具除草活性的羥基唑并嘧啶的合成和評(píng)價(jià)

章樂(lè)天 編譯

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具除草活性的羥基唑并嘧啶的合成和評(píng)價(jià)

章樂(lè)天 編譯

(華東理工大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200237)

用除草劑來(lái)控制作物田的雜草種群是一項(xiàng)成功的技術(shù)，在2014年的傳統(tǒng)作物保護(hù)市場(chǎng)560億美元中除草劑占43%。監(jiān)管和除草劑抗性問(wèn)題給除草劑的使用帶來(lái)了挑戰(zhàn)，例如對(duì)已知作用機(jī)制的非選擇性和/或選擇性除草劑抗性雜草繼續(xù)增加。需要許多策略來(lái)解決這些問(wèn)題，如開(kāi)發(fā)和發(fā)現(xiàn)新作用機(jī)制的除草劑。最近，巴斯夫進(jìn)行了高通量篩選，確定在異戊二烯生物合成的非甲羥戊酸途徑中發(fā)現(xiàn)一系列先導(dǎo)結(jié)構(gòu)，并得到酶抑制劑。幾種類型的化合物抑制途徑中的第三種酶，即4-二磷酸胞苷2C-甲基--赤蘚糖醇合酶(IspD)最有效的抑制劑是6-芐基-取代的羥基唑并嘧啶1(圖1)。

圖1 已報(bào)道的IspD的抑制劑

羥基三唑并嘧啶2被確定為亞微摩爾抑制劑，研究表明其在蛋白質(zhì)的變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合IspD?；衔?和IspD的共晶體結(jié)構(gòu)允許優(yōu)化結(jié)合的配體，由此得到了羥基吡唑并嘧啶3，其活性提高了4倍。即使在高濃度(有效成分3 kg/hm2)時(shí)，在生測(cè)試驗(yàn)中，該系列1具有白化作用，化合物2具有優(yōu)異的活性。另外，在葉碟生測(cè)試驗(yàn)中，當(dāng)以100 μM的濃度施用時(shí)，化合物2和3對(duì)番茄紅素積累有>60%的抑制作用。據(jù)報(bào)道，芐基位置(R4)的取代降低了系列1的結(jié)合親和力；而右側(cè)環(huán)(R3)的取代是可以接受的，這導(dǎo)致設(shè)計(jì)了系列化合物4，其中唑并嘧啶核心和苯環(huán)通過(guò)醚氧鍵連接，目的是發(fā)現(xiàn)活體活性增加的化合物，其也可以是IspD的抑制劑(圖2)

芳氧基系列

1 材料和方法

1.1 化學(xué)合成

1.1.1 通用方法

合成化合物12-14和31以及三唑并嘧啶61-63所需苯酚的合成以及所有新化合物的核磁檢測(cè)法用已有的方法。氫核磁共振譜檢測(cè)用Bruker Avance 3 HD400(400MHz)或Bruker Avance 3 500(500MHz)光譜儀(Bruker，Billerica，MA)，以CDCl3或DMSO-d6為溶劑?；瘜W(xué)位移以保留2位小數(shù)的數(shù)字表示，單位ppm，信號(hào)分裂記錄為單峰(s)、雙峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、五重峰(quin)、六分圖(sxt)、七重峰(spt)和多重峰(m)。耦合常數(shù)J保留一位小數(shù)，單位為Hz。用Bruker Avance 3 500核磁共振儀以125MHz測(cè)定碳譜，以CDCl3或DMSO-d6為參照物?；瘜W(xué)位移保留一位小數(shù)，單位ppm。低分辨質(zhì)譜(LRMS)采用沃特斯的超高效液相色譜Acquity UPLC(Waters Corp.，Milford，MA)檢測(cè)，配置沃特斯SQD2單四極桿MS或島津QP2010+單四極桿GC-MS(Shimadzu Corp.，Kyoto，Japan)。高分辨質(zhì)譜(HRMS)采用沃特斯的Acquity UPLC檢測(cè)，配置賽默飛Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)。其值為質(zhì)荷比，單位道爾頓。使用未校正Optimelt自動(dòng)熔點(diǎn)系統(tǒng)(Standford Research Systems，Sunnyvale，CA)測(cè)定熔點(diǎn)。用質(zhì)量定向的制備型HPLC進(jìn)行純化，Waters Fraction Lynx系統(tǒng)用UV與ES +的混合觸發(fā)劑，該系統(tǒng)包括具有2525梯度泵的2767注射器/收集器、泵控制模塊、2個(gè)515等度泵、CFO、2996光電二極管陣列、2420 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)和Micromass ZQ2000。使用沃特斯Atlantis dC185 μm 19×10 mm 保護(hù)柱和沃特斯 Atlantis dC185 μm OBD 30×100 mm制備柱。柱洗脫液為H2O(含有0.05%TFA)和乙腈(含有0.05%TFA)的梯度混合液。

1.1.2 一般方法1——合成2-芳氧基丙二酸酯

在通入氮?dú)獾那闆r下，將鈉(1.01當(dāng)量)分批加入到乙醇(1.0 mL/mmol)中。將混合物攪拌2 h，直到金屬鈉完全溶解。加入相應(yīng)的苯酚(1.0當(dāng)量)，攪拌混合物10 min。滴加氯代丙二酸二乙酯9(1.2當(dāng)量)，將所得溶液加熱回流16 h。將混合物冷卻至室溫并真空濃縮。將殘留物懸浮于水(0.5 mL/mmol)中，用Et2O(3×0.5 mL/mmol)萃取。合并有機(jī)萃取物，用水(0.5 mL/mmol)沖洗，然后用MgSO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮。用快速柱色譜純化粗產(chǎn)物，得到相應(yīng)的2-芳氧基丙二酸酯。

1.1.3 2-苯氧基丙二酸二乙酯的合成(10)

在一般方法1中加入苯酚(8)?？焖僦V法(乙酸乙酯︰異己烷=1︰19)純化粗產(chǎn)物，得到無(wú)色油狀物(1.53 g)，通過(guò)Kugelrohr蒸餾進(jìn)一步純化，得到無(wú)色的丙二酸酯10油狀物(900 mg，34%)。LRMS：275(M+Na+)；1HNMR(400 MHz，CDCl3)δH：7.24-7.35 (2H，m)，7.04(1H，t，J=7.4)，6.95-7.00(2H，m)，5.21(1H，s)，4.25-4.39(4H，m)，1.31(6H，t，J=7.1)。

1.1.4 2-(2,6-二氯苯氧基)丙二酸二乙酯(11)的合成

一般方法1中加入2,6-二氯苯酚(10.0 g)。快速柱色譜法純化粗產(chǎn)物(乙酸乙酯︰異己烷=1︰19)，得到無(wú)色油狀的丙二酸酯11(16.3 g，83%)。LRMS：(321，M+H+)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH：7.30(2H，d，J=8.1)，6.99-7.08(1H，m)，5.14(1H，s)，4.25-4.39 (4H，m)，1.31(6H，t，J=7.1)。

1.1.5 2-(3-溴-2-氯-6-氟-苯氧基)丙二酸二乙酯(12)的合成

在一般方法1中加入3-溴-2-氯-6-氟苯酚(5.0 g，22.2 mmol)?？焖僦V法(乙酸乙酯︰異己烷=1︰9)純化粗產(chǎn)物，得到無(wú)色油狀的化合物12(7.14 g，84%)。GCMS：(384，M+)；1H NMR(400 MHz，CDCl3) δH：7.38(1H，dd，J=9.1和5.0)，6.96(1H，dd，J=10.3和9.1)，5.21(1H，s)，4.26-4.41(4H，m)，1.32(6H，t，J=7.1)。

