Borna病病毒與病毒性腦炎及精神分裂癥的關(guān)系

張 麗 劉 玫 徐 平 蔣國紅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

Borna病病毒與病毒性腦炎及精神分裂癥的關(guān)系

張 麗 劉 玫 徐 平 蔣國紅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

目的探討B(tài)orna病病毒(BDV)與精神分裂癥(SCH)及病毒性腦炎(VE)發(fā)病的關(guān)系。方法對(duì)來自遵義市、畢節(jié)地區(qū)等貴州省部分地區(qū)的健康人100例、SCH患者30例、VE患者62例的外周血單核細(xì)胞(PBMC)采用巢式逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR法檢測(cè)是否存在BDVp24基因片段，并純化、克隆陽性產(chǎn)物，對(duì)陽性產(chǎn)物測(cè)序并進(jìn)行同源性分析。結(jié)果BDVp24基因片段在VE〔6.5%(4/62)〕與健康人(0%)中的陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但健康人與SCH患者陽性率〔6.7%(2/30)〕比較無顯著差異(P>0.05)。SCH患者與VE患者經(jīng)檢測(cè)之后存在完全相同的測(cè)序結(jié)果，相較于GenBank提供的Strain V毒株、C6BV毒株、1766毒株和He80/FR病毒株存在3%、3%、2%和3%的突變率，其中有3個(gè)、3個(gè)、2個(gè)和3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生一致的基因沉寂性突變，BDV與1766毒株最相似，SCH患者的臨床表現(xiàn)與VE患者的臨床表現(xiàn)相似。結(jié)論遵義市、畢節(jié)地區(qū)等貴州省部分地區(qū)VE的發(fā)生率可能與BDV感染有關(guān)。BDV p24基因片段未在健康人中檢出。

Borna病病毒；精神分裂癥；病毒性腦炎

Borna病病毒(BDV)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嗜神經(jīng)病毒，BDV感染可引起腦脊髓炎，出現(xiàn)精神行為異?！?〕。馬類最容易被感染，還可以感染鳥類及驢、騾、羊、牛和貓等動(dòng)物，人類也有被感染的報(bào)道，雖然病例數(shù)相對(duì)較少，但仍需要醫(yī)護(hù)人員予以高度重視〔2〕。許多國外學(xué)者對(duì)BDV與病毒性腦炎(VE)及精神分裂癥(SCH)的關(guān)系進(jìn)行了研究，但多集中于牲畜，關(guān)于人BDV感染的研究較少〔3〕。本文通過檢測(cè)SCH和VE患者及健康人的外周血單核細(xì)胞(PBMC)是否存在BDVp24基因片段，并純化、克隆陽性產(chǎn)物及對(duì)陽性產(chǎn)物測(cè)序和同源性分析，試圖探明其感染途徑，以期為疾病的早期診斷、治療及疫苗研制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2010年1～7月經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的來自遵義市、畢節(jié)地區(qū)的VE患者62例，男35例，女27例，年齡14～76〔平均(32.84±10.23)〕歲；同期經(jīng)遵義市優(yōu)撫醫(yī)院收治的來自遵義市、畢節(jié)地區(qū)的SCH患者30例，男14例，女16例，年齡19～63〔平均(43.84±7.62)〕歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)VE患者經(jīng)臨床癥狀、腦脊液生化和常規(guī)檢測(cè)、腦電圖檢查等方式明確診斷；(2)SCH患者按照中國精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)第3版(CCMD-Ⅲ)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者臨床癥狀及表現(xiàn)符合SCH臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)入選患者一般人口學(xué)資料完整，采集的標(biāo)本滿足本研究中的所有檢測(cè)項(xiàng)目。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他疾病(可能影響檢測(cè)結(jié)果，如細(xì)菌及真菌性腦炎、藥物或精神活性物質(zhì)所致精神障礙)者。同期在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院或遵義市優(yōu)撫醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康人100例，男50例，女50例，年齡21～64〔平均(44.87±5.94)〕歲。VE、SCH患者及健康人的性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2主要儀器與試劑 ABI 7500熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)、微量加樣器(德國Eppendorf公司)、逆轉(zhuǎn)錄儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。熒光探針、內(nèi)、外引物在中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)輝基因診斷中心合成。熒光探針：3′標(biāo)記的是4-甲基羅達(dá)明(TAMRA)，5′標(biāo)記的是62羧基熒光素(FAM)。

