大連地區(qū)唐氏篩查孕中期婦女羊水中甲狀腺激素水平與PBDEs內(nèi)暴露關(guān)系初探

韓璐，尚小娜，于華，郭邑，么建萍，王雨新，劉曉暉，李亞晨,*，邵靜,#

1. 大連市婦產(chǎn)醫(yī)院暨婦幼保健院，大連 1160332. 大連醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，大連 116044

大連地區(qū)唐氏篩查孕中期婦女羊水中甲狀腺激素水平與PBDEs內(nèi)暴露關(guān)系初探

韓璐1，尚小娜2，于華1，郭邑1，么建萍1，王雨新1，劉曉暉2，李亞晨2,*，邵靜2,#

1. 大連市婦產(chǎn)醫(yī)院暨婦幼保健院，大連 1160332. 大連醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，大連 116044

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一類常用的溴代阻燃劑，由于使用廣泛，已成為普遍存在的環(huán)境污染物。研究表明，PBDEs具有內(nèi)分泌干擾作用，影響甲狀腺功能，對(duì)胚胎發(fā)育、嬰幼兒及兒童的健康存在潛在的危害。本研究采集了100例具羊水穿刺指征的孕婦的孕中期羊水樣本，采用羅氏全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定羊水中促甲狀腺激素(TSH)、三碘甲狀腺原氨酸(TT3)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、甲狀腺素(TT4)、游離甲狀腺素(FT4)、抗甲狀腺過(guò)氧化酶抗體(TPOA)和抗甲狀腺球蛋白抗體(TGA)的含量，用氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜法測(cè)定羊水樣品中16種PBDEs同系物含量。結(jié)果顯示，羊水中TSH、TT3、FT3、TT4、FT4中位數(shù)分別為0.342 μIU·mL-1、0.949 nmol·L-1、1.52 pmol·L-1、11.02 nmol·L-1和3.91 pmol·L-1，95%參考區(qū)間值分別為0.174～0.872 μIU·mL-1、0.835～1.01 nmol·L-1、1.26～2.72 pmol·L-1、9.42～20.68 nmol·L-1和2.16～6.35 pmol·L-1。具有唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)和甲狀腺激素水平低下的羊水樣品中共檢出6種BDEs(BDE-47、BDE-71、BDE-138、BDE-183、BDE-190、BDE-209)，其中BDE-71、183和190在被檢羊水樣品中均被檢出，并且，TSH水平低下的羊水中BDE-190和209負(fù)荷水平顯著高于正常組。這些結(jié)果提示，大連地區(qū)孕中期婦女羊水存在PBEDs內(nèi)暴露，并且PBDEs內(nèi)暴露可能與羊水的甲狀腺激素水平低下、尤其TSH水平升高有關(guān)，提示PBDEs暴露可能與胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷產(chǎn)生的下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸功能失調(diào)有關(guān)。因此，羊水PBDEs內(nèi)暴露對(duì)新生兒出生結(jié)局的影響值得進(jìn)一步關(guān)注。

PBDEs；甲狀腺激素；羊水；唐氏篩查；氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜檢測(cè)

Received20 January 2017accepted13 March 2017

Abstract: Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) have been widely used as flame retardants for several decades leading to high levels of presence in the environmental media and frequent detection in biological specimens. It has been well documented that PBDEs can disrupt the endocrine system, and by interfering the thyroid hormones, they pose harmful effects on fetal development resulting in adverse health problems in offspring. The current study recruited 100 women who were at the mid-stage of pregnancy and undergoing amniocentesis. We collected their amniotic fluid samples. The levels of thyroid hormones in amniotic fluid were analyzed by Roche automatic electrochemiluminescence immunoassay analyzer, including thyroid stimulating hormone (TSH), total triiodothyronine (TT3), free triiodothyronine (FT3), total thyroxine (TT4), free thyroxine (FT4), thyroid peroxidase antibody (TPOA) and thyroglobulin antibody (TGA), and the levels of PBDEs in amniotic fluid were detected using the GC-NCI-MS. To summarize, the median and reference interval (RI) were calculated for each of TSH (0.342 μIU·mL-1, 95% RI: 0.174-0.872 μIU·mL-1), TT3 (0.949 nmol·L-1, 95% RI: 0.835-1.01 nmol·L-1), FT3 (1.52 pmol·L-1, 95% RI: 1.26-2.72 pmol·L-1), TT4 (11.02 nmol·L-1, 95% RI: 9.42-20.68 nmol·L-1) and FT4 (3.91 pmol·L-1, 95% RI: 2.16-6.35 pmol·L-1) by the non-parametric method. A subset of amniotic fluid samples, based on the selection criteria of Down syndrome high risk and/or thyroid hormone deficiency, was assessed on the levels of 16 PBDE congeners. The correlation between the levels of PBDEs and the risks for thyroid hormone deficiency and Down syndrome was examined. Among 16 PBDE congeners, 6 (BDE-47, 71, 138, 183, 190 and BDE-209) were detected in the amniotic fluid samples of three groups, and among them, 3 (BDE-71, 183 and 190) were found in all 3 groups. While the high levels of BDE-190 and 209 exposure were not suggested for high risk of Down syndrome, the correlation between the levels of BDE-190 and 209 in amniotic fluid and high risk of low TSH in amniotic fluid was established. Our data indicate that maternal exposure to PBDEs during early pregnancy may place developing fetuses in high risks of neuronal injuries and resultant disruption on hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis and adverse outcomes in newborns.

