miR-125b對急性白血病細胞HL-60增殖與凋亡的影響及相關(guān)機制

羅 偉 冀林華 耿 惠 馬曉靜 馬 婕 尹啟超 劉 媛 崔 森

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，青海 西寧 810001)

miR-125b對急性白血病細胞HL-60增殖與凋亡的影響及相關(guān)機制

羅 偉 冀林華 耿 惠 馬曉靜 馬 婕 尹啟超 劉 媛 崔 森

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，青海 西寧 810001)

目的探討miR-125b對急性白血病(AL)細胞人早幼粒白血病細胞(HL)-60增殖與凋亡的影響及相關(guān)機制。方法利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將miR-125b inhibitor，miR-125b NC轉(zhuǎn)入白血病細胞HL-60中，RT-PCR法檢測miR-125b表達，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞活力，流式細胞術(shù)分別檢測細胞凋亡及細胞周期變化，Western印跡檢測細胞中細胞周期蛋白(Cyclin)A1，CyclinD1，Bax，Bcl-2蛋白表達及細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)磷酸化水平。結(jié)果與miR-125b NC比較，miR-125b inhibitor組miR-125b inhibitor表達下調(diào)，細胞活力降低，細胞凋亡率提高，細胞周期阻滯在G1期，CyclinA1，Bcl-2及p-ERK表達下調(diào)，CyclinD1及Bax表達上調(diào)(均P<0.01)。結(jié)論miR-125b inhibitor能顯著抑制白血病細胞HL-60增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，可能與下調(diào)ERK磷酸化水平有關(guān)。

miR-125b；白血?。籋L-60；增殖；凋亡

急性白血病(AL)是一種因為造血干細胞惡性克隆，骨髓中原始細胞和幼稚細胞異常增殖并使正常造血功能受抑制的惡性血液腫瘤〔1〕。AL根據(jù)受累的細胞系可分為急性髓系細胞白血病(AML)和急性淋巴細胞白血病(AML)，前者約占AL的80%～90%。miRNA是一類高度保守的長度約21～23 nt的非編碼小RNA分子，能夠靶向結(jié)合于靶基因的mRNA 3′非翻譯區(qū)，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或降解靶基因，進而調(diào)控下游基因的表達，參與機體發(fā)育、免疫調(diào)控、腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔2〕。研究表明miR-125b在AML患者中高表達，治療后表達降低，復(fù)發(fā)后表達又升高，且同時過表達miR-125b能促使白血病細胞急性早幼粒細胞白血病細胞株(NB4)及人早幼粒白血病細胞(HL-60)過度增殖，反義寡核苷酸干擾miR-125b表達能有效抑制白細胞增殖〔3～5〕，但具體作用未知。本研究將進一步探討miR-125b對白血病細胞HL-60增殖與凋亡的影響及相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1試劑與儀器 兔抗人CyclinA1、CyclinD1、Bax、Bcl-2、GAPDH單克隆抗體均購自美國Cell Signal Technology公司；兔抗人細胞蛋白調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2，p-ERK1/2多克隆抗體均購自美國Abcam公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒均購自南通碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒，細胞周期檢測試劑盒均南京凱基生物技術(shù)有限公司；trizol試劑盒，一步法RT-PCR試劑盒，LipofectamineTM2000均購自美國Invitrogen公司；miR-125b inhibitor，miR-125b NC均購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；DYCZ-25D型雙垂直電泳儀，DYCZ-25D型轉(zhuǎn)印電泳儀均購自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.2細胞株 L-60購于中國科學(xué)院細胞庫，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基來培養(yǎng)，細胞每隔2 d左右以1∶3的比例進行傳代，并選取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)的實驗研究。

1.3RT-PCR檢測細胞中miR-125b的表達 當(dāng)HL-60細胞生長達到50%左右，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將miR-125b inhibitor及miR-125b NC轉(zhuǎn)染到HL-60細胞中，6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，利用胰蛋白酶消化細胞，再根據(jù)Trizol試劑盒提取細胞總的RNA，并檢測總RNA純度，通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并將cDNA進行擴增，最后用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。miR-125b上游引物：5′-CGGGATCCCCAGATACTGCGTATGTGTG-3′，下游引物：5′-CCGCTCGAGG TCACCTGATCCCATCTAAC-3′，GAPDH上游引物：5′-AGCCACA TCGCTCAGACA-3′，下游引物：5′-TGGACTCCACGACGTACT-3′。

