小劑量IL-17A對糖尿病腎病大鼠腎功能的保護作用

白彝華 楊 敏 蔣紅櫻 王劍松 王家平

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，云南 昆明 650101)

小劑量IL-17A對糖尿病腎病大鼠腎功能的保護作用

白彝華 楊 敏 蔣紅櫻 王劍松1王家平2

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，云南 昆明 650101)

目的探討小劑量白細胞介素(IL)-17A對糖尿病大鼠腎臟的保護作用。方法雄性SD大鼠45只，隨機分為正常對照組、糖尿病腎病(DN)組及IL-17A組。DN組及IL-17A組均以高脂高糖飲食聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素建立DN大鼠模型。IL-17A組給予小劑量IL-17A重組蛋白，連續(xù)給藥12 w后，下腔靜脈取血，檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)、肌酐、尿素氮等；水平代謝籠收集各組大鼠24 h尿液，測定大鼠24 h尿蛋白；實時熒光定量PCR檢測腎組織炎癥因子表達；Western印跡測定IL-17A蛋白表達情況。結(jié)果DN組及IL-17A組尿蛋白、HbA1c、肌酐、尿素氮水平均顯著高于正常對照組，IL-17A組均顯著低于DN組(均P<0.05)。DN組在注射IL-17A后促炎因子表達顯著減少，抑制性炎癥因子表達顯著降低。DN模型大鼠IL-17A蛋白顯著減少。結(jié)論IL-17A具有改善DN大鼠腎功能作用，并有可能逆轉(zhuǎn)DN，是治療DN的有效靶點。

糖尿病腎??；白細胞介素17A；炎癥反應(yīng)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致終末期腎病的主要病因〔1〕。目前關(guān)于腎小管間質(zhì)病變機制的作用逐步得到關(guān)注〔2〕。大量研究顯示，炎癥反應(yīng)在糖尿病慢性腎病進程中扮演重要角色，其嚴重程度部分取決于各種白細胞介素(IL)家族因子間的相互作用，既可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)又可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)〔3～5〕。IL-17A是由CD4+T細胞、自然殺傷細胞及中性粒細胞產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)和募集中性粒細胞的作用。近來研究顯示IL-17A在銀屑病、動脈粥樣硬化、強直性脊柱炎等疾病中可通過抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮積極作用〔6，7〕。但目前關(guān)于IL-17A在DN進展中發(fā)揮怎樣的作用尚無相關(guān)報道。本實驗擬研究IL-17A對DN大鼠腎臟的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級雄性D大鼠45只，體重160～190 g，平均(175.1±6.9)g，8周齡，由維通利華動物技術(shù)公司提供，大鼠飼養(yǎng)和實驗嚴格要求進行，自由進食水，光照周期12 h。鏈脲佐菌素(STZ)為Sigma公司，IL-17A重組蛋白為Biovision公司，抗GAPDH、抗IL-17A抗體為Abcam公司，CFX96型熒光定量基因擴增儀(Bio-Rad)，ND 2000C型紫外分光光度計(Thermo Scientific)，BS-380型生化分析儀(邁瑞)。

1.2實驗分組與建立DN模型 45只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后隨機分為正常對照組、DN組及IL-17A組。IL-17A組及DN組給予高脂高糖飲食1個月誘導(dǎo)胰島素抵抗，后采用腹腔一次性注射STZ溶液(150 mg/kg)建模。正常對照組給予等量枸櫞酸緩沖液。注射后1 w檢測大鼠空腹血糖，血糖高于11.2 mmol/L即建模成功。該模型具有高血脂、胰島素抵抗和典型DN等特點。

1.3IL-17A給藥 STZ注射后1 w，模型制作成功后，治療組給予腹腔注射IL-17A重組蛋白(10 ng/次，48 h/次)，連續(xù)注射12 w；正常對照組和DN組給予注射等量磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.4標本采集 藥物注射12 w后，將大鼠放入水平代謝籠中收集各組大鼠24 h尿液，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測24 h尿微量蛋白；心臟取血后處死大鼠，測定血中糖化血紅蛋白(HbA1c)、肌酐、尿素氮；取出腎臟立即放入液氮中，置于-80℃冰箱凍存留做檢測。