1.1.6 2-[2,6-二氯-3-(三氟甲基)苯氧基]丙二酸二乙酯(13)的合成

在一般方法1中加入2,6-二氯-3-(三氟甲基)苯酚(1.5 g，6.2 mmol)?？焖僦V法(乙酸乙酯︰異己烷=1︰9)純化粗產(chǎn)物得到無(wú)色油狀的化合物13 (1.8 g，75%)。GCMS：(389，M+)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH：7.40-7.51(2H，m)，5.18(1H，s)，4.26-4.41 (4H，m)，1.32(6H，t，J=7.1)。

1.1.7 2-[6-氯-2-氟-3-(三氟甲基)苯氧基]丙二酸二乙酯的合成(14)

在一般方法1中加入6-氯-2-氟-3-(三氟甲基)苯酚(3.4 g，15.8 mmol)?？焖僦V法(乙酸乙酯︰異己烷=1︰9)純化粗產(chǎn)物得到無(wú)色油狀物，經(jīng)Kugelrohr蒸餾進(jìn)一步純化，得到無(wú)色油狀的化合物14 (2.9 g，49%)。GCMS：(372，M+)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH：7.37-7.28(2H，m)，5.25(1H，s)，4.41-4.27 (4H，m)，1.32(6H，t，J=7.1)。

1.1.8 一般方法2-兩步方法制備5,7-二氯-6-[芳氧基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將鈉(1.05當(dāng)量)加入乙醇(3.0 mL/mmol)中。攪拌混合物1 h，直到金屬鈉完全溶解。加入相應(yīng)的丙二酸二乙酯(1.0當(dāng)量)和3-氨基-1,2,4-三唑15(1.0當(dāng)量)，將混合物加熱回流18 h。將混合物冷卻至室溫并真空濃縮。將殘留物溶于H2O(5.0 mL/mmol)中。點(diǎn)滴加入HCl水溶液(2.0 M)，將混合物的pH調(diào)至1，并過(guò)濾沉淀物。將濾液在真空中干燥，得到相應(yīng)的二酮，懸浮于磷酰氯(10 mL/g)中。將混合物加熱回流(110 ℃)6 h，然后冷卻至室溫。將混合物小心地倒入0 ℃的冰水混合物(10 g/g)中。混合物用CH2Cl2(3×20 mL/g)萃取，合并的有機(jī)萃取物，用MgSO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮。快速柱色譜純化粗產(chǎn)物，得到相應(yīng)的5,7-二氯-6-[芳氧基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。

1.1.9 5,7-二氯-6-苯氧基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶(17)的合成

在一般方法2中加入化合物10(6.5 g，25.8 mmol)制備產(chǎn)物。快速柱色譜法(乙酸乙酯︰異己烷=2︰3)純化粗產(chǎn)物，得到淺黃色固體化合物17(3.8 g，2步最終產(chǎn)率大于63%)。LRMS：(283，M+H+)；1H NMR (400MHz，CDCl3)δH：8.59(1H，s)，7.33-7.42(2H，m)，7.17(1H，t，J= 7.5)，6.89-6.95(2H，m)。

1.1.10 5,7-二氯-6-(2,6-二氯苯氧基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶(20)的合成

在一般方法2中加入化合物11(1.46 g，4.55 mmol)進(jìn)行制備產(chǎn)物。快速柱色譜法(乙酸乙酯︰異己烷=2︰3)純化粗產(chǎn)物，得到白色固體三唑并嘧啶20(0.43 g，2步產(chǎn)率32%)。(LRMS)：(353，M+H+)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH：8.59(1H，s)，7.40(2H，d，J=8.1)，7.14-7.21 (1H，m)。

1.1.11 6-(3-溴-2-氯-6-氟-苯氧基)-5,7-二氯-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶(21)的合成

在一般方法2中加入化合物12(3.0 g，7.82 mmol)進(jìn)行制備產(chǎn)物。快速柱色譜法(乙酸乙酯︰異己烷=2︰3)純化粗產(chǎn)物，得到淺黃色固體三唑并嘧啶21，為(0.99 g，2步產(chǎn)率31%)。LRMS：(413，M+H+)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH：8.57(1H，s)，7.49(1H，dd，J=9.1和5.0)，7.00(1H，dd，J=10.7和9.0)。

1.1.12 5,7-二氯-6-[2,6-二氯-3-(三氟甲基)苯氧基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶(22)的合成

在一般方法2中加入化合物13(1.6 g，4.11 mmol)制備產(chǎn)物?？焖僦V法(乙酸乙酯︰異己烷=2︰3)純化粗產(chǎn)物，得到無(wú)色油狀的三唑并嘧啶22(0.27 g，2步產(chǎn)率16%)。LRMS：(419，M+H+)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH：8.57(1H，s)，7.63-7.55(1H，m)，7.54-7.48 (1H，m)。

1.1.13 5,7-二氯-6-[6-氯-2-氟-3-(三氟甲基)苯氧基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶(23)的合成

在一般方法2中加入化合物14(2.87 g，7.70 mmol)制備產(chǎn)物，粗產(chǎn)物通過(guò)快速柱色譜法(乙酸乙酯︰異己烷=2︰3)純化，得到白色泡沫狀的三唑并嘧啶23 (0.38 g，2步產(chǎn)率12%)。LRMS：(403，M+H+)；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δH：8.60(1H，s)，7.49-7.39(2H，m)。

1.1.14 一般方法3-5,7-二氯-6-[芳氧基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶與氫氧化鈉水溶液部分水解反應(yīng)

把NaOH水溶液(2.0 M，2.0當(dāng)量)加入5,7-二氯-6-[芳氧基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶(1.0當(dāng)量)的四氫呋喃(5.0 mL/mmol)溶液中。將混合物在回流下攪拌6 h。將反應(yīng)液冷卻至室溫，然后加入HCl水溶液(2.0 M)把pH調(diào)至1。將混合物用乙酸乙酯(5.0 mL/mmol)稀釋，然后萃取分離，用MgSO4干燥有機(jī)相，過(guò)濾并真空濃縮，得到5-OH和7-OH異構(gòu)體混合物。用制備型HPLC獲得所需的7-OH產(chǎn)物，即5-氯-6-芳氧基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇。

1.1.15 5-氯-6-苯氧基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(18)的合成

在一般方法3中加入化合物17(0.70 g，2.49 mmol)制備產(chǎn)物，得到異構(gòu)體(3︰1)混合物。用制備型HPLC提純得到白色固體18(99 mg)以及化合物19︰18為7︰1的混合物。過(guò)濾萃取水溶液獲得其余的化合物18。合并，得到白色固體化合物18(0.39 g，61%)和白色固體化合物19(66 mg，10%)。通過(guò)X射線晶體學(xué)分析測(cè)定產(chǎn)物的區(qū)域選擇性。LRMS：(263M+H+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δH：8.93(1H，s)，7.26-7.33 (2H，m)，7.03(1H，t，J=7.3)，6.95-7.00(2H，m)；mp：289~296 ℃。

1.1.16 7-氯-6-苯氧基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-5-醇(19)的分析

LRMS：(263M+H+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6) δH：(7︰1混合物19︰18中化合物19)：8.24(1H，s)，7.28-7.35(2H，m)，7.11-7.17(2H，m)，7.04-7.10 (1H，m)。

1.1.17 5-氯-6-(2,6-二氯苯氧基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(24)的合成

在一般方法3中加入化合物20(0.42 g，1.20 mmol)制備產(chǎn)物，得到初始的異構(gòu)體7︰1混合物。制備型HPLC提純得到白色固體化合物24(46 mg，12%)。LRMS：(331，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δH：8.88(1H，s)，7.54-7.39(2H，m)，7.23-7.11(1H，m)。