1.4MTT法檢測HL-60細胞活力 將HL-60細胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將miR-125b inhibitor及miR-125b NC轉(zhuǎn)染到HL-60細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入20 μl的MTT(終濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將96孔板中的上清液小心吸取并舍棄，再加入150 μl二甲基亞砜，震蕩使結(jié)晶物溶解，于酶標(biāo)儀波長560 nm處測OD值，細胞凋亡率=(miR-125b inhibitor組OD值-空白組OD值)/(miR-125b NC組OD值-空白組OD值)×100%。

1.5Annexin V-FITC/PI法檢測HL-60細胞凋亡情況 將HL-60細胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將miR-125b inhibitor及miR-125b NC轉(zhuǎn)染到HL-60細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，miR-125b inhibitor組及miR-125b NC組分別收集1×105/ml個細胞，再將500 μl的結(jié)合緩沖液加入細胞中并吹打混勻后，接著將5 μl的Annexin V-FITC及5 μl的PI按順序加入已混合均勻的細胞中，繼續(xù)吹打混勻，并在室溫條件下避光孵育10 min，于1 h內(nèi)在流式細胞儀上進行細胞凋亡分析。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞周期 miR-125b inhibitor組及miR-125b NC組分別收集1×105/ml個細胞，再加入5 μl的Rnase(終濃度為10 mg/ml)，吹打混勻后，在37℃條件下孵育1 h，再次加入PI染液，吹打混勻并于室溫避光孵育30 min，于1 h內(nèi)在流式細胞儀進行細胞周期檢測分析。

1.7Western印跡檢測細胞中CyclinA1，CyclinD1，Bax，Bcl-2及p-ERK蛋白的表達 HL-60細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染同1.5，在冰浴條件下將6孔板中細胞刮下來，離心收集細胞，并加入細胞裂解液，裂解30 min，離心獲得的上清液即是總蛋白。接著利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白煮沸10 min進行變性，取約30 ng的蛋白樣品上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗人CyclinA1、CyclinD1、Bax、Bcl-2、GAPDH單克隆抗體，稀釋度1∶100；兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2多克隆抗，稀釋度為1∶200)孵育，4℃過夜；二抗溶液〔辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)〕室溫孵育1～2 h。于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件統(tǒng)計各抗體條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染的驗證 miR-125b NC及miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染HL-60細胞48 h后，經(jīng)RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，miR-125b inhibitor組中miR-125b表達量(0.18±0.02)顯著低于miR-125b NC組(0.96±0.09)(P<0.01)，說明miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染成功。見圖1。

圖1 miR-125b轉(zhuǎn)染的驗證

2.2miR-125b inhibitor對HL-60細胞活力的影響 miR-125b NC及miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染HL-60細胞24、48、72、96 h后，經(jīng)MTT實驗發(fā)現(xiàn)，HL-60細胞活力均顯著降低(P<0.01)，且在48 h細胞活力適于后續(xù)實驗研究，因此選擇48 h作為后續(xù)細胞轉(zhuǎn)染時間。見表1。

表1 miR-125b inhibitor對HL-60細胞的抑制率

與miR-125b NC組比較：1)P<0.01,下表同

2.3miR-125b inhibitor對HL-60細胞凋亡及細胞周期的影響 miR-125b NC及miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染HL-60細胞48 h后，經(jīng)流式細胞術(shù)實驗發(fā)現(xiàn)，miR-125b inhibitor組細胞凋亡率顯著高于miR-125b NC組(P<0.01)；細胞周期G1期明顯比miR-125b NC組延長，說明miR-125b inhibitor使HL-60細胞周期阻滯在G1期。見表2。

2.4miR-125b inhibitor對HL-60細胞中細胞周期及細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 miR-125b NC及miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染HL-60細胞48 h后，經(jīng)Western印跡實驗發(fā)現(xiàn)，與miR-125b NC組比較，miR-125b inhibitor組CyclinA1、Bcl-2表達量下調(diào)，Bax及CyclinD1表達量上調(diào)(均P<0.01)。見圖2，表3。

2.5miR-125b inhibitor對HL-60細胞中(p-ERK)水平的影響 miR-125b NC及miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染HL-60細胞48 h后，經(jīng)Western印跡實驗發(fā)現(xiàn)，miR-125b inhibitor組中p-ERK表達量(0.18±0.02)顯著低于miR-125b NC組(0.49±0.05)(P<0.01)。見圖3。

