大鼠皮膚的保存與撕脫傷模型冷藏皮延遲植皮的實驗研究

李 季 苗智瑩 蔡錦芳 鄒 林 李宗玉 崔宜棟

(鄭州市第一人民醫(yī)院骨外科，河南 鄭州 450004)

大鼠皮膚的保存與撕脫傷模型冷藏皮延遲植皮的實驗研究

李 季1苗智瑩2蔡錦芳1鄒 林1李宗玉1崔宜棟3

(鄭州市第一人民醫(yī)院骨外科，河南 鄭州 450004)

目的對比研究冷藏皮和反植皮的成活率及冷藏皮和液氮冷凍皮膚的病理學變化。方法分析冷藏皮延遲植皮的成活率及病理學變化情況，并對冷藏皮和液氮冷凍皮進行病理形態(tài)學和細胞凋亡率觀察。結果動物實驗研究表明，即時回植組與冷藏皮24 h、48 h組成活率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；冷藏皮72 h、120 h、168 h回植組成活率明顯低于即時回植組(P<0.05)，提示冷藏皮回植黃金時間為48 h以內。大鼠皮膚細胞空泡變性率比較，冷藏皮在第1,3,5,10天的空泡變性率均高于即時回植組(P<0.05)，但第1天的空泡變性率接近即時回植組，而第3,5,10天的空泡變性率與即時回植組差距較大。液氮組第1,3,5,10天的空泡變性率也高于即時回植組(P<0.05)，但是空泡變性率均較接近即時回植組，組間絕對數(shù)差距也較冷藏組的組間差距小。大鼠皮膚細胞凋亡率比較，冷藏皮在第1,3,5,10天的凋亡率均高于即時回植組(P<0.05)，但第1、3天的凋亡率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，而與第5、10天的凋亡率差距較大。液氮組的第1,3,5,10天的凋亡率明顯高于即時回植組(P<0.05)，凋亡率也明顯高于冷藏組。結論皮膚冷藏48 h以內為回植的安全期限，液氮冷藏皮膚，細胞變性率低，但是凍存和解凍過程可能導致細胞凋亡率增加。

皮膚撕脫傷；冷藏皮；液氮凍存皮膚

撕脫傷手術大多采用即時削薄回植或徹底去除脂肪組織，即時反植皮覆蓋創(chuàng)面，面積小者手術時間不長，對機體影響不大；但是當大面積撕脫傷時，對皮膚處理時間長，傷者創(chuàng)面暴露長，出血多，由創(chuàng)面蒸發(fā)丟失的液體量也增加，導致患者血流動力學不穩(wěn)定，甚至大面積出血凝血，導致血小板短時間大量消耗，出現(xiàn)彌散性血管內凝血(DIC)〔1,2〕。另外，創(chuàng)面大面積長時間暴露，傷者的感染率高，因此，傳統(tǒng)對大面積撕脫傷的處理不符合損傷控制治療原則〔3〕。相關研究顯示，冷藏皮回植可減少創(chuàng)面暴露時間，減少醫(yī)源性創(chuàng)傷，有充分時間處理皮膚，利于后期修復〔4〕。對皮膚保存辦法的進一步實驗研究發(fā)現(xiàn)〔5〕，液氮冷凍能有效降低細胞的空泡變性率，但是凍存復蘇的皮膚細胞凋亡率較冷藏皮膚明顯增高，可能是由于皮膚冷凍與解凍的過程中，溫度的急劇變化誘發(fā)凋亡程序開啟，進而導致上述變化。本研究對比冷藏皮和反植皮的成活率，并同時分析冷藏皮和液氮冷凍皮膚的病理學變化。

1 材料與方法

1.1主要試劑 低糖DMEM固體培養(yǎng)基(四季青公司，中國)，胎牛血清，免疫組化凋亡試劑盒(sigma，美國)

1.2動物 Wistar大鼠102只，體重200～215 g，購自北京華阜康生物科技有限公司，動物證書合格編號：SCXK(京)2009-0004，由天津中醫(yī)藥大學動物實驗中心無菌培養(yǎng)室內飼養(yǎng)。所有大鼠按照天津中醫(yī)藥大學動物倫理委員(TCM-LAEC2015026)的指導原則處理。

1.3方法

1.3.1大鼠皮膚撕脫傷模型 大鼠褪毛，在無菌條件下，將大鼠臀部切取大約2 cm×2 cm帶全脂肪層皮膚，形成撕脫傷模型。然后將臀部切取皮膚去除脂肪層，放入無菌注射器中4℃冷藏備用。等待植皮的大鼠創(chuàng)面，油紗覆蓋包扎備用。植皮后打包加壓包扎，1 w后打開加壓包扎判斷成活情況。

1.3.2大鼠皮膚液氮凍存 大鼠皮膚撕脫傷模型建立后，將去除脂肪層的大鼠皮膚分裝到放有血清和二甲基亞砜的無菌凍存管內，將凍存管密封，貼上標簽，放入已做好標記的袋中；將凍存管放到程序降溫盒-80℃凍存，24 h后轉入液氮中長期保存。