1.1.18 6-(3-溴-2-氯-6-氟苯氧基)-5-氯-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(25)的合成

在一般方法3中加入化合物21(0.92 g，2.25 mmol)制備產(chǎn)物，得到初始的異構(gòu)體7︰1混合物。制備型HPLC提純得到白色固體化合物25(0.10 g，32%)。LRMS：(395，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δH：8.89(1H，s)，7.59(1H，dd，J=9.0和5.0)，7.29(1H，dd，J=11.3和9.0)；mp：291~293 ℃。

1.1.19 合成5-氯-6-[2,6-二氯-3-(三氟甲基)苯氧基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(26)

在一般方法3中加入化合物22(0.20 g，0.49 mmol)制備產(chǎn)物，得到10︰1的初始異構(gòu)體的混合物。制備型HPLC提純得到白色固體化合物26(32 mg，16%)。LRMS：(401，M+H+，100%)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：8.84(1H，s)，7.74-7.64(2H，m)；mp：264~269 ℃。

1.1.20 5-氯-6-[6-氯-2-氟-3-(三氟甲基)苯氧基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(27)

在一般方法3中加入化合物23(0.36 g，0.87 mmol)制備產(chǎn)物，得到42︰1異構(gòu)體混合物，即產(chǎn)物27(0.26 g，76%)，未進(jìn)一步純化即使用。LRMS：(383，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：8.94(1H，s)，7.64-7.53(2H，m)。

1.1.21 3-氧代-2-苯氧基-丁酸乙酯的合成(29)

在0 ℃下，將氫化鈉(0.42 g，10.6 mmol，礦物油中60%分散體)加入苯酚8(1.0 g，10.6 mmol)的四氫呋喃(120 mL)溶液中。攪拌混合物30 min，加入2-氯-3-氧代丁酸乙酯28(2.1 mL，14.8 mmol)中。將混合物溫加熱至室溫并攪拌1 h。將反應(yīng)混合物加熱回流8 h，然后冷卻至室溫。用Et2O(10 mL)稀釋混合物，然后用H2O(10 mL)洗滌。用Et2O(2×10 mL)萃取水層，合并有機(jī)萃取液并用H2O(10 mL)洗滌，然后用MgSO4干燥。過(guò)濾并真空濃縮。用柱色譜(乙酸乙酯︰異己烷=1︰19)純化粗產(chǎn)物，得到無(wú)色油狀物，其含有29和28。通過(guò)Kugelrohr蒸餾進(jìn)一步純化該混合物，得到無(wú)色油狀化合物29(0.44 g，19%)。GCMS：(222，M+);1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH：(2︰1的酮和烯醇互變異構(gòu)體的混合物)烯醇：11.37 (1H，s)，7.36-7.28(2H，m)，7.07-6.88(3H，m)，4.21 (2H，q，J=7.1)，1.99(3H，s)，1.18(3H，t，J=7.1)；酮：7.36-7.28(2H，m)，7.07-6.88(3H，m)，5.09(1H，s)，4.30(2H，q，J=7.1)，2.39(3H，s)，1.30(3H，t，J=7.1)。

1.1.22 2-[2,6-二氯-3-(三氟甲基)苯氧基]-3-氧代丁酸乙酯(31)的合成

在0 ℃，向氫化鈉(0.12 g，3.11 mmol，礦物油中的60%分散體)的四氫呋喃(6.0 mL)懸浮液中加入2,6-二氯-3-(三氟甲基)苯酚(0.72 g，3.11 mmol)。攪拌反應(yīng)30 min，加入2-氯-3-氧代-丁酸乙酯28(0.52 mL，3.74 mmol)。將混合物加熱至室溫并攪拌1 h。將反應(yīng)混合物加熱回流18 h，然后冷卻至室溫。用Et2O (10 mL)稀釋，然后用H2O(10 mL)洗滌。水層用Et2O (2×10 mL)萃取，合并有機(jī)萃取液并用NaOH水溶液(5.0 mL，2.0 M)洗滌，然后用MgSO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮。柱色譜法純化殘留物，得到無(wú)色油狀化合物31(436 mg，39%)，其中含有微量的化合物28，無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。GCMS：(359，M+)；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δH：(7.5︰1酮和烯醇互變異構(gòu)體的混合物)酮：7.50-7.33(2H，m)，5.06(1H，s)，4.27(2H，q，J=7.1)，2.54(3H，s)，1.28(3H，t，J=7.1)；烯醇：11.23-11.19(1H，m)，7.50-7.33(2H，m)，4.14-4.04(2H，m)，2.19(3H，s)，1.03(3H，t，J=7.2)。

1.1.23 一般程序4——2-芳氧基--酮酯

將NaOH(1.1當(dāng)量)的水溶液(0.1 mL/mmol)加入2,6-二氯苯酚(1.0當(dāng)量)的甲苯(2.0 mL/mmol)溶劑中。將混合物加熱至80 ℃下反應(yīng)1 h，然后冷卻至室溫并真空濃縮，得到相應(yīng)的苯酚鈉。將殘留物溶于DMF(2.0 mL/mmol)中，點(diǎn)滴加入相關(guān)的2-氯-酮酯(1.0~1.2當(dāng)量)。在室溫下攪拌反應(yīng)液3 h。用Et2O (10 mL/mmol)稀釋，用H2O(2×10 mL/mmol)洗滌。合并有機(jī)萃取物，用MgSO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮。快速柱色譜或重結(jié)晶純化粗產(chǎn)物，得到相應(yīng)的2-芳氧基--酮酯。

1.1.24 2-(2,6-二氯苯氧基)-3-氧代丁酸乙酯(33)的合成

在一般方法中加入2,6-二氯苯酚(20.0 g，123 mmol)和2-氯-3-氧代丁酸乙酯28(20.4 mL，147 mmol)制備產(chǎn)物。用乙酸乙酯重結(jié)晶純化粗產(chǎn)物，得到白色固體化合物33(27.3 g，76%)。GCMS：(290，M+)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH：(4.4︰1的酮：烯醇互變異構(gòu)體的混合物)酮：7.32(2H，d，J=8.1)，7.08-7.02(1H，m)，5.01(1H，s)，4.27(2H，q，J=7.2)，2.54(3H，s)，1.29(3H，t，J=7.2)；烯醇：11.21(1H，s)，7.26(2H，d，J=8.2)，6.95(1H，d，J=8.1)，4.13(2H，q，J=7.1)，2.14(3H，s)，1.08(3H，t，J=7.1)。

1.1.25 2-(2,6-二氯苯氧基)-3-氧代-戊酸乙酯(34)的合成

在一般方法4中加入2,6-二氯苯酚(2.8 g，17.2 mmol)和2-氯-3-氧代戊酸乙酯(3.1 g，17.2 mmol)制備產(chǎn)物?？焖僦V純化(1︰19的乙酸乙酯和異己烷)粗產(chǎn)物，得到無(wú)色油狀物34(3.8 g，72%)。GCMS：(304，M+)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH：(11︰1的酮和烯醇互變異構(gòu)體的混合物)酮：7.35-7.29(2H，m)，7.08-7.01(1H，m)，5.07(1H，s)，4.26(2H，q，J=7.1)，3.08(1H，dq，J=19.1和7.2)，2.85(1H，dq，J=19.1和7.1)，1.28(3H，t，J=7.1)1.16(3H，t，J=7.2)；烯醇：11.29(1H，s)，7.25(2H，d，J=8.1)，6.93(1H，m，J=7.9)，4.14(2H，q，J=7.1)，2.53(2H，q，J=7.7)，1.18-1.13(3H，m)，1.08(3H，t，J=7.1)。