Keywords: PBDEs; thyroid hormones; amniotic fluid; Down syndrome; GC-NCI-MS

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一類添加型阻燃劑，廣泛應(yīng)用于工業(yè)產(chǎn)品和家庭消費(fèi)品中，如電視、電腦、裝飾物、沙發(fā)、床墊等，導(dǎo)致生態(tài)和生活環(huán)境的污染。PBDEs共有209種同系物，其中多種同系物已被列為持久性有機(jī)污染物[1-2]。近30年來(lái)，PBDEs在室內(nèi)污染有逐年增高趨勢(shì)，對(duì)胚胎發(fā)育、嬰幼兒及兒童健康可能存在潛在危害。有研究顯示，大連兒童血漿中總PBDEs含量約為40.08 ng·g-1脂肪[3]，遠(yuǎn)高于廣州地區(qū)非職業(yè)暴露的人體負(fù)荷水平，并與PBDEs污染區(qū)兒童血漿中含量相近(32.1 ng·g-1脂肪)[4]，因此，在本地區(qū)開展PBDEs毒性效應(yīng)和機(jī)制研究尤為必要。

孕期PBDEs暴露對(duì)胚胎發(fā)育的毒理效應(yīng)目前還不十分清楚。動(dòng)物研究顯示，PBDEs可能具有生殖、內(nèi)分泌干擾、發(fā)育神經(jīng)毒性以及致畸和致癌性，其中對(duì)甲狀腺激素干擾和神經(jīng)發(fā)育損傷尤為顯著[3-5]，主要表現(xiàn)為類似臨床或亞臨床甲狀腺功能減退(甲減)，以及神經(jīng)行為、認(rèn)知能力和學(xué)習(xí)記憶下降等神經(jīng)毒性效應(yīng)。甲狀腺激素是機(jī)體正常代謝和生長(zhǎng)發(fā)育所必須的激素，尤其對(duì)腦發(fā)育和成熟起著關(guān)鍵作用[6-7]。動(dòng)物和臨床研究均表明，在孕期，即胎腦發(fā)生、發(fā)育的關(guān)鍵期，甲減會(huì)導(dǎo)致不可逆的腦損傷，其癥狀與孕期PBDEs暴露誘導(dǎo)子代發(fā)育神經(jīng)毒性的效應(yīng)頗似[8-9]。因此，有觀點(diǎn)認(rèn)為PBDEs發(fā)育神經(jīng)毒性可能由其對(duì)甲狀腺激素干擾(甲減)所致。然而目前孕期PBDEs暴露對(duì)胎兒甲狀腺激素干擾的評(píng)價(jià)多來(lái)自間接對(duì)子代循環(huán)甲狀腺激素水平的檢測(cè)結(jié)果，而直接研究尚無(wú)報(bào)道。

羊膜腔穿刺抽取臍帶血檢測(cè)甲狀腺相關(guān)激素可能是診斷胎兒甲狀腺功能最好的方法，但由于技術(shù)要求高，且容易出現(xiàn)并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致胎兒死亡。有研究顯示，羊水甲狀腺激素水平與臍血激素水平有一定的相關(guān)性，反映了胎兒甲狀腺激素的代謝，而與孕婦血激素濃度相關(guān)性不強(qiáng)[10-11]，因此，羊水甲狀腺激素可能是反應(yīng)胎兒甲狀腺功能的較好指標(biāo)。但由于醫(yī)學(xué)倫理限制，羊水樣品的提取需要有一定的羊水穿刺指征。本研究選用具有羊水穿刺指征的孕中期婦女為研究對(duì)象，檢測(cè)和分析羊水甲狀腺激素水平和分布情況，并在對(duì)唐氏綜合癥篩查風(fēng)險(xiǎn)和甲狀腺激素水平分類分組的基礎(chǔ)上，檢測(cè)羊水PBDEs內(nèi)暴露水平，并初步分析其與唐氏篩查風(fēng)險(xiǎn)和羊水甲狀腺激素異常的可能關(guān)系，為PBDEs發(fā)育毒性的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 研究對(duì)象與樣本采集