1.5RT-PCR 應(yīng)用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法測定大鼠腎組織中炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6的表達情況。Trizol 法提取組織總RNA。引物序列IL-6上游：5′-ACA ACC ACG GCC TTC CCT ACT T-3′,下游：5′-CAC GATTTC CCA GAG AAC ATG TG-3′;TNF-α上游：5′-AAG CCT GTA GCC CAC GTC GTA-3′,下游：5′-GGC ACC ACT AGT TGG TTG TCT TTG-3′;IL-10上游：5′-GCT CTTA CTG ACT GGC ATG AG-3′,下游：5′-CGC AGC TCT AGG AGC ATG TG-3′;GAPDH上游：5′-GTG TAA CCC ATA ACC CCC AAG A-3′,下游：5′-CAC CAG CAG ACC CTC AAG C-3′。逆轉(zhuǎn)錄法按照M-MLV試劑盒(Invitrogen)操作程序進行。擴增反應(yīng)體系10 μl，反應(yīng)條件為預(yù)變性：94℃，2 min；變性：94℃，10 s；退火：60℃，20 s；延伸：72℃，15 s，進行39個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃ 10 min總延伸。選擇管家基因GAPDH作為內(nèi)標，對目的基因均一化。目的基因相對表達量采用2-ΔΔCT法，將正常對照組標本內(nèi)目的基因表達水平設(shè)為1，對DN組及IL1-7A組標本內(nèi)目的基因表達水平進行標準化。

1.6Westem印跡法 稱取100 mg -80℃保存的腎組織加入適量PBS，加入適量組織蛋白裂解液，用超聲波細胞破碎儀裂解組織后，每10 min漩渦振蕩器振蕩1次；10 000 r/min離心30 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。定量后各取樣本量30 μg，10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電壓100 V，電泳2 h。濕式轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，電壓80 V，時間 1 h。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h。4℃冰箱內(nèi)孵育一抗(1∶3 000)過夜；TBST洗膜后室溫下二抗(1∶5 000) 孵育1 h，TBST洗膜后與ECL發(fā)光試劑反應(yīng)，于凝膠成像分析儀上進行檢測。通過Image J軟件計算各條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參進行標準對照。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS17.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 STZ注射后5 d，3只大鼠可能因血糖過高致死。至實驗結(jié)束共存活大鼠42只，正常對照組15只，IL-17A組14只，DN組13只。正常對照組大鼠精神好，毛發(fā)光澤，食欲佳，體重持續(xù)增加；IL-17A組精神一般，毛發(fā)光澤度差，食欲可，體重增加；DN組精神差，毛色無光澤，明顯出現(xiàn)多飲、多食、多尿表現(xiàn)，行動遲緩。

2.2各組大鼠尿蛋白、HbA1c、肌酐、尿素氮水平對比 與正常對照組比較，DN組及IL-17A組尿蛋白、HbA1c、肌酐、尿素氮水平均顯著升高(P<0.05)；與DN組比較，IL-17A組尿蛋白、肌酐、尿素氮水平均顯著降低(P<0.05)，HbA1c水平有所下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠相關(guān)指標水平比較

與正常對照組比較：1)P<0.05；與DN組比較：2)P<0.05

2.3大鼠腎臟炎癥因子的表達 與正常對照組(1.2±0.8，1.2±0.8，0.77±0.24)比較，DN組(15.1±1.2，17.0±1.4)和IL-17A組(8.2±1.0，6.3±0.8)IL-6、 TNF-α表達顯著升高，DN組IL-10顯著降低(0.41±0.06)，IL-17A組IL-10顯著升高(1.42±0.31，均P<0.05)；與DN組比較，IL-17A組IL-6、 TNF-α表達顯著降低，IL-10顯著升高(均P<0.05)。

2.4大鼠腎臟IL-17A蛋白表達情況 與正常對照組(0.52±0.09)相比，DN組IL-17A蛋白(0.23±0.06)顯著降低，IL-17A組顯著升高(0.72±0.04，P<0.05)；與DN組比較IL-17A組IL-17A蛋白顯著升高(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟IL-17A蛋白的表達

