人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞用于亨廷頓病大鼠模型的移植治療

陳 波 劉智明 杜謝琴 余小祥

(武漢市第三醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞用于亨廷頓病大鼠模型的移植治療

陳 波 劉智明1杜謝琴 余小祥

(武漢市第三醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

目的探討用于亨廷頓病(HD)治療提供的藥物篩選模型。方法SD大鼠45只，分為正常對照組、毀損組、移植組三組，每組15只。正常組不予以處理，其余兩組均用奎寧酸(QA)腦內(nèi)注射，移植組在QA毀損模型建立后進(jìn)行人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)移植。hiPSC在大鼠腦內(nèi)存活了7 w，通過阿撲嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗等行為學(xué)實驗，觀察各組大鼠運動功能情況；通過高十字迷宮、新環(huán)境抑制進(jìn)食實驗，觀察各組焦慮類似的行為變化。結(jié)果與QA組相對比，觀察到hiPSC移植組大鼠運動功能得到改善，大鼠焦慮類似的行為明顯減少。hiPSC移植組大鼠的活動減少。結(jié)論hiPSC移植可以有效的改善HD大鼠的行為缺陷，hiPSC在治療神經(jīng)退行性疾病特別是HD，是一種理想的多潛能干細(xì)胞來源。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；亨廷頓??；細(xì)胞移植；運動和非運動功能檢測

亨廷頓病(HD)是一種以紋狀體和大腦皮質(zhì)中型棘狀神經(jīng)元大量丟失為特點的疾病，皮層神經(jīng)元的丟失、變性會導(dǎo)致HD大鼠模型出現(xiàn)認(rèn)知和情緒方面的改變〔1〕。盡管HD的致病基因和相關(guān)蛋白都已清楚，但確切的致病機(jī)制仍不清楚。研究表明，將興奮性毒性物質(zhì)奎寧酸(QA)注射至紋狀體內(nèi)可以模擬HD病理改變，進(jìn)行移植治療的研究〔2，3〕。隨著細(xì)胞治療技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞移植被認(rèn)為是HD治療最有前景的方法，尤其是人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)，通過將外源性轉(zhuǎn)錄因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)〔4〕導(dǎo)入人或動物體細(xì)胞誘導(dǎo)其逆分化而形成多能干細(xì)胞(iPSC)，具有多能分化潛能及自我更新能力。有研究〔5〕利用帕金森病(PD)患者自體來源的iPSC分化為多巴胺能神經(jīng)元后移植至PD大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)了明顯的行為學(xué)改善。Jeon等〔6〕使用HD患者自體來源的iPSC分化而成的神經(jīng)前體細(xì)胞移植治療HD大鼠，獲得了明顯的行為學(xué)改善，并在宿主靶區(qū)探測到分化形成的γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元。本研究移植iPSC至QA毀損的HD模型大鼠，觀察其對大鼠運動和非運動功能的改善作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物 所有的動物測試和訓(xùn)練過程符合醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，隨機(jī)分籠，每籠5只大鼠，21℃、65%的濕度飼養(yǎng)，晝夜節(jié)律為12 h，不限食水。分為三組，對照組15只不予以任何處理，QA毀損組：QA毀損的HD大鼠模型，hiPSC移植組：在建模成功后移植hiPSC。

1.2方法

1.2.1hiPSC用含標(biāo)記基因病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo) 用重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)hiPSC，將第3代hiPSC以3×106個接種至T75培養(yǎng)瓶中，2 d后開始轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率通過熒光顯微鏡檢測GFP和JRed基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)導(dǎo)72 h后用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2QA注射毀損紋狀體、誘導(dǎo)iPSC移植 大鼠腹腔麻醉后，除對照組外單次注射QA至單側(cè)紋狀體，7 d后將大鼠隨機(jī)分為兩組，一組移植hiPSC至紋狀體毀損側(cè)，另一組在毀損側(cè)紋狀體注射堿性磷酸鹽。