本研究經(jīng)大連市婦產(chǎn)醫(yī)院道理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

研究對(duì)象：2016年5月至2016年8月間，在大連婦產(chǎn)醫(yī)院出生發(fā)育缺陷門診進(jìn)行產(chǎn)前檢查、經(jīng)臨床分析具羊水穿刺指征的100例孕中期婦女。羊水穿刺指征包括：(1)35～40歲以上的高齡孕婦；(2)生育過(guò)染色體異常患兒的孕婦；(3)唐氏血清學(xué)篩查(DS)大于臨界值1/275；(4)無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)染色體18、13或21三體高風(fēng)險(xiǎn)；(5)超聲檢測(cè)胎兒頸部透明帶寬度(NT)大于3.0 mm的，可能為唐氏患兒；(6)有致病因素接觸史的孕婦。此外，對(duì)選擇的孕婦除了進(jìn)行一般資料(如年齡、孕周)收集外，需要排除有疾病史、服藥史、及甲狀腺功能障礙史和治療史等因素。

樣本采集：在無(wú)菌條件下行羊膜腔穿刺術(shù)，采集羊水15 mL，經(jīng)280 g離心10 min，收集細(xì)胞成分進(jìn)行遺傳學(xué)診斷，剩余上清保存于-80 ℃，用于甲狀腺功能檢測(cè)和PBDEs內(nèi)暴露分析。所有研究對(duì)象都自愿簽署了知情同意書。

1.2 羊水甲狀腺激素檢測(cè)方法

羊水甲狀腺功能7項(xiàng)指標(biāo)(促甲狀腺激素，TSH；總?cè)饧谞钕僭彼幔琓T3；游離三碘甲狀腺原氨酸FT3；總甲狀腺素，T4；游離甲狀腺素，F(xiàn)T4；抗甲狀腺過(guò)氧化酶抗體，TPOA和抗甲狀腺球蛋白抗體，TGA)采用羅氏Cobase 601型全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)。由大連市婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗(yàn)科按常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行。

1.3 PBDEs分析方法

1.3.1 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

農(nóng)殘級(jí)正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇(美國(guó)TEDIA公司)；優(yōu)級(jí)濃硫酸、鹽酸(錦州古城化學(xué)試劑有限公司)，優(yōu)級(jí)異丙醇、氯化鉀(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水硫酸鈉SPE柱、酸性氧化鋁SPE柱(Agela Technologies，天津博納艾杰爾科技有限公司)。

PBDEs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(BDE-17、28、47、66、71、85、99、100、138、153、154、183、190和209，壬烷)(Cambridge Isotope Laboratories, Inc., CIL)，內(nèi)標(biāo)BDE-77標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg·mL-1，異辛烷)、同位素內(nèi)標(biāo)13C-PCB-208(50 μg·mL-1，正己烷)、PCB-209(100 μg·mL-1，正己烷)(美國(guó)AccuStandards公司)，其中BDE-77為定量?jī)?nèi)標(biāo)，13C-PCB-208、PCB-209為回收率指示內(nèi)標(biāo)。

1.3.2 羊水樣品中PBDEs的提取

在裝有7 mL羊水的50 mL離心管中加入回收率指示物13C-PCB-208(800 pg)、PCB-209(4 ng)，再加入HCl(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%～38%)2 mL，振蕩，然后快速加入12 mL異丙醇，劇烈振蕩并渦旋2 min，之后再加入10 mL正己烷和甲基叔丁基醚混合溶液(V/V=1∶1)，渦旋5 min，3 000 r·min-1離心10 min，分層后分離出有機(jī)相，再用10 mL正己烷和甲基叔丁基醚混合溶液萃取離心管中的水相，合并3次有機(jī)相萃取液于50 mL離心管中，用5 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))KCl溶液振蕩洗滌，棄KC1溶液，過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱，之后用正己烷洗脫柱子，將合并的萃取液在氮吹儀(HGC-12，天津恒奧科技發(fā)展有限公司)上用高純氮?dú)饩従彺抵寥軇┙蓵r(shí)，放于干燥器恒重后，得到脂肪重量。