3 討 論

20%～40%2型糖尿病患者會并發(fā)DN〔8〕。DN是糖尿病患者嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是致殘、致命性的并發(fā)癥，可導(dǎo)致患者慢性腎功能不全。早期、晚期患者均可出現(xiàn)蛋白尿，嚴重者可出現(xiàn)尿毒癥。病變腎臟組織病理特點表現(xiàn)為腎小管和腎小球的基底膜增厚，細胞外基質(zhì)積聚增多以及連續(xù)性的系膜增生〔9〕。依靠嚴格的胰島素治療，嚴格控制患者飲食中蛋白質(zhì)的攝入量，采取低蛋白飲食，控制血壓等措施可以延緩DN的發(fā)生。

自Bohle等〔10〕發(fā)現(xiàn)DN患者腎組織中存在巨噬細胞浸潤后，越來越多的證據(jù)顯示，炎癥在DN發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用。Navarro等〔11〕發(fā)現(xiàn)Ⅱ型糖尿病患者血清中TNF-α水平顯著高于正常人群，是DN臨床的獨立相關(guān)性標志物。另外炎癥因子單核細胞趨化因子-1〔12〕、細胞間黏附分子-1〔13〕、IL-6〔14〕等均證明與DN的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。

IL-17家族蛋白已被證實在關(guān)節(jié)炎等炎性、纖維化疾病中發(fā)揮負性調(diào)控炎癥因子作用〔15〕。IL-17家族細胞因子能誘導(dǎo)多種細胞因子表達，如IL-6、IL-1、TGF-β、TNF-β、TNF-α及趨化因子IL-8、MCP-1等。通過這些細胞因子及趨化因子，IL-17在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植排斥反應(yīng)及牛皮癬等發(fā)揮一定的作用。IL-17家族各成員有不同的表達部位和方式，T細胞激活后分泌IL-17A、IL-17F，并在炎癥反應(yīng)期間有顯著的上調(diào)；IL-17B表達于外周組織和免疫器官；IL-17C在炎癥反應(yīng)期間表達會有上調(diào)，但在一般情況下呈低表達狀態(tài)；IL-17D在神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼肌中高表達，IL-17F在多種外周組織中都成低表達狀態(tài)〔16〕。IL-17A的作用是把雙刃劍，一方面可以抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生〔17〕，另一方面在載脂蛋白E敲除小鼠中IL-17A缺乏又會加速不穩(wěn)定動脈粥樣斑塊的形成〔18〕。而關(guān)于IL-17A在腎臟病中的作用目前尚不明確。

本研究結(jié)果說明DN大鼠腎組織中IL-17A蛋白減少，炎癥反應(yīng)加劇，通過注射IL-17A重組蛋白，炎癥減輕，腎功能得到改善。

Tong等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)與野生型糖尿病模型小鼠相比，IL-17A基因敲除糖尿病模型小鼠的蛋白尿程度以及腎間質(zhì)的損害相對較輕，說明抑制IL-17的表達將改善DN的癥狀，甚至可能實現(xiàn)DN的轉(zhuǎn)歸。目前，有一種新興藥物IL-17A抑制劑，即Secukinumab，它是一種重組、高親和性、人免疫球蛋白G1κ單克隆抗體，能夠選擇性地與IL-17A結(jié)合從而中和IL-17A的作用，目前處于Ⅲ期臨床試驗階段。Ⅱ期臨床試驗結(jié)果顯示其對銀屑病、強直性脊柱炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有明顯療效〔20〕。而目前關(guān)于抑制IL-17A或IL-17F對于DN的作用還無相關(guān)報道。

本研究結(jié)果表明，IL-17A的缺乏會促進腎病的進展，加劇糖尿病模型大鼠的病情；但是給予糖尿病模型大鼠低劑量的IL-17A，能夠有效治療大鼠DN模型的腎臟炎癥反應(yīng)，并有可能預(yù)防和逆轉(zhuǎn)DN，從而成為治療DN的有效靶點。

1Verhave JC，Bech AP，Wetzels JF，etal.Hepatocyte nuclear factor 1beta-associated kidney disease：more than renal cysts and diabetes〔J〕.J Am Soc Nephrol，2016；27(2)：345-53.