1.3.3大鼠液氮凍存皮膚復蘇 從液氮中取出大鼠皮膚凍存管，迅速在37℃溫水中輕輕搖動令其盡快融化，盡量短的時間融化后，取出置于冰上。10 ml DMEM培養(yǎng)基稀釋，1 000 r/min 離心10 min，棄上清，再加入適量DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、7.5% CO2孵箱中培養(yǎng)1 h。從37℃孵箱中取出凍存管，無菌條件下打開凍存管，轉入離心管，加入10倍以上培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，棄上清保存?zhèn)溆?。分為撕脫皮即時回植組(脫皮后立即植皮)，冷藏皮24、48、72、120 h回植組，冷藏皮168 h回植組，分別在對應的時間進行回植手術。

1.3.4dUTP缺口末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡 將皮膚蠟塊樣本用二甲苯浸洗切片2次，每次5 min，梯度乙醇水化，0.85% NaCl浸洗5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗，浸入4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗，每片加入100 μl 20 μg/ml Proteinase K室溫處理15 min。PBS浸洗，浸入4%多聚甲醛固定5 min；PBS浸洗，加100 μl平衡液，濕盒平衡10 min。制備TUNEL反應混合液：冷藏組和液氮凍存組用1 μl rTdT加1 μl 生物素標記的dUTP加98 μl平衡液混勻；即時回植組先加入100 μl DNase1 緩沖液孵育5 min，甩掉液體后再加100 μl 10 U/ml DNase1酶切10 min，用去離子水沖洗4次，PBS浸洗5 min，加100 μl TUNEL反應混合液于標本上，加蓋玻片在37℃暗濕盒中反應1 h。浸入2×SSC 15 min終止反應，PBS浸洗，浸入0.3% H2O215 min，PBS浸洗，加100 μl鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶(HRP)30 min，PBS浸洗，加100 μl二氨基聯(lián)苯胺(DAB)混合液10 min，鏡下出現(xiàn)淺棕色背景時，去離子水沖洗。經過蘇木素復染后，3 s后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明1 min、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陽性細胞著色定位于細胞核，呈棕黃色，背景呈紫藍色。皮膚表皮細胞陽性或顆粒細胞中超過50%細胞陽性，判斷該細胞凋亡。計算各組凋亡率：凋亡率=凋亡細胞數(shù)/整張切片中計數(shù)總數(shù)×100%。大鼠皮膚蘇木素-伊紅(HE)切片：分別選擇0、1、3、5、10 d的大鼠皮膚，光學顯微鏡下觀察皮膚表皮細胞的空泡細胞，每張切片計數(shù)200個細胞，計算空泡變性細胞率，每組做三張切片計數(shù)。計算各組表皮細胞空泡變性率：空泡變性率=空泡變性細胞數(shù)/整張切片中計數(shù)總數(shù)×100%。

1.3.5大鼠冷藏皮電鏡觀察 取大鼠冷藏皮24 h和168 h兩個樣本，按程序送濟南軍區(qū)總醫(yī)院電子顯微鏡室做電鏡切片并照片。觀察切片的細胞器及細胞核染色質，是否有細胞器水腫、顆粒變性及核染色質濃聚反應。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0軟件，計數(shù)資料行χ2檢驗，計量資料行t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠皮膚撕脫傷模型冷藏皮回植成活率分析 即時回植組〔85.71%(12/14)〕與冷藏皮24 h〔80.95%(17/21)〕、48 h組〔72.22%(13/18)〕成活率比較接近，冷藏皮72 h、120 h、168 h回植組成活率分別為47.06%(8/17)，31.25%(5/16)，20.00%(3/15)?？梢姡S著冷藏時間延長，成活率逐漸下降。

2.2多個樣本構成比之間兩兩比較分析 即時回植組與冷藏皮24 h、48 h組成活率之差分別為4.76%、13.49%，無統(tǒng)計學差異(χ2=0.134,0.838；P=0.714，0.359)；冷藏皮72 h、120 h、168 h回植組成活率明顯低于即時回植組，構成比之差分別為38.05%、54.46%、65.71%，有統(tǒng)計學差異(χ2=5.011,9.019,12.523；P=0.025,0.003,0.000)；冷藏皮48 h內回植的成活率明顯高于48 h以后回植成活率(P<0.05)。

2.3大鼠皮膚4℃冷藏細胞和液氮凍存細胞凋亡率分析 大鼠皮膚4℃冷藏在第1,2天的表皮細胞凋亡率基本無差別，冷藏3 d以上的大鼠皮膚表皮細胞凋亡率明顯增加，凋亡率與冷藏時間正相關。大鼠皮膚經過液氮凍存和解凍復蘇后，表皮細胞凋亡率顯著上升，第3天和第5天的凋亡率無顯著差異，第10天凋亡率明顯上升，凋亡率與解凍復蘇后時間正相關。大鼠皮膚4℃冷藏與液氮凍存細胞凋亡率計數(shù)均與時間呈正相關，第1天和第5天的凋亡率相近；第3天、第10天液氮組的細胞凋亡率均明顯高于冷藏組。見表1。