1.3.3 PBDEs的分離純化

用5 mL正己烷溶解脂肪并轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，加入2 mL濃硫酸，渦旋后，2 000 r·min-1離心10 min，把上層有機(jī)溶液移入另1支離心管中，再加入2 mL濃硫酸酸洗，而用正己烷萃取下層濃硫酸，合并有機(jī)相，同樣方法酸洗3次。收集有機(jī)相約10 mL氮吹濃縮至1 mL，然后過(guò)酸性氧化鋁SPE柱，用大約10 mL正己烷洗脫柱子，在氮吹儀上用高純氮?dú)饩従彺抵链蠹s400 μL后，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，加入40 μL(20 ng·mL-1)BDE-77內(nèi)標(biāo)化合物，最后定容到500 μL，密封放于冰箱中-20 ℃保存，待GC-NCI-MS分析。

1.3.4 儀器分析

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC6890N-MS5975，美國(guó)Agilent公司)。

色譜條件：色譜柱為DB-XLB(15 m×0.25 mm×0.1 μm)，載氣為氦氣，采用恒流模式，流速為1.2 mL·min-1。進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。程序升溫條件：初始爐溫90 ℃，保持2 min，然后以15 ℃·min-1的速率升至320 ℃，保持7 min。

質(zhì)譜條件：負(fù)化學(xué)離子源(negative chemical ionization, NCI)，反應(yīng)氣為甲烷，選擇離子監(jiān)測(cè)模式(SIM)，離子源溫度150 ℃，四極桿溫度150 ℃。溶劑延遲時(shí)間為6 min。三溴～七溴聯(lián)苯醚掃描離子為m/z=79、m/z=81；十溴聯(lián)苯醚為m/z=79、m/z=81、m/z=487和m/z=489。

1.3.5 質(zhì)量控制與質(zhì)量保證

樣品在提取前添加回收率指示物標(biāo)樣，以控制整個(gè)樣品前處理過(guò)程的回收率，同時(shí)每隔6個(gè)樣品設(shè)置一個(gè)方法空白以保證整個(gè)樣品前處理過(guò)程中沒(méi)有外來(lái)污染。在檢測(cè)樣品前進(jìn)行溶劑空白的檢測(cè)，保證儀器運(yùn)行的準(zhǔn)確性，同時(shí)設(shè)置基質(zhì)加標(biāo)、基質(zhì)加標(biāo)平行樣以檢測(cè)儀器的穩(wěn)定性及校正不同批次檢測(cè)所造成的響應(yīng)值差異。

整個(gè)樣品前處理過(guò)程均在通風(fēng)櫥里進(jìn)行，且玻璃容器在使用前分別用洗潔精水、自來(lái)水、去離子水溶液清洗并超聲20 min，烘干后再用丙酮、二氯甲烷、正己烷各超聲20 min，溶劑完全揮發(fā)后置于馬弗爐中于450 ℃下燒4 h。KCl也置馬弗爐中于450 ℃下燒4 h后，置于干燥器中備用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS18.0軟件處理所有數(shù)據(jù)。用非參數(shù)分析法計(jì)算羊水中TSH、TT3、TT4、FT3和FT4的最小值、最大值、中位數(shù)及95%參考區(qū)間值。定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)描述，采用單因素方差分析對(duì)不同組間進(jìn)行兩兩比較，* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 大連地區(qū)具有羊穿指征的孕中期婦女羊水甲狀腺激素水平的分布

參考值區(qū)間是臨床解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析檢驗(yàn)信息的基本尺度和依據(jù)，然而，目前只有血清甲狀腺功能7項(xiàng)指標(biāo)的參考值區(qū)間，尚無(wú)羊水的參考值區(qū)間及其臨床指導(dǎo)意義。

本研究以大連市某婦幼保健院具有羊穿指征的100例孕中期婦女為研究對(duì)象，通過(guò)評(píng)價(jià)其羊水甲狀腺功能7項(xiàng)指標(biāo)，初步分析羊水甲狀腺激素濃度區(qū)間分布頻率(表1)。

圖1 100例羊水中TSH分布Fig. 1 Frequency of TSH in 100 amniotic fluid samples

圖2 100例羊水中FT3分布Fig. 2 Frequency of FT3 in 100 amniotic fluid samples

圖3 100例羊水中TT3分布Fig. 3 Frequency of TT3 in 100 amniotic fluid samples

表1 羊水甲狀腺激素濃度區(qū)間分布頻率Table 1 The frequencies of amniotic fluid thyroid hormone concentrations

注：TSH, FT3, FT4, TT3, TT4表示促甲狀腺激素、游離三碘甲狀腺原氨酸、游離甲狀腺素、三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺素。

Note: TSH, FT3, FT4, TT3, TT4 stand for thyroid stimulating hormone, free triiodothyronine, free thyroxine, total triiodothyronine, total thyroxine.

