糖尿病腦病大鼠腦PET/CT顯像、胰島素樣生長因子受體及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4的表達(dá)

張 鐸 孟 姮

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院放射科，吉林 吉林 132011)

糖尿病腦病大鼠腦PET/CT顯像、胰島素樣生長因子受體及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4的表達(dá)

張 鐸 孟 姮

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院放射科，吉林 吉林 132011)

目的觀察糖尿病腦病大鼠腦PET/CT顯像、胰島素樣生長因子1型受體(IGF-1R)及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)4的表達(dá)。方法采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型，Morris 水迷宮試驗篩選糖尿病腦病大鼠模型，正常對照組，糖尿病組(排除腦病)，糖尿病腦病組各隨機選取8只，進行腦部PET/CT顯像、免疫組化法檢測腦組織IGF-1R及GLUT4表達(dá)。結(jié)果與正常對照組及糖尿病組比較，糖尿病腦病組大鼠標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUV)顯著降低(P<0.01)；IGF-1R表達(dá)顯著增高而GLUT4顯著下降(P<0.01)。結(jié)論糖尿病腦病大鼠腦組織IGF-1R異常高表達(dá)，擾亂了腦部糖代謝的相關(guān)通路。

糖尿病腦??；PET/CT；胰島素樣生長因子1型受體；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4

PET/CT是根據(jù)示蹤原理，利用正電子放射核素標(biāo)記的示蹤劑來探測正常和異常組織生理和生化改變。PET/CT在癲癇、老年性癡呆、帕金森病等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷、治療決策和療效評價等方面有重要意義。本研究利用PET/CT檢測糖尿病腦病大鼠模型腦部的糖代謝水平，并利用免疫組化方法檢測糖尿病腦病大鼠海馬區(qū)胰島素樣生長因子1型受體(IGF-1R)及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)4的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1一般資料 清潔級健康雄性Wistar大鼠，12周齡，體重200～250 g，購自吉林大學(xué)實驗動物中心。購回后飼養(yǎng)條件：室溫22℃～28℃，相對濕度40%～70%，每日12 h光照維持，晝夜循環(huán)，飼以蛋白質(zhì)含量為21%的標(biāo)準(zhǔn)飼料塊，自由飲水，分籠飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w確認(rèn)健康無病后用于實驗。

1.2主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素(STZ，美國 Sigma 公司)，18F-FDG注射液(吉林省硅谷醫(yī)院配制)，IGF-1R單克隆抗體、GLUT4單克隆抗體(英國Abcam公司),SABC免疫組化染色試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司),檸檬酸，檸檬酸鈉(天津化學(xué)試劑廠),PET/CT掃描儀(美國GE公司),LifeScan 血糖儀(美國強生),Morris水迷宮自動監(jiān)控儀(中國科學(xué)院技術(shù)研究所)。

1.3糖尿病大鼠模型的建立 50只Wistar雄性大鼠，隨機挑選10只為正常對照組，剩余40只為模型組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，禁食12 h，將 STZ 溶于檸檬酸鹽緩沖液(0.1 mmol/L，pH=4.6)制成 0.5%的溶液，按 65 mg/kg體重腹腔單次注射。3 d后尾靜脈采血，檢測大鼠空腹血糖(FPG)值，>16.7 mmol/L 視為糖尿病模型建立成功。共成模36只，未成模者剔除。糖尿病模型成模12 w后，采用Morris水迷宮實驗檢測糖尿病腦病模型是否建立成功。實驗期間大鼠均喂標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由覓水，此期間模型組死亡4只，考慮為血糖過高導(dǎo)致死亡。