表1 大鼠皮膚4℃冷藏細胞和液氮凍存細胞凋亡率比較

與即時回植組比較：1)P<0.05，下表同

圖1 大鼠皮膚病理切片空泡變性(HE)與凋亡細胞原位雜交結果(×400)

2.4大鼠皮膚4℃冷藏細胞和液氮凍存細胞空泡變性分析 見圖1，表2。大鼠皮膚4℃冷藏細胞空泡變性率雖然顯著高于即時回植組，但是第1天的表皮細胞空泡變性率比較接近于即時回植組；而第3天以后，空泡變性率時間依賴性地增高。在第1天的空泡變性率與冷藏組第1天類似。液氮凍存的新鮮組與第1,3,5,10天的空泡變性率與冷藏組相似，也呈現(xiàn)時間正相關。大鼠皮膚4℃冷藏與液氮凍存細胞空泡變性數(shù)比較，第0天和第1天的細胞空泡變性計數(shù)基本一致。從第3天開始，液氮組的細胞空泡變性計數(shù)低于冷藏組。

表2 大鼠皮膚4℃冷藏細胞及液氮凍存細胞空泡變性計數(shù)比較

2.5電子顯微鏡觀察分析 電鏡觀察，大鼠冷藏皮24 h組皮膚細胞器結構完整，無明顯水腫，無核染色體聚集等表現(xiàn)；而168 h組可見明顯細胞器水腫，細胞核的染色體聚集表現(xiàn)。見圖2。

圖2 電子顯微鏡觀察回植皮不同冷藏時間的情況(×400)

3 討 論

本次研究證實，大鼠皮膚冷藏24 h后表皮空泡變性率明顯增加，但是在24 h內的空泡變性率與新鮮皮膚的空泡變性率接近，而在72 h后，表皮空泡變性率大大增加。對于皮膚表皮細胞的凋亡率的研究也發(fā)現(xiàn)，24 h后的皮膚表皮細胞凋亡率明顯增加。液氮保存復蘇后的大鼠表皮細胞，空泡變性率雖然也較新鮮組增加，但是大大低于冷藏組各時間段的空泡變性率，而隨著凍存時間的推移，凋亡率大幅度增加，遠遠高于同一時段的冷藏皮。

皮膚細胞脫離機體后，在缺氧缺血情況下，不可避免地發(fā)生細胞損傷，表現(xiàn)為細胞變性、凋亡等〔6〕?？张葑冃杂袝r與氣球樣變性難以區(qū)分，是細胞水腫的一種形態(tài)學變化，表現(xiàn)細胞水腫，有明確的空泡，有時胞質疏松，都屬于細胞水腫變性的形態(tài)學變化〔7〕。細胞變性是組織細胞能耐受刺激因素時做出的適應反應，超過其耐受程度的因素有缺氧、物理因素、化學因素、生物因素及免疫因素〔8〕。變性是壞死的前奏，但是大部分初期的變性在損害因素去除后有可逆的可能。細胞一旦壞死，開始無形態(tài)結構無明顯改變；死亡6～10 h后，自溶性改變明顯時光鏡、肉眼可辨，細胞核出現(xiàn)核濃縮、核碎裂、核溶解等變化〔9〕。通過對大鼠皮膚冷藏和液氮凍存的實驗研究，我們在光鏡下發(fā)現(xiàn)了表皮細胞空泡變性的變化情況，說明在離體缺氧的情況下，表皮細胞雖然經過低溫冷藏和液氮凍存，降低了細胞的代謝，減少耗氧，但是隨著時間的推移，兩種保存方法的皮膚表皮細胞空泡變性率逐漸增加，液氮凍存對于代謝的控制明顯優(yōu)于冷藏，表現(xiàn)為空泡變性率遠低于冷藏組。本組研究發(fā)現(xiàn)脫離開血運后的皮膚組織，可能已經啟動了內質網通路和線粒體通路，開始了凋亡的進程。液氮組在第72 h后隨著時間的推移凋亡率迅速上升，大大高于冷藏組的凋亡率。

綜上所述，皮膚冷藏48 h以內為回植的安全期限，液氮冷藏皮膚細胞變性率低，但是凍存和解凍過程可能導致細胞凋亡率增加，其臨床應用的可能性需進一步研究。筆者推測，隨著時間的推移液氮低溫的刺激使細胞內質網應激反應增加，啟動凋亡程序。因此，皮膚液氮保存中如何減少凋亡、減少寒冷對內質網的應激刺激，是重要的研究方向。

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〔2017-03-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

R75

A

1005-9202(2017)19-4709-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.009

國家自然科學基金資助項目(No.30973018)

1 濟南軍區(qū)總醫(yī)院骨外科

2 濟南市婦幼保健院桿石橋社區(qū)服務中心

3 山東大學齊魯醫(yī)院皮膚科

蔡錦芳(1942-)，男，主任醫(yī)師，主要從事骨科創(chuàng)傷創(chuàng)面修復方面的研究。

李 季(1969-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事骨科創(chuàng)傷及腫瘤創(chuàng)面修復方面的研究。