辛伐他汀對COPD大鼠肺組織血紅素氧化酶-1及炎性因子表達的影響

朱 勇 趙華棟 魏東陽 崔建嬌

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 錦州 121000)

辛伐他汀對COPD大鼠肺組織血紅素氧化酶-1及炎性因子表達的影響

朱 勇 趙華棟 魏東陽 崔建嬌1

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 錦州 121000)

目的探討辛伐他汀對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺組織血紅素氧化酶(HO)-1表達的影響。方法24只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為3組，每組8只。對照組：第1、15天氣管內(nèi)滴入生理鹽水0.2 ml，其余時間正常喂養(yǎng)；煙霧暴露組：第1、15天氣管內(nèi)滴入脂多糖0.2 ml，將8只大鼠放進大鼠吸煙裝置染毒箱內(nèi)COPD建模；辛伐他汀組：建立COPD模型方法同上，每次熏煙結(jié)束后，給予辛伐他汀灌胃治療(5 mg/kg)，置于相同的環(huán)境中喂養(yǎng)。右心導(dǎo)管測定大鼠平均肺動脈壓(mPAP)，以右心室肥厚指數(shù)(RVHI)作為評價右心室肥厚的指標(biāo)。蘇木精-伊紅(HE)染色檢測大鼠肺組織病理學(xué)變化。實時定量PCR(RT-PCR)方法測定肺組織HO-1 mRNA的表達，通過Western印跡及免疫組織化學(xué)方法檢測肺組織HO-1蛋白的表達。酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平。結(jié)果辛伐他汀組mPAP較煙霧暴露組下降，煙霧暴露組較對照組升高(P<0.05)。辛伐他汀組RVHI較煙霧暴露組下降(P<0.05)。辛伐他汀組鏡下觀察氣管壁增厚，管腔變窄且肺動脈壁增厚，但是較煙霧暴露組減輕。免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果顯示，辛伐他汀組肺動脈平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞膜上出現(xiàn)的棕黃色顆粒最多。辛伐他汀組HO-1 mRNA是對照組的(7.26±2.11)倍。煙霧暴露組大鼠HO-1表達增強，辛伐他汀治療后表達進一步增強。在BALF中，IL-6和TNF-α在辛伐他汀組、煙霧暴露組較對照組表達增加(P<0.05)。辛伐他汀組、煙霧暴露組均較對照組血清IL-6表達增加(P<0.05)，TNF-α 在辛伐他汀組、煙霧暴露組較對照組表達增加(P<0.05)，辛伐他汀組中TNF-α表達量較煙霧暴露組降低(P<0.05)。結(jié)論辛伐他汀能夠促進COPD表達HO-1，減輕COPD炎癥反應(yīng)，改善COPD的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后。

慢性阻塞性肺疾??；吸煙；血紅素氧合酶-1；辛伐他汀

血紅素氧化酶(HO)-1具有抗感染、抗氧化損傷等生理功能〔1〕，是一種保護性和適應(yīng)傷害性刺激反應(yīng)，常表達于肺、心等器官組織〔2〕，基因表達的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平〔3〕。慢性阻塞性肺疾病(COPD)具有高致殘率和病死率，降脂類藥物辛伐他汀能夠減少心血管疾病的病死率和發(fā)病率〔4〕，但對呼吸系統(tǒng)的影響尚無定論。HO-1是誘導(dǎo)酶，可受多種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生，在肺內(nèi)被應(yīng)激因素刺激后表達。本研究通過煙熏法復(fù)制COPD模型，觀察辛伐他汀對COPD大鼠肺功能的影響及HO-1在COPD中發(fā)揮的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料 辛伐他汀(常州九天醫(yī)藥公司，生產(chǎn)批號：20070901)；哈德門牌香煙(山東中煙工業(yè)公司，標(biāo)示：焦油含量13 mg，煙堿量為1.2 mg，煙氣一氧化碳量為15 mg)；HO-1免疫組化測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司，中國)；大鼠吸煙裝置(JY-01型)(石家莊綿陽科技開發(fā)有限公司，中國)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國)；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒96T，大鼠白細胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒96T(南京建成賽浩科技有限公司，中國)。健康雄性SD大鼠24只(中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號1501003)，體重(100±9)g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級飼養(yǎng)，飼料和水嚴格滅菌。