1.1.26 一般方法5——2芳氧基--酮酯與3-氨基三唑或3-氨基吡唑的縮合

將2-芳氧基--酮酯(1.0~2.0當(dāng)量)加入相應(yīng)的3-氨基唑(1.0當(dāng)量)的乙酸(1.0 mL/mmol)溶液中，加熱回流反應(yīng)6 h，然后冷卻至室溫。將所得沉淀過(guò)濾，用H2O(1.0 mL/mmol)洗滌，真空干燥，得到相應(yīng)的唑并嘧啶。

1.1.27 5-甲基-6-苯氧基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(35)的合成

在一般方法5中加入酮酯29(0.4 g，1.79 mmol)和3-氨基-1,2,4-三唑15(0.15 g，1.79 mmol)制備產(chǎn)物，得到白色固體35(0.27 g，63%)。LRMS：(243，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：13.40(1H，br.s)，8.27(1H，s)，7.34-7.23(2H，m)，7.08-6.95(3H，m)，2.25(3H，s)；13C NMR(125MHz，DMSO-d 6)δC：157.4，152.6，152.1，149.2，145.0，129.6，125.7，122.1，114.7，14.4；mp：282~292 ℃。

1.1.28 6-(2,6-二氯苯氧基)-5-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(36)

在一般程序5中加入酮酯33(1.0 g，3.43 mmol)和3-氨基-1,2,4-三唑15(0.29 g，3.43 mmol)制備產(chǎn)物。用CH2Cl2(5.0 mL)研磨進(jìn)一步純化產(chǎn)物，得到白色固體物36(0.56 g，54%)。LRMS：(311，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：13.54(1H，br.s)，8.28(1H，s)，7.49-7.43(2H，m)，7.17(1H，t，J=8.1)，2.47(3H，s)；mp：289~296 ℃。

1.1.29 6-[2,6-二氯-3-(三氟甲基)苯氧基]-5-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(37)的合成

在一般程序5中加入酮酯31(0.20 g，0.56 mmol)和3-氨基-1,2,4-三唑15(47 mg，0.56 mmol)進(jìn)行制備產(chǎn)物。用熱MeCN(3×5.0 mL)研磨進(jìn)一步純化產(chǎn)物，得到淺黃色固體37(34 mg，16%)。LRMS：(379，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：8.28(1H，s)，7.64-7.72(2H，m)，7.49(1H，s)，2.50(3H，s)；mp：231~237 ℃。

1.1.30 6-[2,6-二氯-3-(三氟甲基)苯氧基]-5-甲基-2-(三氟甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7醇(38)

在一般程序5中加入酮酯31(1.00 g，2.78 mmol)和3-(三氟甲基-1-1,2,4-三唑-5-胺(0.42 g，2.78 mmol)制備產(chǎn)物。用快速柱色譜法(1︰19的MeOH和CH2Cl2)進(jìn)一步純化產(chǎn)物，得到為白色固體38(90 mg，7%)。LRMS：(447，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：7.75-7.65(2H，m)，2.54(3H，s)；mp：287~293 ℃。

1.1.31 6-[2,6-二氯-3-(三氟甲基)苯氧基]-2-異丙基-5-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇的合成(39)

在一般程序5中加入酮酯31(1.00 g，1.17 mmol)和5-異丙基-4-1,2,4-三唑-3-胺(0.30 g，2.38 mmol)制備產(chǎn)物。用快速柱色譜法(1︰19的MeOH和CH2Cl2)進(jìn)一步純化粗產(chǎn)物，得到黃色固體39(0.70 g，70%)。LRMS：(421，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δH：7.71-7.61(2H，m)，3.02(6H，spt，J= 6.9)，2.47(3H，s)，1.26(6H，d，J=6.8)；mp：128~142 ℃。

1.1.32 6-(2,6-二氯苯氧基)-5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(40)的合成

在一般方法5中加入酮酯34(1.2 g，3.9 mmol)和3-氨基-1,2,4-三唑15(0.27 g，3.25 mmol)制備產(chǎn)物。用快速柱色譜法(1︰9的MeOH和CH2Cl2)進(jìn)一步純化粗產(chǎn)物，得到棕色固體40(0.36 g，35%)。LRMS：(325，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δH：13.57(1H，br.s)，8.32(1H，s)，7.49-7.41(2H，m)，7.21-7.12(1H，m)，2.84 (2H，q，J=7.5)，1.29(3H，t，J=7.6)；mp：>300 ℃。

1.1.33 6-(2,6-二氯苯氧基)-5-乙基-2-(三氟甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(41)的合成

在一般方法5中加入酮酯34(1.2 g，3.9 mmol)和5-(三氟甲基)-4-1,2,4-三唑-3-胺(0.29 g，1.95 mmol)制備產(chǎn)物。用快速柱色譜法(1︰9的MeOH和CH2Cl2)進(jìn)一步純化粗產(chǎn)物，得到黃色固體41(130 mg，17%)。 LRMS：(393，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δH：7.50-7.45(2H，m)，7.19(1H，t，J=8.1)，2.88(2H，q，J=7.6)，1.31(3H，t ，J= 7.6)；mp：193~202 ℃。

1.1.34 6-(2,6-二氯苯氧基)-5-乙基-2-異丙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(42)的合成

在一般方法5中加入酮酯34(1.20 g，3.9 mmol)和5-異丙基-4-1,2,4-三唑-3-胺(0.41 g，3.24 mmol)制備產(chǎn)物。用快速柱色譜法(1︰9的MeOH和CH2Cl2)進(jìn)一步純化粗產(chǎn)物，得到棕色固體42(431 mg，36%)。 LRMS：(367，M+H+);1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δH：13.28(1H，br.s)，7.44(2H，d，J=8.2)，7.15(1H，t，J=8.1)，3.03(1H，spt ，J=6.9)，2.80(2H，q，J=7.6)，1.31-1.23(9H，m)；mp：109~112 ℃。

1.1.35 6-(2,6-二氯苯氧基)-5-甲基-2-嗎啉代-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(43)的合成

在一般方法5中加入酮酯29(0.86 g，2.96 mmol)和3-嗎啉代-1-1,2,4-三唑-5-胺(0.50 g，2.96 mmol)制備產(chǎn)物，得到淺黃色固體43(0.71 g，61%)。LRMS：(396，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：13.18-13.14(1H，m)，7.44(2H，d，J= 8.1)，7.15(1H，t，J=8.1)，3.67(4H，t，J=4.6)，3.42-3.28(4H，m)，2.39(3H，s)； mp：>300 ℃

1.1.36 6-(2,6-二氯苯氧基)-2-(二甲基氨基)-5-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(44)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(1.14 g，3.93 mmol)和3,3-二甲基-1-1,2,4-三唑-3,5-二胺(0.50 g，3.93 mmol)制備產(chǎn)物，得到淺黃色固體44(0.81 g，58%)。LRMS：(354，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：13.20-12.93(1H，m)，7.44(2H，d，J=8.1)，7.15(1H，t，J=8.1)，2.94(6H，s)，2.37(3H，s)：mp：>300 ℃。

1.1.37 6-(2,6-二氯苯氧基)-5-甲基-2-(三氟甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(45)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(0.96 g，3.29 mmol)和3-(三氟甲基)-1-1,2,4-三唑-5-胺(0.50 g，3.29 mmol)制備產(chǎn)物，冷卻時(shí)不形成沉淀，真空濃縮。把殘留物懸浮于CH2Cl2(5.0 mL)中，形成沉淀物。過(guò)濾，將濾液真空干燥，得到淺黃色固體45(0.37 g，29%)。LRMS：(379，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δH：12.72(1H，br.s.)，7.50-7.45(3H，m)，7.19(1H，t，J=8.1)，2.51(3H，s)；mp：228~229 ℃。

