1，25(OH)2D3對(duì)PM2.5在體染毒慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥的作用

彭建萍 陳樂蓉 胡欣春 程小鵬 廖連芳 吳亮亮

(江西省胸科醫(yī)院呼吸科，江西 南昌 330006)

1，25(OH)2D3對(duì)PM2.5在體染毒慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥的作用

彭建萍 陳樂蓉 胡欣春 程小鵬 廖連芳 吳亮亮

(江西省胸科醫(yī)院呼吸科，江西 南昌 330006)

目的探討1,25二羥維生素D3〔1，25(OH)2D3〕對(duì)PM2.5在體染毒慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠氣道炎癥的作用。方法72只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成正常組、COPD組、1，25(OH)2D3+COPD組(合并組),每組24只，對(duì)三組大鼠氣管滴注PM2.5染毒，每天染毒1次，連續(xù)3 d，在最后一次染毒24 h后處死動(dòng)物，分析肺泡灌洗液中白細(xì)胞介素(IL)-8、IL-17、腫瘤壞死因子(TNF)-α的含量。結(jié)果PM2.5對(duì)正常組、COPD組、合并組大鼠均產(chǎn)生急性毒性，且存在劑量反應(yīng)關(guān)系，COPD組肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α濃度明顯高于正常組(P<0.05)，經(jīng)1,25(OH)2D3干預(yù)COPD組IL-8、TNF-α濃度低于COPD組，但仍高于正常組(P<0.05)。結(jié)論COPD大鼠比正常大鼠對(duì)PM2.5更加易感，PM2.5可加重COPD的氣道炎癥。1,25(OH)2D3可減輕COPD氣道炎癥及損傷，在PM2.5染毒情況下補(bǔ)充1,25(OH)2D3對(duì)COPD的氣道炎癥仍具有改善作用。

大氣細(xì)顆粒物(PM2.5)；慢性阻塞性肺疾??；1，25二羥維生素D3；炎癥

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種氣道慢性炎癥性疾病，與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)〔1〕。氣道炎癥是COPD主要的病理特征，該炎癥涉及中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-(IL)-8、IL-17、腫瘤壞死因子(TNF)-α等，導(dǎo)致白細(xì)胞黏附、移行到炎癥部位參與炎癥反應(yīng)，引起氣道過量黏液分泌，纖維化和蛋白水解，致使COPD臨床癥狀反復(fù)加重〔2〕。由于大氣PM2.5表面積相對(duì)較大，可吸附大量有毒物質(zhì)，同時(shí)PM2.5體積小，使其通過呼吸沉積肺泡，加重COPD的氣道炎癥，并引起免疫反應(yīng)延遲，使氣道對(duì)細(xì)菌的易感性增加，導(dǎo)致COPD反復(fù)加重，肺功能進(jìn)行性下降。研究發(fā)現(xiàn)1，25(OH)2D3在慢性氣道炎癥及自身免疫性疾病的免疫應(yīng)答方面均發(fā)揮著復(fù)雜的調(diào)控作用〔3,4〕。Hansdottir等〔4〕研究顯示1，25(OH)2D3可以通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)通路來減少IL-8的產(chǎn)生。本研究擬分析PM2.5對(duì)COPD氣道炎癥的影響及1，25(OH)2D3對(duì)COPD氣道炎癥的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料 顆粒物采樣器：TSP/PM10/PM2.5 2型(北京地質(zhì)儀器廠和北京迪克機(jī)電技術(shù)有限公司)，低溫真空冷凍干燥機(jī)：MCFD5505型(美國(guó)sim公司)，超聲振蕩器：KQ-50B型(昆山市超聲儀器有限公司)，低溫高速離心機(jī)：TGL-16G型(上海安亭科學(xué)儀器公司)，人IL-8酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(深圳晶美生物技術(shù)公司)，人IL-17 ELISA試劑盒(深圳晶美生物技術(shù)公司)，人TNF-α ELISA試劑盒(深圳晶美生物技術(shù)公司)，美國(guó)BIOKIT公司產(chǎn)ELX-800型酶標(biāo)儀，-80℃超低溫冰箱(MDF-U52V;SANYO;Japan)。