1.2方法

1.2.1分組與模型制作 大鼠經(jīng)1 w適應(yīng)喂養(yǎng)后，24只大鼠按隨機數(shù)字表法分為3組，每組8只。對照組：第1、15天氣管內(nèi)滴入生理鹽水0.2 ml，其余時間正常喂養(yǎng)；煙霧暴露組：第1、15天氣管內(nèi)滴入脂多糖0.2 ml，將8只大鼠放進大鼠吸煙裝置染毒箱內(nèi)，箱上端有兩個(1.5 cm×1.5 cm)小孔與外界相通，防止動物缺氧，香煙去掉過濾嘴后插入染毒箱中點燃，關(guān)閉染毒箱，1 h后取出大鼠，休息12 h后再重復(fù)以上操作1次，連續(xù)熏煙5 w，每次熏煙結(jié)束后，將煙霧暴露組置于和對照組相同的環(huán)境中喂養(yǎng)飼料。辛伐他汀組：建立煙霧暴露組COPD模型方法同上，每次熏煙結(jié)束后，給予辛伐他汀灌胃治療(5 mg/kg)，置于相同的環(huán)境中喂養(yǎng)。

1.2.2平均肺動脈壓(mPAP)、右心室肥厚指數(shù)測定(RVHI)與血清、支氣管肺泡灌洗液采集 實驗第5周，熏煙結(jié)束后，首先將各組大鼠用天平稱重，然后利用腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，后仰臥位固定，分離腹主動脈，抽取動脈血3 ml，于2 000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存。將0.9 mm的聚苯乙烯管進入右心房、右心室(RV)、肺動脈，利用壓力換能器與多導(dǎo)生理記錄儀測定mPAP。mPAP測定結(jié)束后，通過股動脈緩慢放血處死大鼠，開胸暴露肺和心臟，對大鼠肺部結(jié)扎右主支氣管，于隆突上用套管針穿刺至左肺，然后用2 ml生理鹽水進行灌洗3次，回收率約為80%，支氣管肺泡灌洗液(BALF)4℃ 1 000 r/min 離心10 min，上清液-20℃保存，沉淀用0.5 ml生理鹽水混勻后編號待檢。進行瘀血清理和沖洗后，完整的取下大鼠心臟，沿室間隔分離RV、左心室加室間隔(LV+S)，分別稱重，以RV/(LV+S)的質(zhì)量比(RVHI)作為評價右心室肥厚的指標(biāo)。利用生理鹽水進行肺血管沖洗，以無菌棉簽分出各個肺葉，肺葉用生理鹽水沖洗后放入冷凍管置于液氮中儲存處理及另一個肺葉放入裝有甲醛的廣口瓶中。

1.2.3大鼠肺組織蘇木精-伊紅(HE)染色 10%中性甲醛固定大鼠肺組織72 h，脫水、石蠟包埋連續(xù)切片，脫蠟至水，蒸餾水浸泡后，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分色浸泡，伊紅溶液染色，乙醇脫色，二甲苯透明。應(yīng)用中性樹膠封片，置于玻片架上自然烘干，置于顯微鏡圖像處理系統(tǒng)(中國醫(yī)科大學(xué)BHEC)下觀察，應(yīng)用顯微鏡(日本Olympus)采集圖片。

