DNA的紫外可見吸收光譜注：1～7分別表示石墨烯的不同濃度組0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg·L-1。Fig. 3 Ultraviolet absorption spectra of p53-DNA before and after graphene treatmentNote: The concentration groups of graphene from 1 to 7 are 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg·L-1.

圖4 石墨烯加入前后p53-DNA的熔解曲線Fig. 4 Melting curves of p53-DNA in the absence and presence of graphene

2.3 熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)檢測，DNA、EB和石墨烯本身的熒光強(qiáng)度均很弱，而EB和DNA結(jié)合形成EB-DNA復(fù)合體系后則具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，因此可通過構(gòu)建EB-DNA熒光探針體系來分析石墨烯與DNA的相互作用。圖5為不同濃度的石墨烯與EB-DNA體系作用前后的熒光光譜圖。從圖5可以看出，EB-DNA體系熒光光譜的峰位在598 nm左右，并且隨著石墨烯濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐步減弱，說明石墨烯在一定程度上導(dǎo)致EB-DNA體系的熒光淬滅。當(dāng)石墨烯濃度最高(1.0 mg·L-1)時(shí)，熒光強(qiáng)度下降了10.6%。

根據(jù)經(jīng)典熒光淬滅理論，可通過Stern-Volmer方程求得有機(jī)小分子對(duì)EB-DNA體系的熒光淬滅常數(shù)(Ksv)和淬滅速率常數(shù)(Kq)[31]。石墨烯雖然本身尺寸較大，但由于其厚度在納米尺度并且邊緣活性較高，所以也可如有機(jī)小分子一樣計(jì)算其熒光淬滅常數(shù)Ksv。經(jīng)計(jì)算，石墨烯對(duì)EB-DNA體系的Ksv值為131 L·g-1。根據(jù)片層的厚度和尺寸大小可估計(jì)出石墨烯的大致分子量，使用摩爾濃度(L·mol-1)換算后其Ksv可超過105數(shù)量級(jí)。石墨烯對(duì)EB-DNA體系的淬滅速率常數(shù)Kq為1.31×1010L·g-1·s-1，換算成摩爾濃度表示(L·mol-1·s-1)則高于1013數(shù)量級(jí)。一般認(rèn)為，生物大分子發(fā)生動(dòng)態(tài)淬滅時(shí)其Kq值不會(huì)超過2×1010L·mol-1·s-1，實(shí)驗(yàn)中測得的Kq值遠(yuǎn)大于此，因此可認(rèn)為石墨烯使EB-DNA體系發(fā)生熒光淬滅的過程是靜態(tài)淬滅[32]。

圖5 石墨烯作用前后溴化乙錠-DNA(EB-DNA) 體系的熒光光譜圖注：1～7表示不同的石墨烯濃度0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg·L-1。Fig. 5 Fluorescence spectra of ethylene dibromide-DNA (EB-DNA) with grapheneNote: Concentrations of graphene (1-7) is 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg·L-1.

此外，可通過Scatchard關(guān)系式計(jì)算靜態(tài)淬滅中有機(jī)物分子與DNA之間的表觀結(jié)合常數(shù)(Ka)[33]。經(jīng)計(jì)算，石墨烯與p53-DNA之間的表觀結(jié)合常數(shù)Ka為717 L·g-1，用摩爾濃度表示(L·mol-1)則大于105數(shù)量級(jí)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.21。

結(jié)合紫外可見吸收光譜和紫外變溫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可推斷石墨烯通過以下2種方式導(dǎo)致EB-DNA體系的熒光淬滅：(1) 石墨烯與EB存在著競爭關(guān)系，兩者會(huì)競爭性地通過嵌插作用與p53-DNA結(jié)合，而隨著石墨烯濃度的不斷增加，嵌入p53-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的EB就會(huì)被石墨烯置換出來，使體系中EB-DNA復(fù)合體的濃度降低，熒光強(qiáng)度也隨之降低；(2) 石墨烯可以通過溝槽作用與p53-DNA結(jié)合，從而改變p53-DNA的構(gòu)象，使EB脫離雙螺旋結(jié)構(gòu)。結(jié)合分子模擬的結(jié)果分析，以上2種方式同時(shí)存在，嵌插作用與溝槽結(jié)合作用共同導(dǎo)致了石墨烯與p53-DNA的結(jié)合。

3 討論(Discussion)

石墨烯是一種二維碳納米材料，雖然在厚度上處于納米級(jí)別，但其平面尺寸卻相對(duì)有機(jī)小分子大得多，所以不可能像有機(jī)小分子那樣完全或大部分嵌入DNA分子中。但由于石墨烯分子很薄且邊緣具有很高的活性，所以石墨烯可以通過邊緣部分嵌入DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，從而穩(wěn)定結(jié)合并改變DNA的構(gòu)象。本研究使用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法分析了石墨烯與p53-DNA間相互作用的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)石墨烯的部分芳香環(huán)與p53-DNA堿基的芳香環(huán)間具有很強(qiáng)的π-π堆積作用，能夠嵌插到p53-DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，使石墨烯與p53-DNA牢固結(jié)合?？臻g位阻對(duì)化合物與DNA的相互作用方式具有很大的影響[34-35]，同種化合物經(jīng)過表面修飾后與DNA的作用方式也會(huì)發(fā)生變化[36]，石墨烯邊緣的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)有利于其與p53-DNA通過嵌插作用結(jié)合。同時(shí)，由于石墨烯平面尺寸相對(duì)有機(jī)小分子大得多，它的其余部分可以在p53-DNA的溝槽中沿著磷酸骨架伸展，通過溝槽作用增強(qiáng)兩者的結(jié)合。有機(jī)小分子通常只會(huì)以一種方式與DNA結(jié)合[37]，而石墨烯能同時(shí)通過嵌插作用和溝槽作用與p53-DNA結(jié)合，展示了其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。