1.2PM2.5的采樣與處理 在江西省胸科醫(yī)院門診大樓10層(高約30 m)設(shè)置采樣點(diǎn)，采樣時(shí)間為2014年1～3月，采用90 mm玻璃纖維濾膜采集PM2.5樣品。每天24 h連續(xù)采樣，連續(xù)采集2個(gè)月。遇到極端天氣(如雨、雪等)時(shí)停止采樣。將載有PM2.5的濾膜浸入蒸餾水中，在超聲振蕩器上反復(fù)振蕩，多層無菌紗布過濾后濾液用低溫離心機(jī)4℃、10 000 r/min離心20 min。吸取上清液繼續(xù)用于超聲振蕩，收集底層顆粒物，最后將濃縮的上清液及所有收集的底層顆粒物合并真空冷凍干燥，低溫冰箱保存，以滅菌三蒸水配成3種濃度的顆粒物懸液后超聲震蕩15 min混勻，4℃保存，臨用前振蕩5 min使顆粒物充分混勻。

1.3動(dòng)物分組及模型制備 正常成年雄性Wistar大鼠72只，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重180～250 g。大鼠在正常飼料飼養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有大鼠隨機(jī)分成三組，每組24只，(1)正常組：不經(jīng)任何處理；(2)COPD組：大鼠第1、14天經(jīng)氣管內(nèi)注入1 g/L的內(nèi)毒素(美國(guó)Sigma公司)，第2～30天(第14天除外)將大鼠置入自制有機(jī)玻璃倉(cāng)內(nèi)，暴露于煙霧，每天上午同時(shí)點(diǎn)燃14支香煙，1 h/d，飼養(yǎng)6 w；(3) 1,25(OH)2D3+COPD組(合并組)：大鼠在COPD組基礎(chǔ)上同時(shí)給予1，25(OH)2D3口服制劑1 μg/d灌胃，飼養(yǎng)6 w。

1.4試驗(yàn)動(dòng)物染毒及支氣管肺泡灌洗

1.4.1COPD模型建立的確定和生理鹽水對(duì)照組的支氣管肺泡灌洗 隨機(jī)從三組各抽取6只大鼠作為生理鹽水對(duì)照組并確定COPD模型，采用氣管滴注37℃無菌生理鹽水的方法，氣管滴注量為1.5 ml/kg體重(bw)，每天滴注1次，連續(xù)3 d，在最后一次滴注24 h后取左肺緩慢注入37℃無菌生理鹽水3 ml進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，取灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)分類；腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，切取大鼠右側(cè)肺組織行病理光學(xué)顯微鏡檢查。

1.4.2染毒方法 將各組剩下的大鼠再分別分成三組每組6只，按不同的劑量，細(xì)顆粒物低劑量(PM2.5 1.6 mg/kg bw)、中劑量(PM2.5 8.0 mg/kg bw)、高劑量(PM2.5 40 mg/kg bw)，采用氣管滴注的染毒方式，氣管滴注量均按1.5 ml/kg bw染毒，每天染毒1次，連續(xù)3 d。

1.4.3染毒大鼠的支氣管肺泡灌洗 最后1次染毒24 h后，用10%水合氯醛(10 ml/kg)麻醉動(dòng)物，腹主動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，暴露氣管，夾閉右主支氣管，從氣管向左肺緩慢注入37℃無菌生理鹽水3 ml進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，反復(fù)3次，經(jīng)紗布過濾合并回收灌洗液，置于低溫離心機(jī)中離心，上清液置于-20℃低溫保存待測(cè)。

1.4.4肺灌洗液中IL-8、IL-17、TNF-α的測(cè)定 按試劑盒要求測(cè)定各組肺泡灌洗液中IL-8、IL-17、TNF-α的濃度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肺組織病理結(jié)果 正常組病理標(biāo)本經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色后顯示大鼠氣管、支氣管、肺泡結(jié)構(gòu)完整，細(xì)支氣管上皮無變性，肺泡腔內(nèi)無滲液。COPD組病理表現(xiàn)為支氣管狹窄、變性，肺泡腔擴(kuò)大，管壁內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜層杯狀細(xì)胞增多，部分細(xì)支氣管見平滑肌、膠原纖維增生。合并組也表現(xiàn)為炎性細(xì)胞增大，支氣管狹窄、變形，肺泡腔擴(kuò)大，但較COPD組輕。見圖1。

