小鼠主動脈縮窄術(shù)后心肌水腫與水通道蛋白表達的相關(guān)性

黃 誠 呂洪臻 黃素琴 劉 穎 高 敏 韓扣蘭

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城 224005)

小鼠主動脈縮窄術(shù)后心肌水腫與水通道蛋白表達的相關(guān)性

黃 誠 呂洪臻 黃素琴 劉 穎 高 敏 韓扣蘭

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城 224005)

目的觀察小鼠心肌組織水通道蛋白(AQP)1的表達對心肌水腫的影響。方法采用主動脈縮窄法(TAC)建立小鼠心肌肥厚和水腫模型。實驗分為四組：①假手術(shù)組(Sham組)；②Sham+氯化汞(HgCl2)組，假手術(shù)后心肌注射0.3 mmol/L HgCl250 μl ；③手術(shù)組(TAC組)；④TAC+ HgCl2組，TAC術(shù)后心肌注射0.3 mmol/L HgCl250 μl。每組10只。術(shù)后2 w心臟超聲檢測各組小鼠心功能。計算各組小鼠心臟重量/體重比和心肌組織含水量。采用RT-PCR法檢測各組小鼠心肌組織中AQP1 mRNA表達。采用Western印跡法檢測各組小鼠心肌組織AQP1蛋白表達。結(jié)果TAC術(shù)后2 w，小鼠心肌組織發(fā)生明顯肥厚和水腫。同時，TAC小鼠心肌組織中AQP1 mRNA和蛋白的表達比Sham組顯著升高。心肌注射AQP1功能阻滯劑HgCl2可以降低TAC小鼠心臟重量/體重比和心肌組織含水量，改善TAC小鼠心功能。結(jié)論心肌組織中AQP1表達增加與TAC術(shù)后心肌水腫密切相關(guān)，阻滯AQP1功能可減輕心肌水腫，并改善心功能。

心肌肥厚；心肌水腫；水通道蛋白1；氯化汞

病理性心肌肥厚被公認(rèn)為心血管疾病的獨立危險因素〔1〕。心肌細(xì)胞水腫是心肌肥厚發(fā)展過程中最常見的病理生理改變，長期慢性水腫會進一步加重心臟功能紊亂〔2〕。因此，減輕心肌水腫對抑制心肌肥厚的進一步發(fā)生發(fā)展及改善心臟功能具有重要的臨床意義。水通道蛋白(AQP)1廣泛表達于多種細(xì)胞類型，包括內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞〔3，4〕。在心肌組織中，AQP1主要表達于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜及心肌細(xì)胞膜〔4，5〕。研究表明AQP1的表達與體外循環(huán)后心肌水腫發(fā)生密切相關(guān)〔6〕。但是，主動脈縮窄(TAC)導(dǎo)致的心肌水腫與AQP1的關(guān)聯(lián)尚未證實，另外，抑制AQP1的功能是否可以抑制心肌水腫和改善心臟功能也需要進一步的研究。本研究探討TAC術(shù)后AQP1的表達與心肌水腫的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1實驗材料 氯化汞(HgCl2，Sigma公司)，AQP1(Santa Cruz Biotechnology)。

1.2動物模型建立和分組 雄性C57BL/6小鼠40只，清潔級，體重20～25 g，8～10周齡，由南京醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供〔合格證號：SCXK(蘇) 2002-0031〕。采用TAC法制備動物模型。4%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，仰臥位固定小鼠，胸骨正中切口，分層打開縱隔腔，撥開胸腺，在心底部鈍性分離主動脈弓部，將鈍性27-G注射針頭(外徑0.4 mm)平行置于主動脈外壁，在頭臂干和左頸總動脈之間，用7-0手術(shù)絲線將針頭和主動脈弓一齊扎緊后將針頭移去，心肌注射0.3 mmol/L HgCl250 μl，關(guān)胸，術(shù)畢。假手術(shù)組(Sham組)采用相同處理，將7-0絲線置于主動脈弓相同位置不做結(jié)扎。術(shù)后小鼠常規(guī)喂養(yǎng)，于術(shù)后2 w心臟超聲檢測心功能后處死小鼠，取出心臟，計算心臟重量/體重比(HW/BW)，心臟標(biāo)本置于液氮速凍，然后保存于-80℃冰箱待用。實驗分為四組：①Sham組；②Sham+HgCl2組，假手術(shù)后心肌注射HgCl2；③手術(shù)組(TAC組)；④TAC+HgCl2組，TAC術(shù)后心肌注射HgCl2。每組10只。

