S6K1沉默對宮頸癌細胞侵襲遷移及相關基因表達的影響

韓 冰 趙國軍 蘭素偉 付子毅

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦科，河北 承德 067000)

S6K1沉默對宮頸癌細胞侵襲遷移及相關基因表達的影響

韓 冰 趙國軍 蘭素偉 付子毅1

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦科，河北 承德 067000)

目的探討RNA干擾核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)對人宮頸癌細胞Hela侵襲遷移及相關基因表達的影響。方法根據文獻報道及siRNA設計原則合成靶向S6K1基因的siRNA，以陽離子脂質體Lipofectamine 2000為載體轉染對數生長期Hela細胞(沉默組)，同時設轉染不針對任何基因隨機序列的陰性對照組和轉染試劑的空白對照組。轉染48 h后采用實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測干擾效率，分別于轉染24、48、72 h后采用WST法評價靶向沉默S6K1對Hela細胞增殖的影響，采用Transwell小室法檢測經S6K1沉默后對Hela細胞侵襲遷移的影響，采用Western印跡法檢測S6K1沉默后Hela細胞中人基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1、TIMP-2的蛋白水平。結果以空白對照組為參照(其S6K1 mRNA水平為1.000)，陰性對照組的S6K1 mRNA水平為(1.027±0.034)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而沉默組的S6K1 mRNA水平(0.158±0.012)低于其余兩組(P<0.05)，相對于空白對照組的沉默率為(92.4±3.7)%。與空白對照組和陰性對照組比較，沉默組轉染后的增殖率降低，遷移實驗和侵襲實驗中的穿膜細胞數均降低，MMP-2、MMP-9蛋白水平均降低，而TIMP-1、TIMP-2蛋白水平均升高(P<0.05)。結論RNA靶向沉默S6K1表達可抑制人宮頸癌Hela細胞侵襲遷移，可能與其抑制MMP-2/9表達及促進TIMP-1/2表達有關。

核糖體蛋白S6激酶1；宮頸癌；侵襲；遷移

盡管目前擁有手術及放化療等有效治療手段，但宮頸癌的致死率仍較高，而腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉移是其治療失敗的主要原因〔1〕。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因的狀態(tài)異?！?〕。核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)參與了一系列重要的代謝反應，包括蛋白質、核苷酸及脂質的合成〔3,4〕，作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路關鍵的下游效應因子，調節(jié)細胞的生長與代謝〔5〕。近年來發(fā)現S6K1參與了惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在調節(jié)癌細胞增殖凋亡等過程中發(fā)揮重要作用〔6,7〕，但其在宮頸癌中的表達模式及作用尚不清楚。本研究采用siRNA手段沉默S6K1表達，分析對宮頸癌細胞遷移侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1細胞株與試劑 人宮頸癌Hela細胞購于中國科學院上海細胞庫，WST細胞增殖毒性分析試劑盒(WST-1cell proliferation assay kit)購于中國碧云天生物技術有限公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程公司，PrimeScript?RT reagent kit、SYBR?Premix ExTaq kit購自大連寶生物工程有限公司，Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、Lipofectamine 2000轉染試劑及Opti-MEM培養(yǎng)基購自上海Invitrogen公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自HyClone公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel膠購自美國 Becton Dickinson Labware公司，抗人基質金屬蛋白酶(MMP)2(ab37150)、MMP9(ab38898)一抗均購自美國 Abcam公司，基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1、TIMP-2一抗均購自美國 SANTA CRUZ公司。

1.2細胞培養(yǎng) 將Hela細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，將細胞培養(yǎng)箱的參數設置為37℃、CO2的體積分數為5%，48 h后半量換液，棄去懸浮細胞(未貼壁或已死亡)，以后每2～3 d換液1次繼續(xù)培養(yǎng)，待達80%～90%融合后，胰酶消化傳代按1∶3行傳代培養(yǎng)。

1.3siRNA引物設計及轉染 根據文獻報道〔9〕及siRNA設計原則合成設計1條靶向S6K1基因的siRNA，同時設計不針對任何基因的隨機序列(siRNA-NC)，以上序列均由上海生工生物工程公司合成。S6K1：5′-CAGUGGAGGAGAACUAUUUdTdT-3′，siRNA-NC：5′-CCUACGCCACCAAUUUCGUdTdT-3′。