1.2.3運動功能測試

1.2.3.1阿撲嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實驗 所有的大鼠按照1.0 mg/kg注射阿撲嗎啡，放置在有機(jī)玻璃圓筒中，每60 min記錄一次動物的旋轉(zhuǎn)運動，在移植后2、4、6 w分別測試一次。計算損毀側(cè)同側(cè)和對側(cè)身體旋轉(zhuǎn)次數(shù)：毀損同側(cè)的凈旋轉(zhuǎn)百分比=同側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)-對側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)/總旋轉(zhuǎn)次數(shù)×100%。

1.2.3.2懸掛實驗 大鼠咬住粗0.5 cm線，線距離地面高度為30 cm，記錄在60 s內(nèi)跌落次數(shù)。每周測試3 d，每次3個實驗，取平均成績。在移植后1～6 w進(jìn)行最后的運動測試結(jié)果。

1.2.4非運動測試

1.2.4.1高架十字迷宮實驗 測試前將每只大鼠放置在迷宮中適應(yīng)5 min，實驗觀察員在距裝置2 m處觀察大鼠的行為。在預(yù)實驗完成后，將大鼠置于裝置的中間面對開放的臂，測試焦慮相關(guān)的行為，包括在開放和封閉的臂中所用總時間，在開放臂中花費更長時間預(yù)示焦慮程度低，測量總運動距離評價自發(fā)活動水平。

1.2.4.2新環(huán)境進(jìn)食抑制實驗 將糖丸放置在新環(huán)境的中央，記錄每只大鼠離開角落的等待時間和達(dá)到并開始進(jìn)食糖丸的時間，記錄喂食的情況，再將大鼠放回至原籠子中，記錄在5、15、30 min時大鼠攝入食物量，作為衡量攝食的動力。

1.2.5組織學(xué)分析 向腹腔內(nèi)注射胺碘酮(100 mg/kg)和鹽酸賽拉嗪(5 mg/kg)，然后固定腦組織并稱重，用10%甲醛固定7 d后切除后腦，將前腦石蠟包埋后在顯微鏡下薄片切片機(jī)下連續(xù)切片，采用蘇木素-曙紅和0.5%紫羅蘭進(jìn)行染色，蓋上玻片，在10倍的普通顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用多重測量方差分析，所有的多重比較均采用圖基(tukey)事后比較法進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1阿撲嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗行為學(xué)分析 hiPSC移植組移植后2 w旋轉(zhuǎn)運動減少。只有QA毀損組隨著時間表現(xiàn)出旋轉(zhuǎn)運動次數(shù)不斷增加，hiPSC移植組表現(xiàn)出減少的趨勢，在所有的移植后階段均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

2.2懸掛測試 在移植后6 w，QA毀損組和hiPSC移植組從線上跌落的潛伏期時間表現(xiàn)出預(yù)期的效果。與hiPSC移植組相比，QA毀損組在線上懸掛的時間更短(P<0.001)。見圖2。

圖1 阿撲嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗行為學(xué)分析

圖2 懸掛測試

2.3高架十字迷宮檢測大鼠的焦慮水平 在移植后3 w和QA毀損組相比，hiPSC移植組在封閉臂中花的時間更短。hiPSC移植組和對照組在焦慮程度上沒有區(qū)別。見圖3。

圖3 三組大鼠在封閉的短臂中的時間比較

2.4新環(huán)境進(jìn)食抑制實驗中的焦慮類似的表現(xiàn) QA毀損組表現(xiàn)出明顯的焦慮類似的表現(xiàn)。和QA毀損組大鼠相比，在新環(huán)境進(jìn)食移植實驗中，hiPSC移植組大鼠在曠場實驗的儀器中進(jìn)食等待時間〔(310.8±23.7)s〕明顯短于QA毀損組〔(438.7±25.8)s〕(P<0.01)。