光譜學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了分子模擬的準(zhǔn)確性。在石墨烯作用下，p53-DNA的Tm值升高并且EB-DNA體系發(fā)生明顯的靜態(tài)熒光淬滅，說明石墨烯的部分結(jié)構(gòu)能夠通過嵌插作用與p53-DNA結(jié)合，并改變p53-DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。同時(shí)，石墨烯與p53-DNA的結(jié)合使p53-DNA在260 nm處的吸光度增加，產(chǎn)生增色效應(yīng)。有機(jī)物分子與DNA結(jié)合后，通常都會(huì)對(duì)DNA的分子構(gòu)象產(chǎn)生影響[38]。紫外增色效應(yīng)說明石墨烯在與p53-DNA相結(jié)合的過程中改變了其構(gòu)象，導(dǎo)致其雙螺旋結(jié)構(gòu)受到一定的破壞。所以當(dāng)石墨烯進(jìn)入細(xì)胞后，很可能會(huì)對(duì)DNA的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄等功能產(chǎn)生影響，甚至導(dǎo)致基因突變。光譜學(xué)研究表明，具有平面芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的分子更容易嵌插到DNA的配對(duì)堿基對(duì)之間，與DNA的結(jié)合作用更強(qiáng)[39]。本研究中石墨烯分子具有眾多的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，同樣顯示出與p53-DNA有較強(qiáng)的結(jié)合作用。

在研究污染物與生物大分子相互作用時(shí)，使用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法進(jìn)行理論預(yù)測，同時(shí)通過實(shí)驗(yàn)方法加以驗(yàn)證，理論與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，可以使結(jié)果更加準(zhǔn)確[40-41]。光譜學(xué)方法是研究化合物與DNA分子相互作用的常用實(shí)驗(yàn)方法[42]，多種光譜學(xué)方法的應(yīng)用可以較為準(zhǔn)確地得到化合物與DNA相互作用的信息[43]。本研究通過分子模擬與多種光譜學(xué)方法，從理論和實(shí)驗(yàn)兩方面研究了石墨烯與p53-DNA間的相互作用，獲得了基本一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Tian等[44]及Silva等[45]在研究污染物與DNA的相互作用時(shí)，也采用了分子模擬與光譜學(xué)研究相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)分子模擬所預(yù)測的分子結(jié)合方式能夠很好地解釋光譜學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

綜上，本研究采用分子模擬與光譜學(xué)方法共同研究了石墨烯與p53-DNA間的相互作用，兩者結(jié)果基本一致并相互補(bǔ)充。石墨烯的部分芳香環(huán)與p53-DNA堿基的芳香環(huán)之間具有很強(qiáng)的π-π堆積作用，主要通過嵌插作用相互結(jié)合。同時(shí)，石墨烯與p53-DNA之間還存在溝槽作用，增強(qiáng)了兩者的結(jié)合。石墨烯在與p53-DNA結(jié)合后對(duì)其雙螺旋結(jié)構(gòu)具有一定的破壞作用。本研究從分子水平上闡明了石墨烯與p53-DNA間的相互作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究其毒理效應(yīng)提供了依據(jù)。

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◆

StudiesontheInteractionbetweenGrapheneandp53-DNAbyMolecularDynamicsSimulationsandSpectroscopicMethods

Wu Huifeng1,2,*, Zhang Mingxing1,3, Li Fei1, Cao Tiangui1, Li Xuehua4, Zhao Jianmin1

1. Key Laboratory of Coastal Environmental Processes and Ecological Remediation of Chinese Academy of Sciences, Yantai Institute of Coastal Zone Research (YIC), Chinese Academy of Sciences, Yantai264003, China2. Functional Laboratory of Marine Fisheries Science and Food Production Process, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao266237, China3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing100049, China4. Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering, School of Environmental Science and Technology, Dalian University of Technology, Dalian116024, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170104001

2017-01-04錄用日期2017-03-02

1673-5897(2017)3-243-08

X171.5

A

吳惠豐(1977-)，男，理學(xué)博士，研究員，主要從事生態(tài)毒理與計(jì)算毒理學(xué)方面的研究。

國家自然科學(xué)基金(41530642, 21677173)；中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)資助(2017255)

吳惠豐(1977-)，男，研究員，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)和計(jì)算毒理學(xué)，E-mail: hfwu@yic.ac.cn

吳惠豐, 張明興, 李斐, 等. 石墨烯與抑癌基因p53 DNA片段相互作用的分子模擬與光譜學(xué)驗(yàn)證[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(3): 243-250

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