1.2.4采用免疫組化方法檢測大鼠肺組織中HO-1蛋白的表達 多聚-L-賴氨酸溶液內(nèi)浸泡處理載玻片，干后存放于干燥避光的條件下備用。取固定48 h的肺葉，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，經(jīng)過脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，3% H2O237℃孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min，然后進行抗原修復(fù)，置0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)中煮沸(95℃，15 min)，自然冷卻20 min以上，冷卻至室溫，PBS沖洗5 min。滴加山羊血清后于37℃恒溫箱中放置40 min。滴加一抗(兔抗人lgG，北京達科為生物科技有限公司)，置于4℃冰箱中過夜。加入生物素化二抗，置于37℃恒溫箱中30 min。DAB溶液滴加顯色，蘇木素復(fù)染。脫水、透明，并用中性樹膠封片。以上洗片用PBS緩沖液中浸洗5 min/次，共3次。顯微鏡下觀測。判斷標(biāo)準(zhǔn)：參與表達的平滑肌細胞胞膜上呈現(xiàn)出棕黃色顆粒，表達和顏色呈正比；而平滑肌細胞膜上無棕黃色顆粒出現(xiàn)，則說明表達為陰性。

1.2.5HO-1 mRNA在大鼠肺組織中的表達 利用消毒的陶瓷研磨器加液氮研磨取大鼠肺組織100 mg，粉末狀后收集到滅菌的EP管中，向其中加入1 ml Trizol裂解液。按照Trizol試劑說明書提取組織的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,進行熒光定量 PCR。HO-1 mRNA引物序列：HO-1上游引物：5′-TGT CCC AGG ATT TGT CCG AG-3′，下游引物： 5′-ACT GGG TTC TGC TTG TTT CGC T-3′，產(chǎn)物長度：118 bp；β-actin上游引物：5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′,下游引物：5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′，產(chǎn)物長度：153 bp。采用Trizol一步抽提法提取總RNA，20 μl體系中進行逆轉(zhuǎn)錄，25 μl體系中進行擴增。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃ 5 s,60℃退火20 s,72℃延伸60 s。HO-1和β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計合成。取23 μl的反應(yīng)體系和相對應(yīng)的cDNA，按順序放入到熒光定量PCR檢測分析儀(ABI 7700，美國)中，進行熒光定量分析。以β-actin作為內(nèi)參計算HO-1 mRNA的表達量，以2-△△CT表示。實驗3個平行孔。

1.2.6Western印跡檢測大鼠肺組織HO-1的表達 取出液氮中保存的大鼠肺組織，4℃解凍后組織勻漿；按勻漿后組織體積∶裂解液的比例為1∶5加入裂解液，加入蛋白酶抑制劑PMSF和磷酸酶抑制劑；按照二喹啉甲醛(BCA)試劑盒說明書求測定蛋白液濃度，以總蛋白質(zhì)量為50 μg計算所需蛋白樣本體積及10 μl上樣體系中待補充的PBS和5倍蛋白上樣緩沖液，配置好的蛋白上樣體系在100℃下加熱5 min；通過十二烷基硫酸鈉-聚兩烯酰胺凝膠(SDS-PAGE，分離膠10%、濃縮膠5%)分離蛋白，分離膠電壓80 V，濃縮膠120 V；轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙衡(PVDF)膜(millipore公司)，電壓100 V 60 min；用Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗膜3次×10 min，然后加入封閉液(含5%胎牛血清的TBST液)中，37℃封閉60 min；加一抗，兔抗鼠多克隆HO-1(1∶100)，4℃搖晃過夜。次日TBST洗膜3次×10 min，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000)，37℃孵育90 min。取出膜后，TBST洗膜3次×10 min，ECL plus化學(xué)發(fā)光顯色(賽默飛，美國)，天能發(fā)光系統(tǒng)TIF保存文件，Image-J圖像軟件系統(tǒng)分析。內(nèi)參選用β-actin。