圖4 100例羊水中FT4分布Fig. 4 Frequency of FT4 in 100 amniotic fluid samples

圖5 100例羊水中TT4分布Fig. 5 Frequency of TT4 in 100 amniotic fluid samples

圖1～5為羊水甲狀腺激素濃度分布圖。可以看出，100例羊水中的TSH、TT3、TT4、FT3和FT4濃度均呈非正態(tài)分布，其中TSH、TT4和FT4濃度呈正偏態(tài)分布(圖1、4、5)，而TT3和FT3濃度呈兩級(jí)分布格局(圖2、3)。用非參數(shù)分析法計(jì)算100例羊水中TSH、TT3、TT4、FT3和FT4的最小值、最大值、中位數(shù)及95%參考區(qū)間值，建立羊水甲狀腺激素水平(TSH、FT3、TT3、FT4和TT4)的中位數(shù)和參考區(qū)間值(表2)。由表2可見，羊水甲狀腺激素5項(xiàng)指標(biāo)的參考區(qū)間值均低于血清正常參考值。

2.2 唐氏高風(fēng)險(xiǎn)羊水的甲狀腺激素水平

如前所述，唐氏高風(fēng)險(xiǎn)羊穿指征主要包括：高齡、唐氏血清學(xué)檢測(cè)(DS)、無(wú)創(chuàng)三體基因檢測(cè)和超聲學(xué)檢測(cè)(NT)。據(jù)此，將100例羊水樣本歸類如下：高齡，52例(52%)；DS高風(fēng)險(xiǎn)，33例(33%)；無(wú)創(chuàng)DNA三體(染色體13、18或21)高風(fēng)險(xiǎn)，8例(8%)；NT高風(fēng)險(xiǎn)(> 3.0 mm)，5例(5%)；其他2例(2%)。羊水采集人群基本信息見表3。

以高齡組為對(duì)照，分別比較三類高風(fēng)險(xiǎn)羊穿指征與羊水甲狀腺激素水平的關(guān)系(表4)。由表4可見，DS高風(fēng)險(xiǎn)、無(wú)創(chuàng)DNA三體高風(fēng)險(xiǎn)和NT高風(fēng)險(xiǎn)羊水中的TSH水平，均顯著低于對(duì)照組(P < 0.001或P < 0.05)，提示：唐氏高風(fēng)險(xiǎn)胎兒可能伴隨下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸功能失調(diào)。

表2 羊水TSH、TT3、FT3、TT4和FT4的最小值、最大值、中位數(shù)及95%參考區(qū)間值Table 2 The analysis on the levels of thyroid hormones in amniotic fluid

注：TPOA表示抗甲狀腺過(guò)氧化酶抗體；TGA表示抗甲狀腺球蛋白抗體。

Note: TPOA and TGA stand for thyroid peroxidase antibody and thyroglobulin antibody, respectively.

2.3 羊水中PBDEs暴露與甲狀腺激素水平的關(guān)系

基于唐氏綜合癥篩查風(fēng)險(xiǎn)和羊水TSH水平，選取高齡對(duì)照組(羊水1)、DS高風(fēng)險(xiǎn)合并TSH低下(羊水2)和無(wú)創(chuàng)21三體高風(fēng)險(xiǎn)(羊水3)，采用GC-NCI-MS法檢測(cè)3組羊水PBDEs負(fù)荷水平，并初步分析孕期PBDEs暴露與唐氏篩查風(fēng)險(xiǎn)和羊水甲狀腺激素水平異常的可能關(guān)系。

表5是3組羊水甲狀腺激素水平概況。其中，羊水2的TSH和FT3均顯著低于對(duì)照組(P < 0.05)；羊水3的甲狀腺激素水平，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 羊水采集人群基本信息Table 3 Basic information of pregnant woman for amniotic fluid collection

表4 唐氏高風(fēng)險(xiǎn)羊水的甲狀腺激素水平Table 4 The levels of thyroid hormones in amniotic fluid under the different categories

注：* P < 0.05，*** P < 0.001。

Note: *P < 0.05, *** P < 0.001.

表5 依據(jù)唐氏綜合癥篩查風(fēng)險(xiǎn)和羊水甲狀腺激素水平分組的組別信息Table 5 Analysis on the levels of thyroid hormones on different groups of amniotic fluid samples

注：*表示與對(duì)照組比較，P < 0.05。

Note: * P < 0.05 as compared with control.