2Anil KP，Welsh GI，Saleem MA，etal.Molecular and cellular events mediating glomerular podocyte dysfunction and depletion in diabetes mellitus〔J〕.Front Endocrinol (Lausanne)，2014；5(1)：151.

3Baker RG，Hayden MS，Ghosh S.NF-kappaB，inflammation，and metabolic disease〔J〕.Cell Metab，2011；13(1)：11-22.

4Bangstad HJ，Seljeflot I，Berg TJ，etal.Renal tubulointerstitial expansion is associated with endothelial dysfunction and inflammation in type 1 diabetes〔J〕.Scand J Clin Lab Invest，2009；69(1)：138-44.

5Furuichi K，Kaneko S，Wada T.Chemokine/chemokine receptor-mediated inflammation regulates pathologic changes from acute kidney injury to chronic kidney disease〔J〕.Clin Exp Nephrol，2009；13(1)：9-14.

6Nakashima T，Jinnin M，Yamane K，etal.Impaired IL-17 signaling pathway contributes to the increased collagen expression in scleroderma fibroblasts〔J〕.J Immunol，2012；188(8)：3573-83.

7Danzaki K，Matsui Y，Ikesue M，etal.Interleukin-17A deficiency accelerates unstable atherosclerotic plaque formation in apolipoprotein E-deficient mice〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012；32(2)：273-80.

8Tuttle KR，Bakris GL，Bilous RW，etal.Diabetic kidney disease：a report from an ADA Consensus Conference〔J〕.Diabetes Care，2014；37(10)：2864-83.

9Ni WJ，Tang LQ，Wei W.Research progress in signalling pathway in diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes Metab Res Rev，2015；31(3)：221-33.

10Bohle A，Wehrmann M，Bogenschutz O，etal.The pathogenesis of chronic renal failure in diabetic nephropathy.Investigation of 488 cases of diabetic glomerulosclerosis〔J〕.Pathol Res Pract，1991；187(2-3)：251-9.

11Navarro JF，Mora C，Muros M，etal.Urinary tumour necrosis factor-alpha excretion independently correlates with clinical markers of glomerular and tubulointerstitial injury in type 2 diabetic patients〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2006；21(12)：3428-34.

12Usui H，Shikata K，Matsuda M，etal.HMG-CoA reductase inhibitor ameliorates diabetic nephropathy by its pleiotropic effects in rats〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2003；18(2)：265-72.

13Rivero A，Mora C，Muros M，etal.Pathogenic perspectives for the role of inflammation in diabetic nephropathy〔J〕.Clin Sci (Lond)，2009；116(6)：479-92.

14Dalla VM，Mussap M，Gallina P，etal.Acute-phase markers of inflammation and glomerular structure in patients with type 2 diabetes〔J〕.J Am Soc Nephrol，2005；16(Suppl 1)：S78-82.

15Nakashima T，Jinnin M，Yamane K，etal.Impaired IL-17 signaling pathway contributes to the increased collagen expression in scleroderma fibroblasts〔J〕.J Immunol，2012；188(8)：3573-83.

16Aggarwal S，Gurney AL.IL-17：prototype member of an emerging cytokine family〔J〕.J Leukoc Biol，2002；71(1)：1-8.

17Taleb S，Romain M，Ramkhelawon B，etal.Loss of SOCS3 expression in T cells reveals a regulatory role for interleukin-17 in atherosclerosis〔J〕.J Exp Med，2009；206(10)：2067-77.

18Danzaki K，Matsui Y，Ikesue M，etal.Interleukin-17A deficiency accelerates unstable atherosclerotic plaque formation in apolipoprotein E-deficient mice〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012；32(2)：273-80.

19Tong Z，Liu W，Yan H，etal.Interleukin-17A deficiency ameliorates streptozotocin-induced diabetes〔J〕.Immunology，2015；146(2)：339-46.

20Sanford M，McKeage K.Secukinumab：first global approval〔J〕.Drugs，2015；75(3)：329-38.

〔2017-03-11修回〕

(編輯 李相軍)

R587.1

A

1005-9202(2017)19-4729-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.017

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項基礎(chǔ)研究基金(No.2015FB054)

1 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科 2 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院放射科

楊 敏(1971-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事急、慢性腎臟病研究。

白彝華(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事急、慢性腎臟病研究。