復(fù)方五指毛桃顆粒的提取工藝研究Δ

孫麗娜，劉小虹，劉建博，邵瑤昕，黃慧婷，張志強(qiáng)，王碩輝，王振華#（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州50006；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，廣州 50405；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園有限公司，廣州50445）

復(fù)方五指毛桃顆粒的提取工藝研究Δ

孫麗娜1＊，劉小虹1，劉建博2，邵瑤昕3，黃慧婷2，張志強(qiáng)1，王碩輝1，王振華1#（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園有限公司，廣州510445）

目的：優(yōu)化復(fù)方五指毛桃顆粒的提取工藝。方法：以復(fù)方五指毛桃顆粒提取液中補(bǔ)骨脂素、苦杏仁苷的轉(zhuǎn)移率及出膏率為指標(biāo)，采用U12（6×4×3）均勻設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)，考察加水倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素對(duì)提取工藝的影響，并通過(guò)3次放大試驗(yàn)對(duì)優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：優(yōu)化工藝為加10倍量水、提取3次、每次60 min。在此條件下，提取液中補(bǔ)骨脂素、苦杏仁苷的轉(zhuǎn)移率及出膏率分別為82.51%（RSD＝1.45%，n＝3）、93.69%（RSD＝0.85%，n＝3）、18.89%（RSD＝0.74%，n＝3），工藝驗(yàn)證結(jié)果均置于預(yù)測(cè)值的95%置信區(qū)間內(nèi)。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可行，為該制劑的后續(xù)開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

復(fù)方五指毛桃顆粒；均勻設(shè)計(jì)；提取工藝；補(bǔ)骨脂素；苦杏仁苷

復(fù)方五指毛桃顆粒由五指毛桃、茯苓、燀苦杏仁、炒紫蘇子等6味藥組成，常用于肺脾氣虛型穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病的治療，臨床療效顯著[1]。原方以煎劑內(nèi)服用于臨床，但煎煮、攜帶、使用均不方便。由于本方日服劑量較大、出膏多，根據(jù)處方的特點(diǎn)，現(xiàn)擬將這一臨床驗(yàn)方開發(fā)成顆粒，方便用藥。本文旨在以五指毛桃中補(bǔ)骨脂素及燀苦杏仁中苦杏仁苷的轉(zhuǎn)移率和出膏率為指標(biāo)，采用均勻設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)，對(duì)復(fù)方五指毛桃顆粒的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)制劑開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；MU4100P實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)（上海淼康實(shí)業(yè)公司）；HDM-1000數(shù)顯控溫電熱套（金壇市榮華儀器公司）；HH-6A數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）。

1.2 藥材、對(duì)照品與試劑

五指毛桃、茯苓、燀苦杏仁、炒紫蘇子、太子參及白術(shù)藥材飲片（均購(gòu)自廣州市藥材公司中藥飲片，批號(hào)分別為：YPA4A0001、YPA4D0001、YPA5D0001、YPA2F0001、YPA3A0001、YPA3C0001），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)王振華副教授鑒定及檢驗(yàn)：五指毛桃符合《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第二卷）》項(xiàng)下相應(yīng)規(guī)定，其他藥材均符合2015年版《中國(guó)藥典》（一部）項(xiàng)下相應(yīng)規(guī)定；補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（批號(hào)：110739-201416，純度：99.9%）、苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)：110820-201506，純度：93.4%）均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取液中苦杏仁苷的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 取苦杏仁苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為75.39 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 按處方比例稱取五指毛桃、茯苓、燀苦杏仁、炒紫蘇子等6味藥材共97 g，加8倍量水，加熱提取2次，每次1 h，合并濾液。精密量取水提液5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻、過(guò)濾，作為供試品溶液。

2.1.3 缺燀苦杏仁陰性樣品溶液制備 按處方比例稱取五指毛桃、茯苓、紫蘇子等5味藥材（缺燀苦杏仁）87 g，同“2.1.2”項(xiàng)下方法提取、制備成缺燀苦杏仁陰性樣品溶液。

2.1.4 色譜條件 參考文獻(xiàn)[2-3]確定色譜條件。色譜柱：YMC-Pack Pro C18RS（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水溶液（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：207 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)以苦杏仁苷峰計(jì)應(yīng)不低于6 000。

2.1.5 方法學(xué)考察 取上述3種溶液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果陰性樣品無(wú)干擾，專屬性良好，色譜圖見圖1。

圖1 苦杏仁苷高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of amygdalin

精密稱取苦杏仁苷對(duì)照品適量，加甲醇制備成質(zhì)量濃度為 9.42、18.85、37.70、75.39、113.09、150.78、188.48 μg/mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。以苦杏仁苷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝10 219x+2 370.2（r＝0.999 9），表明苦杏仁苷的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為9.42～188.48 μg/mL。按照相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果，在精密度試驗(yàn)中，對(duì)照品溶液峰面積的RSD為0.12%（n＝6）；重復(fù)性試驗(yàn)中供試品溶液峰面積的RSD為0.46%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗(yàn)中，供試品溶液放置16 h內(nèi)含量的RSD為0.13%（n＝6）；準(zhǔn)確度試驗(yàn)中平均加樣回收率為102.15%（RSD＝1.43%，n＝6）。