1.3方法 為了防止各種試劑及標(biāo)本的污染，嚴(yán)格按消除RNase的常規(guī)方法對(duì)所有涉及RT2PCR實(shí)驗(yàn)的用品進(jìn)行處理。抽取每位研究對(duì)象外周血5 ml，常規(guī)處理后采用Ficoll-conray液分離出PBMC，采用Tripure RNA提取試劑盒(購于北京博凌科為生物科技有限公司)提取細(xì)胞總RNA，已經(jīng)提取的RNA標(biāo)本置-70℃冰箱保存。將RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(藍(lán)博生物技術(shù)有限公司提供)中提供的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將產(chǎn)物置-20℃冰箱保存。

1.4BDV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法 以陽性模板為陽性重組質(zhì)粒，定量、稀釋之后形成102、103、104、105的濃度梯度，PCR擴(kuò)增采用ABI Prism 7500 型擴(kuò)增檢測(cè)儀，PCR產(chǎn)物定量實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)設(shè)置為每間隔8 s進(jìn)行一次，最終獲取PCR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。以首先獲得數(shù)據(jù)的自然對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，獲得定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，斜率、截距和相關(guān)系數(shù)依次為-3.389 078、45.098 53和0.996 475。

1.5巢氏逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR 共分2輪，第一輪行常規(guī)PCR，第二輪行熒光定量PCR，在第二輪擴(kuò)增的PCR反應(yīng)混合物中加入熒光探針及第一輪產(chǎn)物。

1.6陽性BDV P24基因片段處理 首先采用醋酸鈉乙醇沉淀法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后將純化后的產(chǎn)物與pMD1-T載體進(jìn)行連接，再用大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，采用藍(lán)白斑法對(duì)重組子進(jìn)行篩選，并收集每一標(biāo)本的陽性菌落進(jìn)行培養(yǎng)。采用FQ-PCR對(duì)提取后的質(zhì)粒DNA進(jìn)行鑒定，再對(duì)陽性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BDVp24 基因片段的檢測(cè)率 VE患者BDVp24基因片段陽性率〔6.5%(4/62)〕明顯高于健康人(0例，P<0.05)；SCH患者中雖也有陽性檢出者，但由于陽性率較低〔6.7%(2/30)〕，但與健康人比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2BDVp24 基因片段序列測(cè)定結(jié)果 與國外標(biāo)準(zhǔn)株和流行株(GenBank提供)進(jìn)行同源性分析，分析時(shí)采用基于局部比對(duì)算法的搜索工具(BLSAT)軟件，分析結(jié)果顯示陽性產(chǎn)物均證明為BDVp24基因片段，SCH患者與VE患者的測(cè)序結(jié)果一致，相較于Strain V毒株(GenBank提供)存在3%的突變率，其中3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生一致性沉寂突變(nt1674 C-T，nt1671C-T，nt1650 T-C)；相較于C6BV毒株存在3%的突變率，其中3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生一致性沉寂突變(nt1671 C-T，nt1668 A-G，nt1659 T-C)；相較于1766毒株存在2%的突變率，其中的nt1678 T-C和nt1675 C-T 2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生一致性沉寂突變；相較于He80/FR病毒株存在3%突變率，其中的nt1672 C-T，nt1669 A-G和nt1660 T-C 3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生一致性沉寂突變。相比之下，此次檢測(cè)的BDV陽性BDVp24基因片段與1 766毒株最相似。見圖1，圖2。

6例呈S型曲線(陽性)，SCH為②③；VE為①④⑤⑥ 圖1 FQ-nRT-PCR檢測(cè)VE與SCH患者PMBCs中BDV RNA 的熒光Rn循環(huán)數(shù)變化曲線

Strain V(核苷酸序列號(hào)：AJ311521)，H1766(核苷酸序列號(hào)：AJ311523)，He80/FR(核苷酸序列號(hào)：AJ311522)圖2 VE及SCH患者BDV p24核苷酸序列結(jié)果及與馬BDV p24核苷酸序列(86bp)比較

2.3陽性患者臨床表現(xiàn) BDVp24基因片段陽性的SCH患者與VE患者的臨床表現(xiàn)具有相似性，即均有精神行為的異常。SCH患者出現(xiàn)精神行為異常是毋庸置疑的；而4例VE患者臨床表現(xiàn)不同程度精神異常，有些煩躁不安、言語增多、胡言亂語，有些情感淡漠、不語、不動(dòng)，有些有幻覺及被害妄想，有些甚至有沖動(dòng)攻擊行為，只是SCH患者的精神癥狀更嚴(yán)重。