1.1.38 2-環(huán)丙基-6-(2,6-二氯苯氧基)-5-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(46)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(1.17 g，4.03 mmol)和3-環(huán)丙基-1-1,2,4-三唑-5-胺(0.50 g，4.03 mmol)制備產(chǎn)物?；旌衔镎婵諠饪s，產(chǎn)生沉淀。將混合物過(guò)濾，用AcOH(2.0 mL)和CH2Cl2(2.0 mL)洗滌，然后真空干燥，得到淺黃色固體46(0.81 g，57%)。LRMS：(351，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δH：13.41-12.98(1H，m)，7.45(2H，d，J= 8.2)，7.16(1H，t，J=8.1)，2.42(3H，s)，2.08-1.99(1H，m)，1.05-0.97 (2H，m)，0.93-0.85(2H，m)。mp：279~288 ℃。

1.1.39 6-(2,6-二氯苯氧基)-2-(甲氧基甲基)-5-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(47)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(1.14 g，3.90 mmol)和3-(甲氧基甲基)-1-1,2,4-三唑-5-胺(0.50 g，3.90 mmol)制備產(chǎn)物，得到47白色固體(0.69 g，49%)。LRMS：(355，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：13.79-13.26(1H，m)，7.46(2H，d，J=8.2)，7.21-7.13 (1H，m)，4.47(3H，s)，3.32 (3H，s)，2.47(3H，s)；mp：293~298 ℃。

1.1.40 6-(2,6-二氯苯氧基)-2-乙基硫烷基-5-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(48)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(1.01 g，3.47 mmol)和3-乙基硫烷基-1-1,2,4-三唑-5-胺(0.50 g，3.47 mmol)制備產(chǎn)物，得到淺黃色固體48(0.61 g，48%)。LRMS：(371，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：13.44(1H，br. s)，7.46(2H，d，J=8.1)，7.17(1H，t，J=8.1)，3.12(2H，q，J=7.3)，2.44(3H，s)，1.34(3H，t，J=7.3)；mp：297~98 ℃。

1.1.41 6-(2,6-二氯苯氧基)-2-甲氧基-5-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(49)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(1.02 g，3.51 mmol)和3-甲氧基-1H-1,2,4-三唑-5-胺(0.40 g，3.51 mmol)制備產(chǎn)物，得到白色固體49( 0.49 g，41%)。LCMS：(341，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：13.50-13.22(1H，m)，7.46(2H，d，J=8.1)，7.17(1H，t，J=8.1)，3.92(3H，s)，2.41(3H，s)；mp：286~290 ℃。

1.1.42 6-(2,6-二氯苯氧基)-2-異丙基-5-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(50)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(0.92 g，3.17 mmol)和3-異丙基-1-1,2,4-三唑-5-胺(0.40 g，3.17 mmol)制備產(chǎn)物，得到白色固體(0.30 g，27%)。LRMS：(353，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：13.30-12.85 (1H，m)，7.45(2H，d，J= 8.1)，7.16(1H，t，J=8.1)，3.02(1H，spt，J= 6.9)，2.43(3H，s)，1.26(6H，d，J=7.0)；mp：275~282 ℃。

1.1.43 6-(2,6-二氯苯氧基)-2,5-二甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(51)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(0.30 g，1.03 mmol)和3-甲基-1-1,2,4-三唑-5-胺(0.10 g，1.03 mmol)制備產(chǎn)物，得到白色固體51(60 mg，18%)。LRMS：(325，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：7.45(2H，d，J=7.3)，7.17-7.14(1H，m)，2.43(3H，s)，2.34(3H，s)；mp：>300 ℃。

1.1.44 6-(2,6-二氯苯氧基)-5-甲基-2-(1-甲基環(huán)丙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(52)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(0.84 g，2.88 mmol)和3-(1-甲基環(huán)丙基)-1-吡唑-5-胺(0.50 g，2.88 mmol)制備產(chǎn)物，得到白色固體52(0.39 g，37%)。LRMS：(364，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：12.29(1H，br.s.)，7.43(2H，d，J= 8.1)，7.14(1H，t，J=8.1)，5.84(1H，s)，2.42(3H，s)，1.39(3H，s)，0.96(2H，br.s.)，0.77(2H，br.s.)；mp：>300 ℃。

1.1.45 6-(2,6-二氯苯氧基)-7-羥基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-甲腈(53)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(0.98 g，3.38 mmol)和5-氨基-1-吡唑-3-甲腈(0.37 g，3.38 mmol)制備產(chǎn)物，得到桃色固體53(0.85g，75 %)。LRMS：(355，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：13.90-13.42 (1H，m)，8.39(1H，s)，7.46(2H，d，J= 8.1)，7.18(1H，t，J=8.1)，2.50(3H，s)；mp：>300 ℃。

1.1.46 3-溴-6-(2,6-二氯苯氧基)-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(54)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(0.42 g，1.43 mmol)和4-溴-1-吡唑-5-胺(0.23 g，1.43 mmol)制備產(chǎn)物，得到淺紫色固體54(0.25 g，47%)。LRMS：(390，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：12.66(1H，br.s.)，8.04(1H，s)，7.49(2H，d，J=8.1)，7.24-7.16(1H，m)，2.55(3H，s)；mp：281~283 ℃。

1.1.47 6-(2,6-二氯苯氧基)-5-甲基-3-硝基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇(55)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(1.26 g，4.32 mmol)和4-硝基-1-吡唑-5-胺(0.55 g，4.32 mmol)制備產(chǎn)物，得到白色固體55(1.09 g，71%)。LRMS：(355，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：13.40-12.58 (1H，m)，8.65(1H，s)，7.52-7.43(2H，m)，7.20(1H，t，J=8.1)，2.61(3H，s)；mp：292~297 ℃。

1.1.48 6-(2,6-二氯苯氧基)-2-乙氧基-7-羥基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲腈(56)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(0.65 g，2.24 mmol)和5-氨基-3-乙氧基-1-吡唑-4-甲腈(0.34 g，2.24 mmol)制備產(chǎn)物，得到白色固體56(0.52 g，61%)。LRMS：(379，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：13.67-13.28 (1H，m)，7.48-7.42(2H，m)，7.17(1H，t，J=8.1)，4.32(2H，q，J=7.0)，2.44(3H，s)，1.35(3H，J=7.0)；mp：271~280 ℃。

1.1.49 6-(2,6-二氯苯氧基)-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-醇的合成(57)

在一般方法5中加入酮酯33(1.40 g，4.82 mmol)和1-吡唑-5-胺(0.40 g，4.82 mmol)制備產(chǎn)物，得到白色固體57(1.02 g，69%)。LRMS：(310，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：12.52(1H，br.s.)，7.86(1H，d，J=2.0)，7.47-7.42(2H，m)，7.15(1H，t，J=8.1)，6.12(1H，d，J=2.0)，2.46(3H，s)；mp：>300 ℃。

1.1.50 6-(2,6-二氯苯氧基)-7-羥基-2,5-二甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲腈(58)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(0.72 g，2.47 mmol)和5-氨基-3-甲基-1-吡唑-4-甲腈(0.30 g，2.47 mmol)制備產(chǎn)物，得到白色固體58(0.61 g，70%)。LRMS：(349，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：13.72-13.29(1H，m)，7.46(2H，d，J=8.2)，7.21-7.12 (1H，m)，2.47(3H，s)，2.35(3H，s)；mp：>300 ℃。