表2 miR-125b inhibitor對HL-60細胞凋亡及細胞周期的影響

表3 miR-125b inhibitor對HL-60細胞中細胞周期及細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

圖2 miR-125b inhibitor對HL-60細胞中細胞周期及細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

圖3 miR-125b inhibitor對HL-60細胞p-ERK水平的影響

3 討 論

miR-125b是秀麗線蟲Line-4的同源基因，有兩個前體成員，分別為miR-125b-1和miR-125b-2，且研究顯示AML中主要的成熟miR-125b來源于miR-125b-1，另外miR-125b-1位于人類染色體11號的脆性區(qū)域，提示miR-125b在AML發(fā)生中發(fā)揮著重要作用〔6〕。而且Bousquet等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)AML中miR-125b表達異常，且高表達的miR-125b能通過增加小鼠外周血液中白細胞的數(shù)量來直接誘導(dǎo)白血病的發(fā)生。王麗娜等〔4〕研究表明兒童急性早幼粒細胞白血病患者中miR-125b高表達，緩解后降低，復(fù)發(fā)后又升高。謝晶晶等〔3〕研究也表明在兒童AML患者中miR-125b高表達。上述研究充分說明了miR-125b在AML中起著癌基因的作用，且又有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-125b能促使白血病細胞NB4及HL-60過度增殖，反義寡核苷酸干擾miR-125b表達能有效抑制白細胞增殖〔4，5〕。但是具體的作用機制未知。本研究結(jié)果表明miR-125b inhibitor能顯著降低HL-60細胞活力，并誘導(dǎo)細胞凋亡，與劉曉丹等〔5〕研究一致。而腫瘤細胞的凋亡受限來源于細胞的惡性克隆，細胞周期的不可控制，因此調(diào)控細胞周期點成為眾多抗癌藥物的作用靶點〔8〕。另外本研究結(jié)果表明miR-125b inhibitor能延長G1期，縮短G2期，進而使細胞周期阻滯在G1期，使細胞復(fù)制停滯于DNA合成的前期，從而抑制HL-60細胞的惡性增殖，此結(jié)果也與miR-125b inhibitor在慢性淋巴細胞K562中的作用一致〔9〕。

細胞的凋亡受細胞凋亡相關(guān)基因的嚴(yán)格調(diào)控，其中研究最為廣泛的是Bcl-2蛋白家族，其中Bcl-2是常見的抑凋亡蛋白，能與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號的傳遞，促進細胞的存活。Bax能自身形成二聚體，將凋亡信號傳遞給Caspase 3家族，最終導(dǎo)致細胞凋亡。而細胞凋亡受限制源自于細胞增殖的不可控制，即細胞周期的不可控制。其中CyclinA1及CyclinD1是與細胞周期S和G1期密切相關(guān)的細胞周期蛋白，其中CyclinA1對于S期的驅(qū)動具有重要作用，而CyclinD1在G1期開始合成并達到高峰，能與CDK4/CDK6形成復(fù)合物，進而作用于底物，促使轉(zhuǎn)錄起始因子E2F進行轉(zhuǎn)錄，推動與DNA合成有關(guān)的基因進行轉(zhuǎn)錄，從而促使G1期向S期轉(zhuǎn)變。因此通過調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白及細胞周期相關(guān)蛋白，能顯著的調(diào)控細胞的凋亡與增殖，本研究結(jié)果表明miR-125b inhibitor能顯著下調(diào)CyclinA1及Bcl-2表達，上調(diào)Bax及CyclinD1表達。

細胞的凋亡、增殖、分化及細胞周期調(diào)控受多種信號通路的調(diào)控，MAPK/ERK信號通路就是其中的一種〔10〕。EKR是此信號通路的關(guān)節(jié)調(diào)控點，包括5個亞族(ERK1～5)，其中EKR1和ERK2研究的最為徹底，能通過自身磷酸化并將信號傳遞給下游基因進而調(diào)控細胞的生命過程。且研究還顯示ERK在AML中被高度激活，miR-125b在頭頸部腫瘤中的作用機制與MAPK信號通路密切相關(guān)〔11〕。本研究結(jié)果表明miR-125b inhibitor對EKR表達量影響不大，但能顯著的下調(diào)p-ERK，提示miR-125b inhibitor能通過下調(diào)p-EKR水平進而誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡，并抑制細胞增殖。

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〔2017-04-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

R557

A

1005-9202(2017)19-4731-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.018

羅 偉(1977-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事血液病學(xué)研究。