出于倫理因素，羊水采集量限制在15 mL，用于甲狀腺激素水平檢測(cè)和PBDEs內(nèi)負(fù)荷分析，其中用于PBDEs內(nèi)負(fù)荷分析的羊水體積僅為7 mL，從中提取的脂肪含量不足以檢出PBDEs，因此，本研究采取合并各組別羊水的方法，檢測(cè)每組別PBDEs同系物的水平，然后根據(jù)每組例數(shù)計(jì)算PBDEs同系物平均暴露水平(pg·mL-1)，以及各組別PBDEs總負(fù)荷量平均水平(pg·mL-1)。

表6為本研究檢測(cè)的PBDEs種類與以及不同組別PBDEs平均暴露水平。所檢測(cè)的16種PBDEs同系物中，3組羊水樣品共檢出6種(BDE-47、71、138、183、190和209)，其中BDE-71、183和190在3組羊水中均被檢出。雖然3組羊水的BDE-71和183水平未見明顯差異，但羊水2和羊水3的BDE-190水平顯著高于羊水1，分別為11.11倍和8.89倍。由于羊水2的3例通過(guò)羊水核型分析均排除了唐氏綜合癥風(fēng)險(xiǎn)，因此其羊水BDE-190高暴露水平，不是唐氏綜合癥高風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因素，很可能與TSH低下有關(guān)，即：可能是胎兒HPT軸功能失調(diào)的危險(xiǎn)因素。由此推測(cè)，盡管羊水3的病例經(jīng)核型分析均為21三體陽(yáng)性，其羊水BDE-190高負(fù)荷水平(低于羊水2)不是唐氏綜合癥高風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因素。

BDE-209只在羊水1和羊水2檢出，并且后者的BDE-209水平是前者的4.44倍，提示：羊水BDE-209負(fù)荷水平可能是胎兒HPT軸功能失調(diào)的危險(xiǎn)因素。

此外，PBDEs總負(fù)荷量(∑PBDEs)在3組羊水中差異顯著，其中，羊水2的∑PBDEs是羊水1的5.93倍，提示：羊水PBDEs總負(fù)荷量可能胎兒HPT軸功能失調(diào)的危險(xiǎn)因素。同樣地，羊水3的∑PBDEs盡管高于羊水1(3.45倍)，但低于羊水2，不是唐氏綜合癥高風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因素。

3 討論(Discussion)

對(duì)羊水甲狀腺功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，有助于篩查和預(yù)防胎兒發(fā)育異常[12-13]，因此，建立羊水甲狀腺激素水平參考值區(qū)間極其必要。朱立等[12]曾采用體外放射分析法，對(duì)22例正常妊娠19～22周羊水甲狀腺激素水平進(jìn)行檢測(cè)，并與30例甲亢或甲低合并妊娠正在治療的孕婦19～20周羊水的甲狀腺激素水平進(jìn)行比較，以探討其對(duì)新生兒發(fā)育影響的臨床意義；然而，由于研究例數(shù)少且年代早(20世紀(jì)末)，不足以反映現(xiàn)代人群生活環(huán)境和生活方式的變遷，并且檢測(cè)手段與現(xiàn)代不同，所以參考價(jià)值有限。2011年，Singh等[13]采用免疫分析法檢測(cè)120多例羊水的TSH、T4和FT4，并建立了參考值區(qū)間，但其研究指標(biāo)少，且研究對(duì)象在種族、地域和生活方式等方面的差異，也制約了其參考價(jià)值。本研究對(duì)大連地區(qū)100例孕中期婦女羊水甲狀腺功能7項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，并建立了孕中期羊水甲狀腺激素(TSH、FT3、TT3、FT4和TT4)濃度參考值區(qū)間，其結(jié)果不僅為本研究的設(shè)計(jì)分組提供依據(jù)，也將為將來(lái)評(píng)價(jià)胎兒甲狀腺功能和異常篩查提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

TSH是調(diào)控甲狀腺細(xì)胞生長(zhǎng)和甲狀腺激素合成及分泌的主要因子，由垂體促甲狀腺素細(xì)胞合成和分泌，并受甲狀腺激素的負(fù)反饋性調(diào)節(jié)。甲狀腺功能改變時(shí)，TSH波動(dòng)較甲狀腺激素更迅速而顯著，是反映HPT軸功能的敏感指標(biāo)。因此本研究在唐氏篩查結(jié)果的基礎(chǔ)上，用羊水中TSH水平作為處理因素分組，再進(jìn)行PBDEs檢測(cè)，其結(jié)果 可 能 更 好地反映PBDEs暴露與胎兒甲狀腺激素的干擾關(guān)系。結(jié)果顯示，低TSH組的PBDEs負(fù)荷水平(BDE-190和BDE-209)增高，而且羊水T3水平顯著降低，提示PBDEs暴露可能與胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷產(chǎn)生的HPT軸功能失調(diào)有關(guān)。

表6 羊水中PBDEs的種類與平均暴露水平(pg·mL-1)Table 6 The PBDEs congeners detected and the levels of PBDEs in amniotic fluid (pg·mL-1)

注：表中“-”代表未檢出，LOD代表基線水平，量很小。

Note: “-”stands for no detected, LOD stands for a low content at baseline level.