1.1.51 6-[2,6-二氯-3-(三氟甲基)苯氧基]-7-羥基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲腈(59)的合成

在一般方法5中加入酮酯31(0.20 g，0.56 mmol)和5-氨基-1-吡唑-4-丁腈(60 mg，0.56 mmol)制備產(chǎn)物，得到棕色固體59(63 mg，28%)。LRMS：(403，M+H+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δH：14.14-13.30 (1H，m)，8.41(1H，s)，7.76-7.62(2H，m)，2.53(3H，s)。

1.1.52 6-(2,6-二氯苯氧基)-7-羥基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲腈(60)的合成

在一般方法5中加入酮酯33(2.69 g，9.25 mmol)和5-氨基-1-吡唑-4-丁腈(1.00 g，9.25 mmol)制備產(chǎn)物，得到棕色固體狀60(2.14 g，69%)。LRMS(335，M+H+)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：13.60 (1H，br.s)，8.39(1H，s)，7.46(1H，d，J=8.0)，7.18(1H，t，J=8.0)，2.50(3H，s)。

1.2 X射線晶體學(xué)

將化合物18、36和60的單晶樣品安裝在Paratone N(Hampton Research，Aliso Viejo，CA)上，進(jìn)行CuK衍射(Agilent，Oxford，UK)，于173 ℃ Excalibur PX Ultra衍射儀收集數(shù)據(jù)。用CrysAlis Pro(Agilent)處理數(shù)據(jù)，用abspack module進(jìn)行吸收校正。用SIR92解析結(jié)構(gòu)，用CRYSTALS對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行精修。

1.3 除草活性的生物測(cè)定

根據(jù)以下方法評(píng)價(jià)了化合物對(duì)龍葵(，SN)、反枝莧(，AR)、大狗尾草(，SF)、黑麥草(，LP)、稗草(，EC)和裂葉牽牛(，IP)的芽后除草活性。將這些雜草的種子播種在盆栽試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)土壤中?？刂茰厥?在24/16 ℃，白天/晚上，14 h光照，65%濕度)條件下，種子萌發(fā)后培育8 d，用含有0.5%吐溫20(聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯，CAS RN 9005-64-5)的丙酮-H2O(50︰50)活性成分的丙酮-水(50︰50)溶液噴霧。在以上條件下繼續(xù)培養(yǎng)，且每天澆水2次。13 d后，目視評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)植物的毒性(100=對(duì)植物的造成完全損害；0=對(duì)植物沒(méi)有損害)。施用濃度為有效成分1 000 g/hm2，施用量為1 000 L/hm2。

1.4 測(cè)定氨基三唑的產(chǎn)生

1.4.1 最初氨基三唑測(cè)定試驗(yàn)

根據(jù)以下方法評(píng)估植物中氨基三唑化合物15的產(chǎn)生。反莧枝長(zhǎng)至3葉期時(shí)，分別用化合物37、61、62和63以有效成分500 g/hm2、200 L/hm2噴霧。氨基三唑化合物以125 g/hm2施用。每個(gè)噴霧處理結(jié)束時(shí)用10 mL乙腈-水(80︰20)清洗噴霧器。用10 mL乙腈-水(80:20)洗滌葉子表面殘留物。然后在施藥后24、96 h用2×3.0 mL乙腈-水(80︰20)萃取葉子，取100 μL萃取液稀釋至1.0 mL，用于LCMS分析。檢測(cè)儀器為Thermo TSQ Quantum Discovery MS(裝有Waters Acquity sample和solventmanager)和Obelisc R柱(150 mm×2.1 mm)，用甲酸銨的乙腈-水[洗脫劑A：5.0 mM的甲酸銨水溶液；洗脫劑B：5.0 mM甲酸銨的乙腈-水(95︰5)溶液；方法：T0-0.5 min，2%A，T3-3.1min80%A，T3.2-4 min2%A]溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速：0.5 mL/min。Amitrole 15的保留時(shí)間為1.93 min。通過(guò)與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)比較確定檢出率。

1.4.2 進(jìn)一步氨基三唑測(cè)定試驗(yàn)

反枝莧在2葉期時(shí)，分別對(duì)其進(jìn)行氨基三唑化合物15和化合物2、61、64和65溶液手動(dòng)噴霧，劑量為200 μg/mL，噴霧體積為110 μL。用4.0 mL乙腈-水(80︰20)溶液沖洗葉子表面的殘留物。然后在施用后24、48 h，用4.0 mL乙腈-水(80︰20)萃取葉子，取1.0 mL萃取液進(jìn)行LCMS分析。檢測(cè)儀器為Thermo TSQ Quantum Discovery MS(裝有Waters Acquity sample和solventmanager)和Obelisc R柱(150 mm×2.1 mm)，用甲酸銨的乙腈-水[洗脫劑A：5.0 mM的甲酸銨水溶液；洗脫劑B：5.0 mM甲酸銨的乙腈-水(95︰5)溶液;方法：T0-0.5 min，2%A，T3-3.1min80%A，T3.2-4 min2%A]溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速：0.5 mL/min。Amitrole 15的保留時(shí)間為1.93 min。通過(guò)與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)比較確定檢出率。

1.5 用過(guò)度表達(dá)IspD和番茄紅素-環(huán)化酶的植物進(jìn)行研究

1.5.1 載體構(gòu)建

進(jìn)行IspD(AT2G02500，NCBI ref：NP_565286)和番茄紅素-環(huán)化酶(AT3G10230，NCBI ref：NP_187634)序列密碼子優(yōu)化以煙草表達(dá)，并用來(lái)自Genewiz(South Plainfield，NJ)的煙草花葉病毒(EMBL：TOTMV6)的5′前導(dǎo)序列合成。合成的片段在5′末端具有Xhol酶切位點(diǎn)，在3'末端具有Kpnl酶切位點(diǎn)。將合成的基因克隆到卡那霉素抗性的植物二元載體中，作為35S啟動(dòng)子后面和NOS終止子前的Xhol/Kpnl片段。

1.5.2 植物轉(zhuǎn)化

如前所述煙草(var. Samsung)的過(guò)度表達(dá)被終止了。用含有用于過(guò)度表達(dá)IspD或番茄紅素-環(huán)化酶(LYC)的植物雙元載體的根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404來(lái)轉(zhuǎn)換葉碟。通過(guò)單一轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了卡那霉素抗性煙草，并用PCR確定了轉(zhuǎn)基因的存在。

1.5.3 除草活性的生物測(cè)定

大約在轉(zhuǎn)基因植物3葉期，將這些植物進(jìn)行盆栽，并在標(biāo)準(zhǔn)溫度條件下培養(yǎng)一周。噴霧設(shè)備距離植物30 cm處噴霧，噴霧量200 L/hm2。對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的一個(gè)克隆植物進(jìn)行噴霧。對(duì)過(guò)度表達(dá)IspD的轉(zhuǎn)基因系，氨基三唑15以60 g/hm2和120 g/hm2的劑量施用；化合物37、61、62和63的劑量為500 g/hm2，化合物45、64和65的劑量為2 000 g/hm2。

對(duì)于過(guò)度表達(dá)番茄紅素-環(huán)化酶的轉(zhuǎn)基因系，氨基三唑15的用量為60 g/hm2和120 g/hm2，化合物61的為500 g/hm2，化合物62的為300 g/hm2，化合物64和65的施用量為2 000 g/hm2。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)合成