1.4siRNA轉染 取對數生長期Hela細胞以2×105個/ml的濃度接種于6孔板進行轉染，經預實驗發(fā)現當siRNA與Lipofectamine 2000的體積比為1∶1時有較佳的轉染效率，取50 μl含100 pmol siRNA的Opti-MEM培養(yǎng)基與50 μl 含Lipofectamine 2000的Opti-MEM培養(yǎng)基混合5 min以形成siRNA-Lipo2000混和物，隨后加入2 ml接種Hela細胞的無FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，4 h后替換為含血清的培養(yǎng)基。根據siRNA片段轉染情況將Hela細胞分為沉默組(轉染靶向S6K1 siRNA)和陰性對照組(轉染siRNA-NC)，同時設僅行轉染試劑Lipofectamine 2000處理的空白對照組。轉染48 h后采用實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測S6K1的沉默率。

1.5實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測Hela細胞中S6K1 mRNA水平 采用Trizol試劑提取Hela細胞中的總RNA，取2 μg總RNA采用PrimeScript?RT reagent kit制備cDNA，采用SYBR?Premix ExTaq kit進行RT-PCR擴增，條件：95℃變性5 min，(95℃ 30 s、55℃ 30 s及72℃ 30 s)共30個循環(huán)，72℃延伸10 min。采用2-△△Ct進行相對定量分析，計算S6K1相對于內參β-actin的相對表達量。S6K1上游引物：5′-CTCATCCTTGAGTATCTCAG-3′，下游引物：5′-TGCTCCCAAA CTCCACCAAT-3′；β-actin上游引物：5′-AGCGGGAAATCGTG CGTGAC-3′，下游引物：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3′。

1.6WST法檢測細胞增殖 取轉染后的Hela細胞，以每孔2×103個接種于96孔板，每組設3個復孔，分別于轉染24、48、72、96 h后吸棄培養(yǎng)上清液，向每孔加入100 μl 含10% WST-1的RPMI 1640培養(yǎng)基，孵育3 h后，采用EXL-800型酶標儀檢測450 nm波長下的吸光度值(A)并計算沉默組或陰性對照組相對于空白對照組的活力變化。

1.7Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力

1.7.1遷移實驗 轉染24、48 h后收集各組細胞，無血清RPMI 1640培養(yǎng)液重懸后，加入小室上室，下室加入含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，常規(guī)于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取出小室，用棉簽拭去膜上室面細胞，70%甲醇室溫固定15 min，結晶紫染色10～15 min，在100倍倒置顯微鏡下計數細胞數。

1.7.2侵襲實驗 接種細胞前先鋪Matrigel膠，按50 μl/孔均勻鋪于小室上室的聚碳酸酯膜上，待膠鋪勻后，水平置入37℃細胞培養(yǎng)箱中，孵育1～2 h后變?yōu)楣虘B(tài)。用無血清RMPI 1640培養(yǎng)液清洗1次，按照產品說明書進行水化，備用。其余步驟同遷移實驗，在100倍倒置顯微鏡下計數細胞數。

1.8Western印跡方法 按照常規(guī)Western印跡方法檢測各組細胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白水平，以β-actin為內參，計算以上蛋白相對于內參的表達情況。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析(one way ANOVA)，兩兩比較采用SNK法。

2 結 果

2.1轉染效率 以空白對照組為參照(其S6K1 mRNA水平為1.000)，陰性對照組的S6K1 mRNA水平為(1.027±0.034)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，沉默組的S6K1 mRNA水平(0.158±0.012)低于其余兩組(P<0.05)，相對于空白對照組的沉默率為(92.4±3.7)%，提示在Hela細胞中采用siRNA靶向沉默S6K1成功。

2.2siRNA靶向沉默S6K1對Hela細胞活性的影響 與空白對照組和陰性對照組比較，沉默組轉染24～96 h后的增殖率降低，呈時間依賴，其中96 h的增殖率低于50%，以上差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組以上時間點增殖率的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 siRNA靶向沉默S6K1對細胞活力的影響