1.2.7檢測BALF和血清IL-6、TNF-α水平及BALF中的白細胞數(shù) 本實驗采用大鼠TNF-α ELISA試劑盒96T，大鼠IL-6 ELISA試劑盒96T測定血清、BALF中 IL-6、TNF-α水平，提前40 min將試劑盒從4℃冰箱中取出，置于室溫下(約14℃)，血清、BALF標(biāo)本從-20℃冰箱中取出室溫下融化。各步驟嚴格按照試劑使用說明書進行操作，酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)(Thermo Scientific，美國)。取與生理鹽水混勻后的BALF沉淀，置于血球計數(shù)儀(Thermo Scientific，美國)計數(shù)BALF中白細胞數(shù)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠基本指標(biāo)比較 在煙霧暴露實驗前三組〔對照組(108.0±9.0)g，煙霧暴露組(108.0±8.0)g，辛伐他汀組(113.0±6.0)g〕大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；煙霧暴露實驗結(jié)束后，辛伐他汀組大鼠體重〔(447.0±15.0)g〕低于對照組〔(491.0±11.0)g，P<0.05〕，煙霧暴露組〔(447.0±15.0)g〕也低于對照組(P<0.05)。辛伐他汀組大鼠mPAP〔(22.24±0.80)mmHg〕高于對照組〔(15.21±1.00)mmHg，P<0.05〕，煙霧暴露組〔(29.44±1.00)mmHg〕也高于對照組(P<0.05)。辛伐他汀組大鼠RVHI(0.24±0.04)高于對照組(0.22±0.04)(P<0.05)，煙霧暴露組(0.29±0.05)也高于對照組(P<0.05)。

2.23組大鼠肺組織HE染色 對照組肺泡及氣管壁輪廓清晰，肺動脈壁未見增厚。煙霧暴露組肺泡擴張，炎癥浸潤，血管壁增厚，氣管壁較對照組增厚，管腔變窄，并且肺動脈壁增厚。辛伐他汀組血管狹窄減輕，肺泡擴張降低，氣管壁增厚，管腔變窄，并且肺動脈壁增厚，但是較煙霧暴露組減輕。見圖1。

圖1 3組大鼠肺組織的病理變化(HE，×400)

2.33組大鼠肺組織中HO-1的表達 辛伐他汀組肺動脈平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞膜上出現(xiàn)的棕黃色顆粒最多，煙霧暴露組比對照組多。見圖2。

2.43組大鼠肺組織中HO-1 mRNA表達 辛伐他汀組HO-1 mRNA(7.26±2.11)高于煙霧暴露組(2.02±1.66，P<0.05)，煙霧暴露組表達高于對照組(1.00±0.00，P<0.05)。

2.5Western印跡檢測大鼠肺組織中的HO-1 煙霧暴露組大鼠肺組織中HO-1蛋白表達較對照組增加，辛伐他汀治療后表達明顯增加。見圖3。

圖2 3組大鼠肺組織中HO-1的表達(IHC，×400)

圖3 Western印跡檢測HO-1在COPD大鼠肺組織的表達

2.6BALF和血清中IL-6、TNF-α水平及BALF中的白細胞數(shù) 在BALF中，辛伐他汀組、煙霧暴露組IL-6和TNF-α水平較對照組表達增加(P<0.05)。辛伐他汀組、煙霧暴露組血清中IL-6、TNF-α水平均高于對照組(P<0.05)，辛伐他汀組TNF-α表達量低于煙霧暴露組(P<0.05)。辛伐他汀組BALF中白細胞數(shù)為(0.86±0.23)×109/L，與對照組〔(0.65±0.38)×109/L〕比較差異顯著(P<0.05)，煙霧暴露組〔(3.03±1.38)×109/L〕較對照組明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 BALF和血清中IL-6、TNF-α的水平

3 討 論

COPD主要由遺傳因素、氣道高反應(yīng)等個體易感因素和吸煙、空氣污染等環(huán)境因素導(dǎo)致，其中吸煙為最主要的環(huán)境致病因素〔4〕。目前COPD常規(guī)治療中激素類藥物的使用可以緩解患者慢性炎癥反應(yīng)，但是全身性激素應(yīng)用的嚴重副作用及吸入性激素使用的局限性導(dǎo)致其治療效果有限〔5〕。研究顯示，他汀類藥物在除調(diào)脂作用外，還有抗氧化和抗感染等功效〔6〕。