新型芳氧基系列4的化合物可分為2個(gè)不同的化學(xué)類別(方案1)。羥基氯代偶氮嘧啶(hydroxychloro azolopyrimidine)的合成[圖3，(1)]將需要最初的3-氨基唑5與2-芳氧基丙二酸酯6的縮合，然后如前所述進(jìn)行2次進(jìn)一步的化學(xué)轉(zhuǎn)化。設(shè)想3-氨基唑5與芳氧基-酮酯7直接縮合將得到在嘧啶基上含有烷基的唑并嘧啶4[圖3，(2)]。

芳氧基系列的合成開(kāi)始于制備各種2-芳氧基丙二酸酯(圖4)。苯酚系列8和氯代丙二酸二乙酯9在堿性條件下的反應(yīng)，得到中等收率的芳氧基丙二酸酯10。類似地，許多容易獲得的苯酚可以良好至高的產(chǎn)率轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的丙二酸酯11－14。

圖3 芳氧基系列4的逆合成

圖4 2-芳氧基丙二酸酯的制備

丙二酸酯10與3-氨基-1,2,4-三唑(amitrole)15縮合，得到相應(yīng)的嘧啶-5,7-二醇16，其通過(guò)兩步以良好的收率直接轉(zhuǎn)化為二氯化物17(圖5)。用氫氧化鈉部分水解17，得到異構(gòu)體的混合物，用制備型HPLC分離，以61%的產(chǎn)率得到所需的7-羥基三唑并嘧啶18以及10%的5-羥基三唑并嘧啶19。

圖5 二氯芳氧基嘧啶18的合成

主要的異構(gòu)體18的結(jié)構(gòu)經(jīng)X衍射晶體學(xué)分析得到(圖6)。發(fā)現(xiàn)三唑并嘧啶18晶體中存在N-H互變異構(gòu)體結(jié)構(gòu)。

圖6 化合物18的X-衍射晶體結(jié)構(gòu)

令人高興的是，冷凝和氯化化學(xué)可應(yīng)用于合成其他的丙二酸酯系列(表1)。通過(guò)2步，以中等(表1，編號(hào)3和4)到良好的產(chǎn)率合成二氯嘧啶20至23(表1，編號(hào)1和2)。

在相同的基本條件下，合成了所需的羥基三唑并嘧啶24至27。在所有情況下，7-羥基-三唑并嘧啶是主要的區(qū)域異構(gòu)體(表2，編號(hào)1至4)。

接下來(lái)，制備了一系列2-芳氧基-酮酯(圖7)。由化合物8原位合成苯酚鈉，然后與2-氯-3-氧代丁酸乙酯28反應(yīng)，以19%中等分離產(chǎn)率得到相應(yīng)的2-芳氧基-酮酯29。

類似地苯酚化合物30生成了醚31，產(chǎn)率提高到了39%。對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)在與-氯代-酮酯反應(yīng)之前，用氫氧化鈉形成和分離化合物32的苯酚鈉，得到相應(yīng)的醚33和34，且產(chǎn)率提高了(圖8)。

表1 芳氧基丙二酸酯經(jīng)2步反應(yīng)生成二氯化物

注：a2步反應(yīng)的分離率。

在酸性條件下，醚29與氨基三唑15縮合得到相應(yīng)的三唑并嘧啶35，產(chǎn)率63%(表3，編號(hào)1)。令人高興的是，這些反應(yīng)條件可以應(yīng)用于廣泛的3-氨基三唑(表3，編號(hào)1至17)和3-氨基吡唑(表3，編號(hào)18至26)的反應(yīng)，以合成多種6-芳氧基-7-羥基唑并嘧啶。大多數(shù)6-芳氧基-7-羥基唑并嘧啶由醚化合物33合成，盡管醚34(表3，編號(hào)6至8)和31(表3，編號(hào)3-5和25)也可成功地反應(yīng)。

表2 羥基三唑并嘧啶的形成

注：a對(duì)粗反應(yīng)混合物進(jìn)行1HNMR分析所得；b7-羥基異構(gòu)體分離產(chǎn)率；c沒(méi)有進(jìn)一步純化，產(chǎn)品為4︰1異構(gòu)體的混合物。

圖7 用NaH合成2-芳氧基-β酮酯29和31

圖8 用NaOH合成2-芳氧基β-酮酯

其中每種化合物都可被分離為單個(gè)區(qū)域異構(gòu)體。對(duì)三唑衍生物36(用DMS8O-MeCN重結(jié)晶)和吡唑衍生物60(用H2O-MeCN中重結(jié)晶)進(jìn)行X射線晶體學(xué)分析發(fā)現(xiàn)二者都為N-H的互變異構(gòu)體，證實(shí)了縮合反應(yīng)的區(qū)域選擇性(圖9)。

2.2 生物學(xué)特征

2.2.1 除草活性

以氨基三唑15和芐基化三唑并嘧啶2(圖1)為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估了所有新化合物對(duì)6種常見(jiàn)的雜草芽前和芽后的除草活性。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芳氧基系列化合物沒(méi)有顯著的芽前的除草活性，大多數(shù)化合物的活性低于標(biāo)準(zhǔn)化合物(表4，編號(hào)3)，所有化合物的活性都低于氨基三唑。然而，數(shù)個(gè)化合物相的除草活性與化合物2相似(表4，編號(hào)4和6)或高于其(表4，編號(hào)5)。

表3 5-烷基唑并嘧啶酮的形成

注：a分離產(chǎn)率。

在本研究中還測(cè)試了許多沒(méi)有芳氧基或芐基取代基的化合物，例如已知為除草劑的簡(jiǎn)單的羥基-三唑并嘧啶61和相關(guān)的三唑并嘧啶62和63(表4，編號(hào)8至10)，以及芐基化的三唑并嘧啶2的類似物(表4，編號(hào)11和12)。

2.2.2 除草癥狀

所有具有除草活性的化合物(表4，編號(hào)3至10)，包括新穎芳氧基化合物(表4，編號(hào)3至7))引起了類似于引導(dǎo)化合物2的白化癥狀，表明它們都有同樣的作用機(jī)制。有趣的是，這種漂白癥狀也與氨基三唑化合物 15所顯示癥狀相似。顯然，大部分的芳氧基系列化合物是氨基三唑經(jīng)一步化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生；盡管在樣品的分析中沒(méi)有檢測(cè)到氨基三唑，但它仍然作為生測(cè)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。從其他氨基唑衍生而來(lái)的化合物的活性一般低于從氨基三唑衍生來(lái)的化合物。氨基三唑化合物由于不利的毒理特性，在歐盟和美國(guó)作為非選擇性除草劑的非農(nóng)用途受到了限制。這當(dāng)然意味著在植物中能產(chǎn)生氨基三唑的任何新類別的除草劑將不會(huì)具有吸引力的商業(yè)前景。氨基三唑15的除草靶標(biāo)未知。各種研究表明，此物質(zhì)抑制植物酶八氫番茄紅素去飽和酶、番茄紅素環(huán)化酶、咪唑甘油-磷酸脫水酶和過(guò)氧化氫酶，但已排除抑制組氨酸生物合成的作用為其作用機(jī)制。另外，有人提出，抗禾草靈的瑞士黑麥草體內(nèi)氨基三唑抑制禾草靈羥化酶，即細(xì)胞色素P450微粒體氧化酶；這解釋了氨基三唑化合物和禾草靈對(duì)此種抗性蟲(chóng)增效試驗(yàn)中禾草靈代謝水平降低的原因。為了弄明白化合物的白化作用的緣由，挑選了一些化合物，包括芳氧基系列4的化合物，研究了它們?cè)谥参矬w內(nèi)代謝和抗性情況。

圖9 混合物36和60的X-衍射晶體結(jié)構(gòu)

