梔子苷對(duì)乳腺炎小鼠乳腺組織及乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響

趙慧朵 程旭鋒 楚愛景

(河南省中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院乳腺病科，河南 鄭州 450000)

梔子苷對(duì)乳腺炎小鼠乳腺組織及乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響

趙慧朵 程旭鋒 楚愛景

(河南省中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院乳腺病科，河南 鄭州 450000)

目的觀察梔子苷對(duì)乳腺炎小鼠乳腺組織及乳腺上皮細(xì)胞中白細(xì)胞介素(IL)-6，腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β的影響。方法36只BALB/C小鼠隨機(jī)分為模型組(乳腺炎組)、梔子苷組(乳腺炎+梔子苷組)、地塞米松組(乳腺炎+地塞米松組)和對(duì)照組(假手術(shù)組)，建立脂多糖誘導(dǎo)乳腺炎小鼠模型HE染色觀察各組乳腺炎小鼠的乳腺組織病理形態(tài)學(xué)變化，采用ELISA法測(cè)定各組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量。結(jié)果HE染色顯示：模型組小鼠乳腺乳泡壁增厚，乳泡結(jié)構(gòu)破壞，乳泡內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤；梔子苷組和地塞米松組乳腺乳泡壁稍增厚，乳泡結(jié)構(gòu)輕度破壞，乳泡內(nèi)見少量炎癥細(xì)胞浸潤；對(duì)照組小鼠乳腺組織未見明顯異常。模型組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量均高于對(duì)照組、梔子苷組和地塞米松組(P<0.05)；梔子苷組和地塞米松組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)；梔子苷組和地塞米松組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論梔子苷對(duì)小鼠乳腺炎有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與梔子苷降低乳腺炎小鼠乳腺組織及乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β水平有關(guān)。

梔子苷；乳腺炎；白細(xì)胞介素-6；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-1β

急性乳腺炎是乳房最常見的急性化膿性感染性疾病。梔子是中國傳統(tǒng)中藥材〔1〕，其成熟干燥的果實(shí)是主要中藥部分，梔子具有涼血解毒、清熱利尿、瀉火除煩等功效，梔子苷是從干燥的梔子果實(shí)中提取出來的，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌等多種藥理作用〔2～4〕。本文擬觀察梔子苷對(duì)乳腺炎小鼠乳腺組織及乳腺上皮細(xì)胞中白細(xì)胞介素(IL)-6，腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 選擇健康BALB/C小鼠36只，購自吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，小鼠許可證號(hào)：SYXK(吉)2015-0005。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為模型組(乳腺炎組)、梔子苷組(乳腺炎+梔子苷組)、地塞米松組(乳腺炎+地塞米松組)和對(duì)照組(假手術(shù)組)，每組9只小鼠。主要試劑：脂多糖(LPS)(美國Biolegend公司)，梔子苷(北京中國食品藥品檢驗(yàn)研究院)，地塞米松注射液(新鄉(xiāng)常樂制藥有限公司)，小鼠IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒(美國Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國Biolegend公司)等。

1.2建立乳腺炎小鼠模型 將雌鼠配對(duì)成功后分籠喂養(yǎng)，雌鼠分娩后1 w隔離母鼠和幼鼠，待母鼠情緒穩(wěn)定后，每組取2只小鼠處死分離乳腺上皮細(xì)胞，每組剩余7只小鼠稱重，進(jìn)行麻醉，麻醉成功后，梔子苷組母鼠腹腔注射梔子苷(50 mg/kg)、地塞米松組母鼠腹腔注射地塞米松(5 mg/ml)；模型組和對(duì)照組母鼠腹腔注射等量生理鹽水。1 h后，將各組小鼠固定到手術(shù)臺(tái)上，酒精消毒第4對(duì)乳頭，將乳頭前端剪開一小口，模型組、梔子苷組、地塞米松組乳頭內(nèi)注射50 μl脂多糖(2 mg/ml)，對(duì)照組注射等量生理鹽水。12 h后，梔子苷組母鼠腹腔注射梔子苷(50 mg/kg)、地塞米松組母鼠腹腔注射地塞米松(5 mg/ml)；模型組和對(duì)照組母鼠腹腔注射等量生理鹽水。建模后24 h處死小鼠，取出第4對(duì)乳腺組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3乳腺組織的HE染色 將各組小鼠乳腺組織進(jìn)行常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟及包埋，將包埋的石蠟切片切成厚0.5 μm的切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察各組小鼠乳腺組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.4測(cè)定各組小鼠乳腺組織中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量 在碎冰上將各組小鼠乳腺組織和磷酸鹽緩沖液進(jìn)行粉碎，離心后棄去上層脂肪部分，取中間層上清液，采用ELISA法測(cè)定各組小鼠乳腺組織中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量。