3 討 論

HD可導(dǎo)致運動功能和精神方面的異常，目前研究主要通過動物模型探索改善行為的神經(jīng)學(xué)方面機(jī)制，這些機(jī)制包括神經(jīng)元的分化和替代治療、生長因子的釋放等，且都可能與損傷修復(fù)的過程有關(guān)。根據(jù)之前的研究發(fā)現(xiàn)，hiPSC移植至HD大鼠模型中可能緩解運動功能和認(rèn)知功能的缺陷〔6〕，且hiPSC相對其他細(xì)胞移植手段，可以通過采用患者自體來源的細(xì)胞，重編程為hiPSC，避免移植后的免疫排斥反應(yīng)，是一種極好的細(xì)胞來源〔7〕。本研究結(jié)果表明，在QA毀損組中，大鼠的功能缺失會隨著時間越來越嚴(yán)重，而將hiPSC移植至QA毀損的HD模型中沒有出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，由紋狀體退化導(dǎo)致的運動和探索功能得到了顯著的改善，運動功能的損害和情緒的缺陷很少。盡管可以觀察到探索的形式如站立、排泄的次數(shù)、恐懼的次數(shù)較少等改變，QA毀損的大鼠運動基線水平?jīng)]有限制大鼠的行為學(xué)改變，且相對于hiPSC移植組大鼠來說運動更加頻繁。在探索新環(huán)境中，大鼠通過測試站立和排泄次數(shù)提示情緒覺醒增多了，隨著過程的不斷熟練而情緒狀態(tài)覺醒減少。在移植hiPSC至QA毀損的大鼠后6 w，重建了情緒狀態(tài)的水平。

盡管hiPSC的移植治療呈現(xiàn)出極有前景的發(fā)展趨勢，但是在臨床上利用細(xì)胞替代治療HD正處于審查的階段，雖然理論上可行，細(xì)胞替代治療的局限性仍備受關(guān)注〔8〕，目前面臨的難題還有移植細(xì)胞的存活、理論的可行性和異體移植后的排斥反應(yīng)等〔9〕。總之，向HD大鼠模型紋狀體內(nèi)移植hiPSC可能緩解HD的運動和非運動缺陷，作為理想的藥物篩選模型及移植治療干預(yù)手段的運用和推廣有待更深層次的研究。

1Picconi B,Passino E,Sgobio C,etal.Plastic and behavioral abnormalities in experimental Huntington′s disease:a crucial role for cholinergic interneurons〔J〕.Neurobiol Dis,2006;22(1):143-52.

2Freeman TB,Hauser RA,Sanberg PR,etal.Neural transplantation for the treatment of Huntington′s disease〔J〕.Prog Brain Res,2000;127(3):405-11.

3Leavitt BR,van Raamsdonk JM,Shehadeh J,etal.Wild-type Huntingtin protects neurons from excitotoxicity〔J〕.J Neurochem,2006;96(4):1121-9.

4Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,etal.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors〔J〕.Cell,2007;131(5):861-72.

5Novais A,Ferreira AC,Marques F,etal.Neudesin is involved in anxiety behavior:structural and neurochemical correlates〔J〕.Front Behav Neurosci,2013;7(1):119.

6Jeon I,Choi C,Lee N,etal.In vivo roles of a patient-derived induced pluripotent stem cell line(HD72-iPSC)in the YAC128 model of huntington′s diseaseInt〔J〕.J Stem Cells,2014;7(1):43-7.

7Haddad-Mashadrizeh A,Bahrami AR,Matin MM,etal.Evidence for crossing the blood barrier of adult rat brain by human adipose-derived mesenchymal stromal cells during a 6-month period of post-transplantation〔J〕.Cytotherapy,2013;15(8):951-60.

8Li Y,Nguyen HV,Tsang SH.Skin biopsy and patient-specific stem cell lines〔J〕.Methods Mol Biol,2016;1353(1):77-88.

9Edalatmanesh MA,Bahrami AR,Hosseini E,etal.Bone marrow derived mesenchymal stem cell transplantation in cerebellar degeneration:a behavioral study〔J〕.Behav Brain Res,2011;225(1):63-70.

〔2016-12-03修回〕

(編輯 郭 菁)

R39

A

1005-9202(2017)19-4758-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.029

湖北省自然科學(xué)基金資助項目(面上基金)(No.2014CFB450)；武漢市衛(wèi)生計生委臨床醫(yī)學(xué)科研資助項目(No.wx15D21)

1 武漢市武昌醫(yī)院

劉智明(1968-)，男，主任醫(yī)師，博士，主要從事神經(jīng)外科方面研究。

陳 波(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科方面研究。