本研究結(jié)果顯示煙霧暴露組mPAP、RVHI明顯高于對照組，肺動脈壁增厚，應(yīng)用辛伐他汀組的mPAP、RVHI明顯下降，肺動脈壁增厚減輕，這是由于他汀類藥物是通過抑制異戊二烯類的合成，增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶合成，減少其滅活。研究顯示，適量的HO-1在COPD中發(fā)揮保護作用〔7〕，其在發(fā)熱、應(yīng)激等狀態(tài)刺激下，使內(nèi)源性一氧化碳產(chǎn)量升高，提高了機體的應(yīng)激能力。本研究發(fā)現(xiàn)，從煙霧暴露組開始，辛伐他汀組的肺動脈平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞膜上出現(xiàn)的棕黃色顆粒增加最為明顯，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀組HO-1的表達多于煙霧暴露組。HO-1 mRNA在煙霧暴露組較對照組表達增高，而辛伐他汀組HO-1 mRNA更高。推測可能是因為在煙霧暴露組COPD模型中，經(jīng)過煙霧及脂多糖等外界因素的刺激，發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，出于機體自身的免疫機制，HO-1開始增多，最后產(chǎn)生適應(yīng)性和保護性的反應(yīng)，在辛伐他汀組，HO-1升高更加明顯，可能是因為HO-1途徑是辛伐他汀產(chǎn)生作用的關(guān)鍵通道，發(fā)揮自身抗炎癥、抗增殖等作用，從而對COPD產(chǎn)生治療作用〔8〕。

COPD的主要發(fā)病機制之一是肺及全身慢性炎癥反應(yīng)，本研究推測辛伐他汀對于COPD還具有抗感染作用，能夠減輕COPD大鼠全身炎癥反應(yīng)。TNF-α具有較強的抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及炎癥誘導(dǎo)作用。IL-6主要由單核-巨噬細胞分泌，具有多種活性的炎癥細胞因子，能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)的功能，但在病理狀態(tài)下，其水平的增高可以引起一系列的病理損傷。本研究結(jié)果說明起到了有效地抗感染作用。Loukides等〔9〕研究表明，降低全身炎癥程度能改善COPD自然進程及預(yù)后，同本研究結(jié)果一致。

1穆 珺,莊曉明.血清血紅素氧化酶-1水平與糖調(diào)節(jié)受損及其動脈粥樣硬化的相關(guān)性研究〔J〕.中國糖尿病雜志,2015;23(10):881-4.

2Lee SE,Yang H,Son GW,etal.Crotonaldehyde-exposed macrophages induce heme oxygenase-1 expression as an adaptive mechanism〔J〕.Mol Cell Toxicol,2015;11(2):167-74.

3Lim HS,Jin S,Yun SJ,etal.Modulation of melanogenesis by heme oxygenase-1 via p53 in normal human melanocytes〔J〕.Chonnam Med J,2016;52(1):45-52.

4陳婉華,周偉成,黃錦倫,等.辛伐他汀聯(lián)合運動訓(xùn)練治療COPD穩(wěn)定期合并代謝綜合征患者的臨床研究〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2016;16(23):4508-11.

5Matera MG,Cardaci V,Cazzola M,etal.Safety of inhaled corticosteroids for treating chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Exp Opin Drug Saf,2015;14(4):533-41.

6Keskiv?li T,Kujala P,Visakorpi T,etal.Statin use and risk of disease recurrence and death after radical prostatectomy〔J〕.Prostate,2016;76(5):469-78.

7徐 冰,張一兵.慢性阻塞性肺病大鼠血紅素加氧酶-1表達及其臨床意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2015;35(9):2353-5.

8Zhao W,Song H,Huo W.Long-term administration of simvastatin reduces ventilator-induced lung injury and upregulates heme oxygenase 1 expression in a rat model〔J〕.J Surg Res,2015;199(2):601-7.

9Loukides S,Bartziokas K,Vestbo J,etal.Novel anti-inflammatory agents in COPD:targeting lung and systemic inflammation〔J〕.Curr Drug Targets,2013;14(2):235-45.

〔2017-03-26修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R692

A

1005-9202(2017)19-4742-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.022

遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項目(No.2015020355)

1 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心

崔建嬌(1972-)，女，碩士，副主任檢驗師，主要從事臨床檢驗研究。

朱 勇(1971-)，男，碩士生導(dǎo)師，副主任醫(yī)師，主要從事重癥醫(yī)學(xué)研究。