1.5分離培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞 將每組分娩后1 w處死的2只小鼠浸入酒精消毒，分離乳腺組織，在含雙抗的青霉素瓶中洗滌，加入消化液消化，然后剪碎乳腺組織，將乳腺組織移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)5 h，離心，棄去上清液，重懸細(xì)胞后濾網(wǎng)過濾，加入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，離心，棄去上清液，接種到含鼠尾膠原的細(xì)胞板中培養(yǎng)36 h。

1.6測(cè)定各組小鼠乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量 將各組分離的乳腺上皮細(xì)胞接種到24孔板中，每組7復(fù)孔梔子苷組加入100 μl梔子苷(100 μg/ml)，地塞米松組加入100 μl地塞米松(20 μg/ml)，1 h后模型組、梔子苷組、地塞米松組加入50 μl LPS(4 μg/ml)，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞液，離心后取上清液，采用ELISA法測(cè)定各組小鼠乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，多組均數(shù)比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1乳腺炎小鼠模型的建立 模型組小鼠腹部乳腺部位發(fā)紅，乳腺組織出現(xiàn)紅腫熱痛等炎癥改變，對(duì)照組小鼠腹部乳腺部位和乳腺組織無明顯異常。表明乳腺炎小鼠造模成功。

2.2各組小鼠乳腺組織形態(tài)學(xué)變化 模型組小鼠乳腺乳泡壁增厚，乳泡結(jié)構(gòu)破壞，乳泡內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤；梔子苷組和地塞米松組乳腺乳泡壁稍增厚，乳泡結(jié)構(gòu)輕度破壞，乳泡內(nèi)見少量炎癥細(xì)胞浸潤；對(duì)照組小鼠乳腺組織未見明顯異常。見圖1。

圖1 各組小鼠乳腺組織病理形態(tài)學(xué)變化(HE，×100)

2.3各組小鼠乳腺組織中和乳腺上皮細(xì)胞IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量 模型組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量均高于對(duì)照組、梔子苷組和地塞米松組(P<0.05)；梔子苷組和地塞米松組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)；梔子苷組和地塞米松組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1，表2。

表1 各組小鼠乳腺組織中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量

與模型組比較：1)P<0.05；與對(duì)照組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組小鼠乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達(dá)量

3 討 論

急性乳腺炎發(fā)病的主要原因?yàn)槿橹俜e，細(xì)菌經(jīng)過乳頭皸裂或者乳頭破損處浸入乳房組織內(nèi)。急性乳腺炎主要的致病菌為金黃色葡萄球菌，其次為鏈球菌等。小鼠乳腺炎模型可通過LPS誘導(dǎo)、金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)、內(nèi)毒素誘導(dǎo)等方法建立〔5～7〕。LPS是比較常用的誘導(dǎo)建立小鼠乳腺炎模型的方法，LPS是細(xì)菌死亡破壞后釋放出來的，是革蘭陰性菌內(nèi)毒素的組成部分，LPS可引起微循環(huán)障礙、發(fā)熱等，進(jìn)入人體后增加血液中中性粒細(xì)胞數(shù)量，引起內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，LPS誘導(dǎo)建立小鼠乳腺炎模型可產(chǎn)生IL-6，TNF-α和IL-1β等炎性細(xì)胞因子，介導(dǎo)多種免疫反應(yīng)，引起乳腺組織損傷。本研究也顯示LPS誘導(dǎo)建立的小鼠乳腺炎模型乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β水平明顯增加。