我們以往的研究顯示，孕早期BDE-209暴露可影響小鼠胎盤脫碘酶3(Dio3)基因的表達(dá)，不僅具有劑量-反應(yīng)關(guān)系，而且與出生子鼠發(fā)育神經(jīng)毒性效應(yīng)有一致趨勢(shì)[14]。在孕早期，特別是胎兒自身甲狀腺建立和分泌甲狀腺激素之前，胎兒完全依賴于母體提供的甲狀腺激素來(lái)維持各組織器官(特別是腦)的正常發(fā)育[15]。由于母體和胎兒對(duì)甲狀腺激素的需求不同，從母體轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒的甲狀腺激素(T3和T4)需靠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中Dio3進(jìn)行調(diào)解，以保證胎兒的甲狀腺激素處于最佳生理水平而進(jìn)行正常發(fā)育[16]。因此可以推測(cè)，孕早期BDE-209暴露可能通過(guò)對(duì)胎盤Dio3的影響導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育損害。而在胚胎發(fā)育中后期，胎兒的甲狀腺激素主要來(lái)源于其自身的甲狀腺生成和釋放，循環(huán)甲狀腺激素水平的調(diào)節(jié)可能取決于胚胎早期PBDEs對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷程度，如果導(dǎo)致HPT軸功能失調(diào)，可能影響下丘腦促甲狀腺激素釋放激素(TRH)的生成和釋放，抑制垂體對(duì)TRH的反應(yīng)或TSH活性成熟過(guò)程，導(dǎo)致T3生成不足而在循環(huán)的水平下降，而TSH水平可能出現(xiàn)下降、不變或稍有上升，這與TRH或TRH受體基因敲除小鼠的表型相似[17]。因此，孕期BDE-209暴露可能通過(guò)對(duì)孕早期神經(jīng)發(fā)育的損傷，導(dǎo)致中樞HPT軸功能失調(diào)，進(jìn)一步產(chǎn)生甲狀腺激素干擾。另外，體外研究顯示，PBDEs也可能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞有直接毒性作用[18]，可能導(dǎo)致胎兒中樞神經(jīng)發(fā)育損傷，影響HTP軸的功能。這2種機(jī)制需進(jìn)一步研究。

盡管動(dòng)物研究顯示，目前所有檢測(cè)到的PBDEs同系物都有甲狀腺激素的干擾效應(yīng)，并且結(jié)果相對(duì)一致，但人群流行病學(xué)研究對(duì)此尚有爭(zhēng)議，各同系物的研究結(jié)果也不相同，甚至相反[19]。我們研究顯示，在唐氏篩查21三體陽(yáng)性組，羊水BDE-190負(fù)荷水平顯著增高，但甲狀腺激素水平并無(wú)顯著變化，其原因可能有：1)其暴露劑量不足以產(chǎn)生甲狀腺激素干擾效應(yīng)；2)與BDE-209有不同的毒理效應(yīng)。

孕中期唐氏母血清標(biāo)記物篩查仍是產(chǎn)前篩選重要手段，通過(guò)抽取孕婦血清，對(duì)其生化指標(biāo)水平進(jìn)行檢測(cè)，包括：甲型胎兒蛋白(AFP)、絨毛促性腺激素(hCG)、游離雌三醇(uE3)和抑制素A(Inhibin A)。血清標(biāo)記物篩查的主要缺點(diǎn)是假陽(yáng)性率較高，可能這些指標(biāo)易受其他因素影響。我們的研究顯示，羊水PBDEs負(fù)荷水平似乎與唐氏血清標(biāo)記物篩查高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。目前尚無(wú)報(bào)道證實(shí)PBDEs暴露會(huì)對(duì)這些指標(biāo)產(chǎn)生影響，但動(dòng)物和體外研究顯示，PBDEs不僅具有甲狀腺激素干擾效應(yīng)，對(duì)生殖內(nèi)分泌也具有影響。例如，有研究顯示PBDEs及其代謝物有(抗)雌激素或(抗)雄激素活性[20]。PBDEs這些毒性效應(yīng)是否是導(dǎo)致唐氏血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)的原因，尚有待于進(jìn)一步研究。因此，血清標(biāo)記物篩查的結(jié)果可能要考慮環(huán)境污染物的作用。