1.4Morris水迷宮試驗篩選糖尿病腦病大鼠模型 成模后12 w后，PET/CT掃描前5 d開始試驗，前4 d為訓(xùn)練，每天上、下午各4次，每只大鼠每次訓(xùn)練2 min，將大鼠面向池壁隨機從4個入水點放入水中，記錄從入水到找到站臺所用的時間作為測試成績(逃避潛伏期)。如果大鼠在2 min內(nèi)未找到平臺，逃避潛伏期計為2 min，并由實驗者將其牽引至平臺上，停留30 s后，放回籠中休息30 min之后，開始下一次測試。第5天為測試期，記錄逃避潛伏期。逃避潛伏期同正常對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異者，視為糖尿病組(排除腦病)，成模21只；同正常對照組比較，逃避潛伏期明顯延長，且出現(xiàn)認(rèn)知功能減退的視為糖尿病腦病者，成模11只。正常對照組，糖尿病組，糖尿病腦病組各從中隨機選取8只，進行PET/CT的顯像及免疫組化研究。

1.5糖尿病腦病大鼠PET/CT顯像 根據(jù)大鼠體重注射造影劑18F-FDG 0.75 mCi/kg，注射30 min 后進行PET/CT顯像。顯像前采用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，10 min以后，達(dá)到麻醉效果，昏睡狀態(tài)，對手術(shù)刺激無明顯反應(yīng)，麻醉后仰臥固定。先采集CT定位像，電壓80 kV，電流30 mA，球管旋轉(zhuǎn)時間0.8 s，掃描層厚5 mm，重建層厚4.25 mm。隨即采集PET圖像，采集視野間的重疊數(shù)1，采集時間106 min。PET圖像經(jīng)OSEM重建，Xeleris工作站分別獲得CT、PET及兩者融合圖像，檢測大鼠腦部糖代謝情況。PET圖像均經(jīng)衰減校正處理。利用Xeleris圖像融合工作站調(diào)用PET/CT斷層圖像，獲得橫斷面數(shù)據(jù)，利用CT圖像準(zhǔn)確選取最大切面，在PET圖像上，應(yīng)用18F-FDG PET 檢測大鼠腦部葡萄糖代謝情況，利用感興趣區(qū)技術(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUV)。

1.6腦組織的處理及準(zhǔn)備 PET/CT顯像后，迅速剪開胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室進入升主動脈，同時剪開右心房，冰生理鹽水洗凈組織表面血液，冰盤上迅速斷頭取腦。取一側(cè)腦組織 4%多聚甲醛固定過夜，進行免疫組化染色。

1.7免疫組化檢測 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP法)，按試劑盒說明書檢測IGF-IR及GLUT4的表達(dá)。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析，t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 實驗過程中，糖尿病組大鼠出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿及體重下降，色暗黃，后期精神較差，行動遲緩的癥狀。糖尿病腦病組除出現(xiàn)上述糖尿病組情況外，精神狀態(tài)更差，行動更加遲緩。第13周時，同正常對照組比較，糖尿病組和糖尿病腦病組體重明顯降低(P<0.01)，血糖值均明顯升高(P<0.01)，見表1。

2.2行為學(xué)測試結(jié)果 第1天各組大鼠逃避潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，從第2～5天各組出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01或P<0.05)。同正常對照組相比，糖尿病組第4，5天逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，糖尿病腦病組第2天開始逃避潛伏期就明顯延長(P<0.05,P<0.01)，與糖尿病組比較；糖尿病腦病組第4、5天逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)。見表2。

2.3糖尿病腦病大鼠PET/CT顯像 與正常對照組SUA(3.62±0.30)相比，糖尿病組大鼠SUV值降低趨勢極為顯著(2.11±0.25，P<0.01)；而糖尿病腦病組大鼠SUV具有同樣趨勢且更為顯著(0.31±0.03，P<0.01)；糖尿病組與糖尿病腦病模型組比較SUV值也有顯著差異(P<0.01)；說明與正常對照組比較，糖尿病大鼠葡萄糖代謝率明顯下降，而糖尿病腦病大鼠葡萄糖代謝率下降更為明顯。見圖1。

表1 各組大鼠血糖、體重比較

與正常對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與糖尿病組比較：3)P<0.05,4)P<0.01；下表同