1.3心臟超聲檢測 術(shù)后2 w，小鼠經(jīng)氣體麻醉后連接小動物超聲檢測設(shè)備，檢測心功能，取左室短軸觀、胸骨旁左室長軸觀，在二維影像指導(dǎo)下以M型超聲模式測量室間隔厚度(IVS)，左室后壁厚度(LVPW)，左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)，計算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)。

1.4心肌組織含水量測定(干濕法測定) 每組取4只小鼠，分別稱心臟濕重，置80℃烤箱內(nèi)48 h后稱干重，按以下公式計算心肌組織含水量：心肌組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5RNA提取和real-time RT-PCR 心肌組織中的總RNA用Trizol試劑提取。cDNA合成采用Takara公司PrimeScriptTM RT reagent 試劑盒說明書步驟進行，根據(jù)Takara公司SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書步驟建立real-time PCR反應(yīng)體系，在Eppendorf 公司Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀上檢測特異底物擴增情況。引物序列如下：AQP1正義鏈5′-TGCGTTCTGGCCACCACTGAC-3′，反義鏈5′-GATGTCGTCAGCATCCAGGTC-3′。 GAPDH正義鏈5′-CTGGAGAAACCTGCCAAGTA-3′，反義鏈5′-TGTTGCTGTAGCCGTATTCA-3′。相對基因表達采用2-△△CT法計算。

1.6Western印跡檢測 提取各組心肌組織總蛋白，進行蛋白定量后，樣品按比例加入5×SDS凝膠上樣緩沖液溶解，煮沸5 min。以20 μg蛋白進行上樣，電泳。300 mA恒流90 min將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；封閉液(1 g脫脂奶粉溶于20 ml PBST溶液)封閉1 h；一抗孵育(抗AQP1抗體1∶200；抗GAPDH抗體1∶5 000)4℃過夜。TBST清洗3次，每次10 min；二抗孵育(1∶2 000)，室溫1 h；TBST清洗3次，每次10 min；ECL發(fā)光液發(fā)光，Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)曝光、攝影、分析。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組心功能比較 TAC術(shù)后2 w IVSD和LVPWD較Sham組明顯增厚，LVEDD明顯下降(P<0.01)，表明TAC術(shù)后2 w心臟出現(xiàn)向心性肥厚，同時LVEF和LVFS較Sham組明顯下降(P<0.01)，但未降低到心力衰竭水平(LVEF<50%)，表明TAC術(shù)后2 w心功能處于代償期。Sham組小鼠心肌注射HgCl2對心功能無明顯影響。另外，TAC組小鼠心肌注射HgCl2對TAC誘導(dǎo)的心肌肥厚無明顯影響，但能提高TAC小鼠LVEF和LVFS(P<0.05)，改善TAC小鼠心功能。見圖1，表1。

圖1 各組心臟大體觀察

組別IVSD(mm)IVSS(mm)LVEDD(mm)LVESD(mm)LVPWD(mm)LVPWS(mm)LVEF(%)LVFS(%)Sham組0.721±0.0391.103±0.1153.294±0.1591.983±0.1550.772±0.1221.321±0.17275.72±3.84141.63±1.841Sham+HgCl2組0.733±0.0511.157±0.1053.233±0.1921.979±0.1130.792±0.0981.351±0.14374.38±3.33742.30±1.151TAC組1.022±0.0962)1.399±0.0932)3.088±0.1731)2.098±0.1981.129±0.1182)1.388±0.10955.80±2.1372)29.19±3.2212)TAC+HgCl2組1.006±0.1252)1.363±0.1562)3.072±0.2581)2.082±0.1031.114±0.1432)1.351±0.12262.57±3.3312)3)34.76±2.7712)3)