唐氏綜合癥(又稱21-三體綜合癥)是由21號(hào)染色體異常而導(dǎo)致的混合有精神發(fā)育遲滯的綜合癥。盡管我們研究結(jié)果顯示，羊水PBDEs負(fù)荷水平似乎與唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，但目前尚無(wú)任何資料顯示PBDEs具有導(dǎo)致唐氏綜合癥的風(fēng)險(xiǎn)。體外研究顯示，PBDEs對(duì)細(xì)胞具有基因毒性，可導(dǎo)致DNA損傷或染色體異常[21]。然而，動(dòng)物研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PBDEs有致突變或基因毒性效應(yīng)[22]。因此，PBDEs的致畸性尚有爭(zhēng)議，對(duì)唐氏綜合癥危險(xiǎn)性也有待于進(jìn)一步調(diào)查。另外，唐氏綜合癥新生兒或兒童常伴有甲狀腺功能低下，原因還不清楚，推測(cè)可能由于唐氏綜合癥的神經(jīng)發(fā)育損傷導(dǎo)致HPT軸功能失調(diào)所致。我們的研究也顯示，唐氏篩查DS陽(yáng)性組中羊水TSH和T3水平顯著降低，但推測(cè)并非唐氏綜合癥所致，因?yàn)樘剖暇C合癥伴有甲低的新生兒主要表現(xiàn)為T4顯著降低和TSH增高[23]，與我們的結(jié)果并不一致，而且在唐氏篩查21三體陽(yáng)性組中，甲狀腺激素水平也并無(wú)顯著變化。因此可以推斷，唐氏篩查DS陽(yáng)性組中羊水甲狀腺激素異常是由孕期PBDEs暴露引起的。

PBDEs是一種新型持久性有機(jī)污染物，其中多數(shù)同系物已被禁用或限用。我國(guó)是目前世界上為數(shù)不多仍在生產(chǎn)和使用PBDEs的國(guó)家之一，而且保持著相當(dāng)快的增長(zhǎng)速度，目前的主要產(chǎn)品為BDE 209。我們研究結(jié)果顯示，所檢測(cè)的16種PBDEs同系物中，3組羊水樣品共檢出6種(BDE-47、71、138、183、190和209)，其中BDE 209和BDE 190不僅檢出率較高，而且體內(nèi)負(fù)荷水平也高，基本符合我國(guó)對(duì)PBDEs使用的現(xiàn)狀。

綜上，本文檢測(cè)了孕中期婦女羊水甲狀腺激素水平和PBDEs暴露，并初步分析兩者的關(guān)系，結(jié)果表明，孕期PBDEs暴露與胎兒甲狀腺干擾有關(guān)，其機(jī)制可能通過(guò)對(duì)孕早期胎兒中樞神經(jīng)發(fā)育損害產(chǎn)生的HPT軸功能失調(diào)有關(guān)。

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EvaluationofMaternalPBDEsExposureontheThyroidHormonesinAmnioticFluidoftheWomenUndergoingAmniocentesisatLateSecondTrimesterofPregnancyinDalianCity

Han Lu1, Shang Xiaona2, Yu Hua1, Guo Yi1, Yao Jianping1, Wang Yuxin1, Liu Xiaohui2, Li Yachen2,*, Shao Jing2,#

1. Maternal and Child Care Service Centre of Dalian; The Teaching Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116033, China2. School of Public Health, Dalian Medical University, Dalian 116044, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170120001韓璐, 尚小娜, 于華, 等. 大連地區(qū)唐氏篩查孕中期婦女羊水中甲狀腺激素水平與PBDEs內(nèi)暴露關(guān)系初探[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(3): 180-190

2017-01-20錄用日期2017-03-13

1673-5897(2017)3-180-11

X171.5

A

李亞晨(1965—)，女，環(huán)境衛(wèi)生學(xué)與毒理學(xué)專業(yè)，副教授，研究方向?yàn)榄h(huán)境污染健康與評(píng)價(jià)。

共同通訊作者簡(jiǎn)介：邵靜(1965—)，女，環(huán)境衛(wèi)生學(xué)與毒理學(xué)專業(yè)，博士生導(dǎo)師，教授，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境污染健康與評(píng)價(jià)。

遼寧省自然科學(xué)基金(2015020557)；國(guó)家自然科學(xué)基金(81273031)；國(guó)家科技部十二五支撐項(xiàng)目(No: 2012BAI37B00; Sub-No: 2012BAI37B03)

韓璐(1963-)，女，博士，主任醫(yī)師，副院長(zhǎng)，研究方向?yàn)榄h(huán)境有機(jī)物與出生缺陷，E-mail: 13940801858@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: 2461178934@qq.com

#共同通訊作者(Co-corresponding author)， E-mail: jshao@uw.edu; js.jshao@gmail.com

Han L, Shang X N, Yu H, et al. Evaluation of maternal PBDEs exposure on the thyroid hormones in amniotic fluid of the women undergoing amniocentesis at late second trimester of pregnancy in Dalian City [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 180-190 (in Chinese)