2.2各組肺泡灌洗液中IL-8、IL-17、TNF-α濃度 PM2.5對(duì)正常組、COPD組、合并組大鼠均產(chǎn)生急性毒性，且存在劑量反應(yīng)關(guān)系，COPD組肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α濃度明顯高于正常組(P<0.05)；經(jīng)1,25(OH)2D3干預(yù)，COPD組IL-8、TNF-α濃度低于COPD組，但仍高于正常組(P<0.05)。見表1～表3。

表1 各組肺泡灌洗液中IL-8濃度

表2 各組肺泡灌洗液中IL-17濃度

表3 各組肺泡灌洗液中TNF-α濃度

3 討 論

近年來，大氣污染日益加重，大氣細(xì)顆粒物(PM2.5)已成為影響我國(guó)多數(shù)城市空氣質(zhì)量的首要污染物〔5〕，PM2.5在呼吸道停留的時(shí)間是其致病的重要因素，沉積在肺間質(zhì)內(nèi)的PM2.5引發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)和氧化損傷可降低肺功能，增加哮喘及COPD的發(fā)病率〔6〕。

本研究結(jié)果提示IL-8、TNF-α參與COPD氣道炎癥，Crooks等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)COPD急性加重期痰IL-8水平升高，中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)志物——過氧化物酶(MPO)也升高，兩者呈正相關(guān)，提示IL-8可能涉及中性粒細(xì)胞的趨化和激活過程，過量的IL-8可誘發(fā)過度的炎癥反應(yīng)和組織損傷。本研究還提示PM2.5的沉積可加重COPD的氣道炎癥，1,25(OH)2D3對(duì)COPD氣道炎癥有部分保護(hù)作用，但作用有限，可能與樣本數(shù)量少等有關(guān)，可加大樣本量進(jìn)一步觀察。

本研究發(fā)現(xiàn)COPD組大鼠與合并組大鼠IL-17濃度較正常組亦稍有升高，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與大鼠氣道炎癥因子水平與人類COPD氣道炎癥不完全一致，或樣本量小有關(guān)，可繼續(xù)進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果提示PM2.5的毒性作用更傾向于在有基礎(chǔ)肺部炎癥疾病的機(jī)體上發(fā)生，而1，25(OH)2D3可減輕COPD氣道炎癥及損傷，在PM2.5染毒情況下補(bǔ)充1，25(OH)2D3對(duì)COPD患者的氣道炎癥仍部分具有改善作用。

1中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診斷指南(2007年修訂版)〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志，2007;46(1)：8-17.

2劉 倩，郝青林.幾種細(xì)胞因子在慢性阻塞性肺疾病形成機(jī)制中的相關(guān)研究〔J〕.國(guó)際呼吸雜志，2010;30(19)：1173-5.

3Wittke A，Weaver V,Mahon BD,etal.Vitamin D receptor-deficient mice fail to develop experimental allergic asthma〔J〕.J Immunol，2004;173(5)：3432-6.

4Hansdottir S,Monick MM,Hinde SL,etal.Respiratory epithelial cells convert inactive vitamin D to its active form:potential effects on host defense〔J〕.J Immunol,2008;181(10):7090-9.

5鄧芙蓉，郭新彪.我國(guó)機(jī)動(dòng)車尾氣污染及其健康影響研究進(jìn)展〔J〕.環(huán)境與健康雜志，2008;25(5)：174-6.

6Kulkarni N,Pierse N,Rushton L,etal.Carbon in airway macrophages and lung function in children〔J〕.N Engl J Med,2006;355(1):21-30.

7Crooks SW，Bayley DL，Hill SL，etal.Bronchial inflammation in acute bacterial exacerbations of chronic bronchitis：the role of leukotriene-B4〔J〕.Eur Respir J，2000;15(2)：274-80.

〔2017-03-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

R56

A

1005-9202(2017)19-4707-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.008

江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.20142BAB205013)

彭建萍(1972-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病的診斷與治療研究。