與Sham組比較1)P<0.05，2)P<0.01；與TAC組比較：3)P<0.05，下表同

2.2各組HW/BW及心肌含水量比較 TAC組術(shù)后2 w HW/BW較Sham組顯著上升(P<0.01)，TAC小鼠心肌注射HgCl2能在一定程度上降低HW/BW。但是，Sham組小鼠心肌注射HgCl2后HW/BW無明顯差異(P>0.05)。同時，TAC術(shù)后2 w小鼠心肌含水量比Sham組顯著增加，心肌注射HgCl2能在一定程度上降低TAC小鼠心肌含水量。但是，Sham組小鼠心肌注射HgCl2后心肌含水量并無明顯差異。見表2。

2.3各組心肌AQP1 mRNA和蛋白表達比較 見圖2,表3。

表2 各組小鼠HB/BW和心肌組織含水量

圖2 各組心肌AQP1蛋白表達比較

組別AQP1mRNAAQP1蛋白Sham組1.000±0.0000.219±0.027Sham+HgCl2組1.027±0.0650.228±0.024TAC組1.700±0.2001)0.424±0.0141)TAC+HgCl2組1.667±0.1151)0.425±0.0131)

TAC術(shù)后2 w小鼠心肌AQP1 mRNA和蛋白表達均比Sham組顯著增加(P<0.05)，但是，心肌注射HgCl2對TAC誘導(dǎo)的AQP1 mRNA和蛋白表達增加無明顯影響。另外，心肌注射HgCl2對Sham組小鼠心肌AQP1 mRNA和蛋白表達也無明顯影響(P>0.05)。

3 討 論

研究表明與心肌肥厚相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要集中在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，Ca2+及其依賴的信號通路和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路，并且相互關(guān)聯(lián)〔7～9〕。然而，心肌細(xì)胞水腫是心肌肥厚發(fā)展過程中最常見的病理生理改變，長期慢性水腫會進一步加重心臟功能失調(diào)〔2〕。AQPs是一種跨膜通道蛋白，可以促進水分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓力的平衡。在人類和小鼠的心肌組織中可以檢測到AQP-1，-4，-7和-11 mRNA表達，而相應(yīng)的蛋白水平只檢測到AQP1和AQP4的表達，Western印跡結(jié)果顯示在人類、大鼠及小鼠心肌組織中均有AQP1蛋白的表達〔10〕。在心肌組織中，AQP1主要表達于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜以及心肌細(xì)胞膜〔4，5〕。應(yīng)用AQPs基因敲除小鼠模型研究AQPs在心肌細(xì)胞水通透性中的作用，結(jié)果顯示AQP1敲除小鼠的心肌細(xì)胞水通透性下降，而不是AQP4敲除，說明在心肌細(xì)胞水通透性中起主要作用的是AQP1〔7〕。本研究說明小鼠TAC術(shù)后心肌水腫的發(fā)生與AQP1表達增高密切相關(guān)。雖然已有研究證實AQP1的高表達與心肌水腫的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔11〕，但是，AQP1是否可以作為心肌水腫的治療靶點尚待研究。綜上所述，心肌組織中AQP1表達增加與TAC后心肌水腫密切相關(guān)，阻滯AQP1功能可減輕心肌水腫，并改善心功能。因此，針對AQP1的靶向治療也許可以成為臨床上治療心肌水腫，抑制心肌肥厚進一步發(fā)展的新措施。

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〔2016-07-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R542.2

A

1005-9202(2017)19-4754-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.027

鹽城市衛(wèi)生局科技計劃項目(No.YK2012040)

韓扣蘭(1968-)，女，碩士，教授，主要從事心力衰竭、呼吸衰竭機制研究。

黃 誠(1983-)，男，講師，主治醫(yī)師，主要從事心力衰竭機制研究。