3 討 論

BDV屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)新發(fā)病毒中的一種，動(dòng)物和人感染該病毒后主要表現(xiàn)為精神行為異常，主要病理改變?yōu)檫吘壪到y(tǒng)中積聚特異性抗原及炎性細(xì)胞浸潤腦膜及腦細(xì)胞〔4〕。德國的Rott于1985年通過熒光抗體法在SCH癥患者身上檢測(cè)出腦脊液BDV抗體〔2〕，進(jìn)而人們認(rèn)識(shí)到BDV可能感染人類。臨床研究中不少VE患者出現(xiàn)精神行為異常，但他們的病因一直未能明確，后來發(fā)現(xiàn)BDV感染的馬與這些精神行為異常的腦炎患者臨床表現(xiàn)極為相似，于是猜想BDV感染與不明原因的VE有關(guān)？較城市居民而言，農(nóng)村居民中VE患者的發(fā)病率較高，其原因是農(nóng)村居民與動(dòng)物接觸機(jī)會(huì)較多，所以猜想人類感染BDV較理想的模型是VE〔5〕。有研究〔6〕指出我國約2%～13%的神經(jīng)精神疾病患者有BDV感染，而不同地區(qū)BDV感染率呈現(xiàn)出較大的差異。

本研究中，VE患者BDVp24基因片段陽性率高于健康人，原因可能為〔7～11〕：(1)收集的標(biāo)本并不是在VE疾病高峰時(shí)的標(biāo)本，即不同檢測(cè)時(shí)間呈現(xiàn)出不同的檢出率；不同的標(biāo)本類型有不同的檢出率，腦脊液通常比外周血陽性率高一點(diǎn)，而本次的標(biāo)本是外周血。(2)檢測(cè)差異可能也與檢測(cè)方法有關(guān)。(3)不同區(qū)域存在不同生活習(xí)慣與生活方式，與動(dòng)物接觸的概率存在差異，其感染BDV的可能性也不同。(4)在實(shí)際操作中分離PBMC技術(shù)水平低、標(biāo)本保存不合理、操作細(xì)節(jié)處理不細(xì)致等個(gè)人原因促使RNA降解，進(jìn)而對(duì)檢測(cè)BDVp24基因片段造成影響〔12〕。

1Cloes R，Ahmad A，Reintjes R.Risk communication during the 2009 influenza A(H1N1)pandemic：stakeholder experiences from eight European countries〔J〕.Disaster Med Public Health Prep，2015；9(2)：127-33.

2陳 靜，徐 平.博爾納病病毒的生活周期〔J〕.貴州醫(yī)藥，2015；39(7)：658-60.

3Scordel C，Huttin A，Cochet-Bernoin M，etal.Borna disease virus phosphoprotein impairs the developmental program controlling neurogenesis and reduces human GABAergic neurogenesis〔J〕.PLoS Pathog，2015；11(4)：e1004859.

4姚能云，佘艷梅，周紅勤，等.以精神行為異常起病的腦炎患者與博爾納病病毒感染的關(guān)系〔J〕.中華神經(jīng)科雜志，2015；48(4)：307-11.

5葉緒芳，趙蘇曄.貴州省農(nóng)村地區(qū)病毒性腦炎感染現(xiàn)狀研究〔J〕.中國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2016；7(17)：9-11.

6陳 靜，徐 平，劉海軍.病毒性腦炎患者腦脊液博爾納病病毒p40基因片段的檢測(cè)〔J〕.中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2016；19(3)：1-3.

7Honda T.Neuropathogenesis of persistent infection with Borna disease virus〔J〕.Uirusu，2015；65(1)：145-54.

8劉海軍，謝祖勤，郭 霞，等.貴州部分地區(qū)精神分裂癥患者血清PBMC博爾納病病毒CIC及抗體的檢測(cè)〔J〕.貴州醫(yī)藥，2015；39(3)：203-6.

9Ferré CA，Davezac N，Thouard A，etal.Manipulation of the N-terminal sequence of the Borna disease virus X protein improves its mitochondrial targeting and neuroprotective potential〔J〕.FASEB J，2016；30(4)：1523-33.

10雷以會(huì)，徐 平，楊利玲.貴州遵義地區(qū)82只健康蝙蝠腦組織博爾納病毒核蛋白檢測(cè)〔J〕.山東醫(yī)藥，2016；56(11)：23-5.

11McHugh JM，de Kloet SR.Discrepancy in the diagnosis of avian Borna disease virus infection of Psittaciformes by protein analysis of feather calami and enzyme-linked immunosorbent assay of plasma antibodies〔J〕.J Vet Diagn Invest，2015；27(2)：150-8.

12楊利玲，雷以會(huì)，徐 平.貴州遵義地區(qū)蝙蝠腦組織BDV-P24基因片段的檢測(cè)〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2016；32(2)：156-9.

〔2017-07-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

R749

A

1005-9202(2017)19-4772-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.035

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31160210)

徐 平(1963-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科研究。

張 麗(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科研究。