與空白對照組比較：1)P<0.05；與陰性對照組比較：2)P<0.05，下表同

2.3siRNA靶向沉默S6K1對細胞遷移能力的影響 與空白對照組和陰性對照組相比，沉默組轉染24、48 h的穿膜數目均減少(P<0.05)；沉默組相對于空白對照組的24、48 h遷移能力抑制率均在40%以上?？瞻讓φ战M和陰性對照組細胞穿膜數目的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 siRNA靶向沉默S6K1對細胞遷移能力的影響

2.4siRNA靶向沉默S6K1對細胞侵襲能力的影響 與空白對照組和陰性對照組相比，沉默組轉染24、48 h的穿膜數目減少(P<0.05)；沉默組相對于空白對照組的24、48 h侵襲能力抑制率均在50%以上?？瞻讓φ战M和陰性對照組細胞穿膜數目的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 siRNA靶向沉默S6K1對細胞侵襲能力的影響

2.5siRNA靶向沉默S6K1對侵襲能力相關基因的影響 與空白對照組和陰性對照組相比，沉默組的MMP-2和MMP-9蛋白水平均降低，分別為對照組的0.379和0.227倍；而TIMP-1和TIMP-2蛋白水平均升高，分別為對照組的3.467和2.200倍(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 siRNA靶向沉默S6K1對細胞侵襲能力相關基因的影響

3 討 論

S6K1是mTOR復合體的下游效應器，可調節(jié)細胞的多項基本功能，如存活、增殖、代謝、遷移和血管生成〔5～8〕。在多種乳腺癌細胞中發(fā)現S6K1基因表達增多，且與乳腺癌患者的不良預后有關〔9〕。抑制S6K1表達可增強Bcl-2/Bcl-xL活性缺失誘導乳腺癌細胞凋亡〔10〕。此外，S6K1還參與了EGFR野生型NSCLC細胞對厄洛替尼的敏感性調節(jié)〔11〕。以上結果提示S6K1在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用。

本研究根據文獻報道〔8〕并參考siRNA設計策略構建了靶向S6K1的siRNA，在高效轉染后發(fā)現Hela細胞中S6K1 mRNA水平大幅降低，提示靶向干擾效果較好，為下一步研究S6K1與宮頸癌細胞侵襲遷移的關系提供了方法學基礎。細胞的增殖過程受嚴格調控，而腫瘤細胞增殖調節(jié)異常，如何控制癌細胞過度增殖也是宮頸癌防治的重點〔10〕。本研究發(fā)現采用siRNA下調S6K1表達后，Hela細胞的增殖受到抑制，明確表明S6K1參與了宮頸癌細胞增殖的調控過程。Ras/MAPK和PI3K/Akt信號通路參與了mTOR功能的調節(jié)〔12〕，該兩條通路在多種腫瘤中處于激活狀態(tài)，也是導致腫瘤細胞增殖失控的主要原因之一。S6K1為mTOR的下游效應分子，通過siRNA轉染手段沉默S6K1表達，可能會影響以上信號通路的活性，故推測沉默S6K1表達可能會通過抑制Ras/MAPK/mTOR和PI3K/Akt/mTOR信號通路的活動發(fā)揮抑制Hela細胞增殖的效果。本研究的不足之處為未在動物模型上檢測。侵襲轉移是宮頸癌治療失敗和復發(fā)的主要原因之一。本研究發(fā)現靶向沉默S6K1表達后，Hela細胞的侵襲和遷移細胞數目均降低，且遷移能力和侵襲能力均受抑制，表明S6K1可成為預防Hela細胞侵襲遷移的重要靶點。細胞基底膜和細胞外基質完整性與腫瘤細胞的侵襲轉移密切相關，受到MMP與TIMP家族的調節(jié)〔13，14〕。本研究進一步分析提示S6K1參與了宮頸癌細胞MMP/TIMP系統(tǒng)的調節(jié)，抑制S6K1表達可提高TIMP活性以促進其對MMP系統(tǒng)的對抗，最終達到抑制侵襲遷移的目的。

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〔2017-02-17修回〕

(編輯 徐 杰)

R739

A

1005-9202(2017)19-4726-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.016

國家自然科學基金(81302304)

1 南京醫(yī)科大學附屬南京市婦幼保健院醫(yī)學研究中心

韓 冰(1976-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦科研究。