梔子苷在多種疾病中具有重要作用〔8～13〕，對(duì)呼吸系統(tǒng)具有抗哮喘、抗肺損傷作用；對(duì)消化系統(tǒng)具有保肝利膽、降血糖、保護(hù)胰腺組織等作用；對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡、改善學(xué)習(xí)功能障礙等作用；梔子苷也具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗微生物作用。有研究發(fā)現(xiàn)梔子苷對(duì)乳腺炎有一定的保護(hù)作用〔14，15〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梔子苷對(duì)乳腺炎有一定的保護(hù)作用，可以減輕乳腺炎炎癥，減輕乳腺組織的破壞程度，降低乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β水平；考慮梔子苷對(duì)乳腺炎的保護(hù)作用可能和梔子苷降低乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β水平有關(guān)。

1廖夫生.中藥梔子研究進(jìn)展〔J〕.廣州化工，2013；1：12-3，21.

2Ma TT，Li XF，Li WX，etal.Geniposide alleviates inflammation by suppressing MeCP2 in mice with carbon tetrachloride-induced acute liver injury and LPS-treated THP-1 cells〔J〕.Int Immunopharmacol,2015；29(2)：739-47.

3宋曉靜，孫 勇，付云鶴，等.梔子苷藥理作用的研究進(jìn)展〔J〕.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015；7：78-80.

4Cai L，Li R，Tang WJ，etal.Antidepressant-like effect of geniposide on chronic unpredictable mild stress-induced depressive rats by regulating the hypothalamus-pituitary-adrenal axis〔J〕.Eur Neuropsychopharmacol.2015；25(8)：1332-41.

5Zhao Y，Zhou M，Gao Y，etal.Shifted T helper cell polarization in a murine staphylococcus aureus mastitis model〔J〕.PLoS One,2015；10(7)：e0134797.

6Gao XJ，Guo MY，Zhang ZC，etal.Bergenin plays an anti-inflammatory role via the modulation of MAPK and NF-κB signaling pathways in a mouse model of LPS-induced mastitis〔J〕.Inflammation,2015；38(3)：1142-50.

7王 亨，余光濤，顧銘杰，等.金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)大鼠乳腺炎模型的建立〔J〕.中國獸醫(yī)雜志，2015；6：7-9，13.

8Wang J，Hou J，Lei H，etal.Synergistic neuroprotective effect of microglial conditioned media treated with geniposide and ginsenoside Rg1 on hypoxia injured neurons〔J〕.Mol Med Rep,2015；12(4)：5328-34.

9王恩力，董 方，姚景春.梔子苷藥理學(xué)和毒理學(xué)研究進(jìn)展〔J〕.中國藥房，2015；19：2730-3.

10Chen JY，Wu H，Li H，etal.Anti-inflammatory effects and pharmacokinetics study of geniposide on rats with adjuvant arthritis〔J〕.Int Immunopharmacol,2015；24(1)：102-9.

11Zhang Y，Yin F，Liu J，etal.Geniposide protects pancreatic INS-1E β cells from hIAPP-induced cell damage：potential involvement of insulin degrading-enzyme〔J〕.Cell Biol Int,2015；39(4)：373-8.

12Shi Q，Cao J，F(xiàn)ang L，etal.Geniposide suppresses LPS-induced nitric oxide，PGE2 and inflammatory cytokine by downregulating NF-κB，MAPK and AP-1 signaling pathways in macrophages〔J〕.Int Immunopharmacol,2014；20(2)：298-306.

13張文娟，李茂星，張泉龍，等.梔子苷的快速提取分離及其鎮(zhèn)痛抗炎作用研究〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012；21：170-4.

14Song X，Guo M，Wang T，etal.Geniposide inhibited lipopolysaccharide-induced apoptosis by modulating TLR4 and apoptosis-related factors in mouse mammary glands〔J〕.Life Sci,2014；119(1-2)：9-17.

15Song X，Zhang W，Wang T，etal.Geniposide plays an anti-inflammatory role via regulating TLR4 and downstream signaling pathways in lipopolysaccharide-induced mastitis in mice〔J〕.Inflammation,2014，37(5)：1588-98.

〔2017-02-11修回〕

(編輯 徐 杰)

R655.8

A

1005-9202(2017)19-4712-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.010

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13A320892)

趙慧朵(1981-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事乳腺疾病相關(guān)研究。