2.3 植物代謝研究

為了確定三唑并嘧啶化合物白化作用是否由氨基三唑15所致，對(duì)反枝莧進(jìn)行了葉萃取生測(cè)試驗(yàn)?；衔?7、61、62和63以有效成分500 g/hm2施用，用LCMS測(cè)定了不同時(shí)間點(diǎn)葉提取物中的氨基三唑的量。

在處理后0、1、4 d測(cè)定葉提取物的結(jié)果表明所有處理中都產(chǎn)生了氨基三唑15。氨基三唑的產(chǎn)生是暫時(shí)的，在施用后1 d其量達(dá)到峰值，化合物61處理中氨基三唑15的量最大。4 d后，所有處理均表現(xiàn)出分生組織白化癥狀，與氨基三唑的相似，然而白化量與葉提取物中氨基三唑的水平無(wú)相關(guān)性。

表4 芳氧基系列a化合物的選擇性除草活性

注：a芽后除草效果；b雜草名稱縮寫見(jiàn)1.3節(jié)。

接著，以氨基三唑和化合物61為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定了化合物2和其類似物64和65在植物中產(chǎn)生氨基三唑的情況。這些化合物的施用劑量比最初研究中的更低，檢測(cè)到的氨基三唑的水平也低，但發(fā)現(xiàn)化合物2、64和65在反枝莧體中產(chǎn)生顯著水平的氨基三唑。在此較低的濃度水平，處理中幾乎沒(méi)有白化癥狀發(fā)生。然而，所有處理都出現(xiàn)壞死，葉片縮水和卷曲的癥狀，這可能是由于產(chǎn)生亞致死劑量的氨基三唑，新生長(zhǎng)點(diǎn)受損所致。這些試驗(yàn)結(jié)果與假設(shè)的情況一致，即假設(shè)觀察到除草活性是由于植物體內(nèi)生成氨基三唑所致。

2.4 作用機(jī)制的研究

2.4.1 植物過(guò)度表達(dá)IspD

如上所述培育了表達(dá)高水平IspD的煙草。測(cè)定了活性最好的化合物即芳氧基系列化合物37和45以及化合物61至63對(duì)基因修飾和野生型煙草的除草活性。

所有化合物對(duì)基因修飾與野生型煙草的除草活性幾乎沒(méi)有差異(表5，條目1至5)，這表明這些化合物的除草活性不是因?yàn)橐种艻spD所致。有趣的是，用一些化合物處理時(shí)觀察到的除草活性表明了IspD水平升高的適合度代價(jià)(表5，條目1至3，5至7和9)。

2.4.2 植物過(guò)度表達(dá)番茄紅素-環(huán)化酶

如上所述培育了高水平表達(dá)番茄紅素-環(huán)化酶的煙草。測(cè)試了氨基三唑15和化合物61、62、64和65對(duì)基因修飾和野生型煙草的除草活性。

氨基三唑15(表6，編號(hào)1和2)對(duì)過(guò)度表達(dá)番茄紅素-環(huán)化酶的煙草的活性要低于對(duì)野生型的。煙草過(guò)度表達(dá)番茄紅素-環(huán)化酶后對(duì)60 g/hm2的的氨基三唑具有耐受性，而對(duì)120 g/hm2氨基三唑具有部分耐受性。氨基三唑施用量為120 g/hm2時(shí)，番茄紅素-環(huán)化酶抗性植物的白化程度比野生型植物降低很多。這些結(jié)果表明，氨基三唑15的作用機(jī)制為抑制番茄紅素-環(huán)化酶的活性。化合物61和62對(duì)番茄紅素-環(huán)化酶過(guò)度表達(dá)的煙草的除草活性(表6，編號(hào)3和4)低于對(duì)野生型煙草，前者的白化程度也低于后者。這與植物代謝研究結(jié)果都明顯表明化合物61和62的除草活性是由于它們?cè)谥参矬w內(nèi)生成了氨基三唑?；衔?4和65對(duì)野生型和番茄紅素-環(huán)化酶抗性煙草具有弱的除草活性，這難以確定它們對(duì)其他植物的作用方式，盡管它們?cè)诜粗η{體內(nèi)生成了氨基三唑，并且過(guò)度表達(dá)IspD的植物對(duì)化合物64沒(méi)有耐受性。

表5 化合物對(duì)野生型和過(guò)度表達(dá)IspD煙草除草活性a比較

注：a芽后防效(%，100=對(duì)整個(gè)植物有損害，0=對(duì)植物無(wú)損害)；b劑量60 g/hm2；c劑量120 g/hm2；d劑量500 g/hm2；e劑量300g/hm2；f 2 000 g/hm2；g3個(gè)重復(fù)的平均值。

表6 化合物對(duì)野生型和過(guò)度表達(dá)番茄紅素β-環(huán)化酶煙草的除草活性a比較

注：a芽后防效(%，100=對(duì)整個(gè)植物有損害，0=對(duì)植物無(wú)損害)；b劑量60 g/hm2；c劑量120 g/hm2；d劑量500 g/hm2；e劑量300 g/hm2；f2 000 g/hm2；g4個(gè)重復(fù)的平均值；h4個(gè)重復(fù)的平均值。

3 結(jié) 論

制備了大量的芳族氧基系列4的羥基三唑并嘧啶和羥基吡唑并嘧啶化合物，并且測(cè)定了它們的除草活性和構(gòu)效關(guān)系。只有羥基三唑并嘧啶亞類化合物具有顯著的除草活性。此外，這一系列中只有少數(shù)幾個(gè)化合物的活性比先導(dǎo)化合物2高，報(bào)道化合物2的除草活性作用機(jī)制為對(duì)植物中類異戊二烯生物合成的非甲羥戊酸途徑的IspD有抑制作用。觀察到這些除草劑與氨基三唑15有相似的白化癥狀，這意味著羥基三唑并嘧啶可能為氨基三唑的復(fù)雜前藥。隨后研究了化合物2、37和61在反枝莧體內(nèi)代謝情況，結(jié)果證明確實(shí)如此。之后測(cè)定了氨基三唑15、化合物37、45和61－65對(duì)過(guò)度表達(dá)IspD的植物的除草活性，發(fā)現(xiàn)對(duì)IspD的抑制作用并不是化合物除草活性的作用機(jī)制。最后，測(cè)定了氨基三唑15和化合物61、62、64和65對(duì)過(guò)度表達(dá)番茄紅素-環(huán)化酶植物的除草活性，結(jié)果為氨基三唑?qū)蛐揎椫参锏幕钚燥@著低于對(duì)野生型的，表明其作用方式是抑制番茄紅素-環(huán)化酶的活性?；衔?1和62對(duì)過(guò)度表達(dá)番茄紅素-環(huán)化酶植物的除草活性也降低了，這與植物代謝研究結(jié)果表明這些化合物之所以具有除草活性是因?yàn)樗鼈冊(cè)谥参矬w內(nèi)生成了氨基三唑。目前羥基三唑并嘧啶生成氨基三唑的生物化學(xué)機(jī)制尚不清楚，可能涉及氧化途徑，如尿嘧啶的代謝。

總之，以上研究表明，商業(yè)產(chǎn)品氨基三唑的除草活性源于對(duì)植物中番茄紅素-環(huán)化酶的抑制，本文所述的一些羥基三唑并嘧啶的除草活性是由于它們?cè)谥参镏猩闪税被颉?/p>

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.03.02

TQ450

A

1009-6485(2017)03-0007-13

章樂(lè)天(1994—)，男，漢族，在讀碩士研究生。E-mail: zlt94zlt@163.com。

2017-05-10。