表2 各組大鼠在 Morris 水迷宮中到達(dá)平臺的平均潛伏期比較

圖1 各組大鼠PET/CT腦部糖代謝檢測

2.4免疫組化檢測 同正常對照組相比，糖尿病腦病組IGF-1R含量明顯增多，而糖尿病組IGF-1R含量少于正常對照組。見圖2。同正常對照組相比，糖尿病腦病組GLUT4含量明顯減少，而糖尿病組GLUT4含量明顯增多。見圖3。

圖2 各組大鼠腦組織IGF-1R的表達(dá)(DAB，×40)

圖3 各組GLUT4的表達(dá)(DAB，×40)

3 討 論

由于Wistar大鼠具有多樣的行為表現(xiàn)，靈敏的情緒反應(yīng)，適應(yīng)能力強，探索性強，神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)方面與人有相似性等特點，故被廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)和記憶能力等行為學(xué)測試研究〔1，2〕。對于STZ的劑量，50～70 mg/kg體重均有使用，國內(nèi)外報道并不一致〔3～5〕。本實驗選用65 mg/kg，成模率較高。

PET/CT是目前臨床應(yīng)用最廣泛的分子影像學(xué)檢測方法之一，不僅可以清晰地顯示出軀體或器官的解剖結(jié)構(gòu)，而且還可以精細(xì)地描繪出機體分子水平上的生理病理和生物代謝過程〔6〕。PET/CT 目前在臨床上主要應(yīng)用在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤和心血管系統(tǒng)疾病等〔7〕。PET/CT具有極高的敏感度，在糖尿病腦病出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變之前，即可發(fā)現(xiàn)其功能性改變，確定局部腦葡萄糖代謝率及腦功能狀態(tài)異常，對于早期發(fā)現(xiàn)和診斷糖尿病腦病具有較大的價值。

胰島素受體(IR)位于細(xì)胞膜上，為四聚體結(jié)構(gòu)，包括兩條α鏈、兩條β鏈及中間的二硫鍵。靶細(xì)胞膜上IR的α亞基與胰島素相結(jié)合，引起IR的構(gòu)象改變，α亞基對β亞基抑制去除，使β亞基上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化反應(yīng)，導(dǎo)致下游的信號蛋白被依次激活，從而促使GLUT4移位，介導(dǎo)葡萄糖由外向內(nèi)轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量代謝。IR在腦內(nèi)的分布非常廣泛，海馬、嗅球、下丘腦等與學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知功能相關(guān)的大腦區(qū)域表達(dá)豐富〔8〕。中樞神經(jīng)系統(tǒng)胰島素/胰島素受體信號系統(tǒng)的正常運行是維持大腦血液運行和能量代謝正常進行的關(guān)鍵因素〔9〕，如該系統(tǒng)發(fā)生障礙，則易出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙及一系列病理生理改變。

研究表明，GLUT4在腦內(nèi)亦是選擇性表達(dá)的，例如在大鼠海馬、感覺運動區(qū)皮層、垂體后葉和下丘腦中均可見表達(dá)，尤其在海馬組織中表達(dá)量豐富〔10～12〕，其在腦內(nèi)的選擇性表達(dá)可能與胰島素刺激這些腦區(qū)對葡萄糖的攝取有關(guān)。葡萄糖是哺乳類動物大腦能量代謝的主要原料〔13〕，因其親水的特性，它不能通過脂質(zhì)雙層，但葡萄糖通過細(xì)胞膜是細(xì)胞產(chǎn)生能量的前提基礎(chǔ)，這一過程主要是通過GLUT4介導(dǎo)完成的〔14〕。GLUT4在腦組織能量代謝過程中的作用則顯得更為重要，其表達(dá)水平能反映腦組織細(xì)胞對葡萄糖的需求程度〔15〕。本實驗結(jié)果顯示，IGF-1R與GLUT4在糖尿病腦病的發(fā)生發(fā)展過程中起著更為重要的作用。

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〔2016-02-04修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R589

A

1005-9202(2017)19-4747-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.024

教育部博士基金項目(No.200801830071)

孟 姮(1968-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)影像學(xué)研究。

張 鐸(1970-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)影像學(xué)研究。