2.2 提取液中補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制備成質(zhì)量濃度為5.02 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 同“2.1.2”項(xiàng)下。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液制備 按處方比例稱取茯苓、燀苦杏仁、紫蘇子等5味藥材（缺五指毛桃）共67 g，同“2.1.2”項(xiàng)下方法提取、制備成缺五指毛桃陰性樣品。

2.2.4 色譜條件 參考文獻(xiàn)[4]確定色譜條件。色譜柱：YMC-Pack ODS-AM（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（30∶70，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)以補(bǔ)骨脂素峰計(jì)應(yīng)不低于8 000。

2.2.5 方法學(xué)考察 取上述3種溶液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果陰性樣品未見干擾，專屬性良好，色譜圖見圖2。

圖2 補(bǔ)骨脂素高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of psoralen

精密稱取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品適量，加甲醇制備成質(zhì)量濃度為0.50、1.00、2.01、5.02、8.02、12.04、15.04 μg/mL 的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。以補(bǔ)骨脂素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝77 006.9x+566.9（r＝0.999 9），表明補(bǔ)骨脂素的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.50～15.04 μg/mL。按照相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果，在精密度試驗(yàn)中，對(duì)照品溶液峰面積的RSD為0.13%（n＝6）；重復(fù)性試驗(yàn)中供試品溶液峰面積的RSD為0.31%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗(yàn)中供試品溶液放置16 h內(nèi)含量的RSD為0.16%（n＝6）；準(zhǔn)確度試驗(yàn)中平均加樣回收率為101.13%（RSD＝1.43%，n＝6）。

2.3 出膏率測(cè)定

精密量取后文均勻試驗(yàn)中的提取液50 mL，置于恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥至恒質(zhì)量，計(jì)算出膏率[（m1－m2）×V1/（V2×m）×100%，其中m為藥材量，m1為蒸發(fā)皿恒質(zhì)量與干膏質(zhì)量之和，m2為蒸發(fā)皿恒質(zhì)量，V1為提取液總體積，V2為量取的提取液體積]。

2.4 提取工藝均勻試驗(yàn)

2.4.1 因素與水平選擇 通常對(duì)中藥材提取影響比較大的因素有提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶劑量等，參考文獻(xiàn)[5-7]及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以提取液中補(bǔ)骨脂素、苦杏仁苷的轉(zhuǎn)移率[轉(zhuǎn)移率＝（ma/mb）×100%，ma為提取液中指標(biāo)成分含量，mb為處方對(duì)應(yīng)藥材中指標(biāo)成分含量（五指毛桃中補(bǔ)骨脂素含量為0.069%、燀苦杏仁中苦杏仁苷含量為2.99%）]及出膏率為指標(biāo)對(duì)以上述3個(gè)因素進(jìn)行考察，各因素的水平選取見表1。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

由于試驗(yàn)考察的因素水平較多，故采用均勻設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)。根據(jù)均勻設(shè)計(jì)方法[8]，按U12（6×4×3）設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)。

2.4.2 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 按處方比例稱取五指毛桃、茯苓、燀苦杏仁、炒紫蘇子等6味藥材共97 g，根據(jù)表1設(shè)計(jì)試驗(yàn)，加水提取、過(guò)濾、合并濾液。按“2.1”“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定提取液中苦杏仁苷和補(bǔ)骨脂素的含量并計(jì)算轉(zhuǎn)移率，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定出膏率，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 Design and results of uniform test

2.4.3 數(shù)據(jù)處理 以補(bǔ)骨脂素轉(zhuǎn)移率（Y1）、苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率（Y2）、出膏率（Y3），對(duì)加水倍量（X1）、提取時(shí)間（X2）、提取次數(shù)（X3）及X12、X22、X32采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行線性逐步多元回歸分析[9-10]（P＜0.05進(jìn)入，P＞0.1剔除）。結(jié)果如下：Y1＝17.272X1－0.882X12+0.09X2+65.172X3－11.692X32－99.558（R＝0.999 7，S＝1.97，F(xiàn)＝171.51，P＜0.01）；Y2＝0.182X12+0.332X2－ 0.003X22+41.028X3－6.384X32+3.096（R＝0.999 7，S＝1.34，F(xiàn)＝223.50，P＜0.01）；Y3＝0.044X2+8.731X3－1.386X32+2.802（R＝0.989 0，S＝0.55，F(xiàn)＝121.38，P＜0.01）

根據(jù)上述方程可知，X1、X3與Y1成二次函數(shù)關(guān)系，從提高補(bǔ)骨脂素轉(zhuǎn)移率角度考慮，當(dāng)X1＝10、X3＝3時(shí)Y1有較優(yōu)解；X2、X3與Y2也成二次函數(shù)關(guān)系，從提高苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率角度考慮，當(dāng)X2＝60、X3＝3時(shí)Y2有較優(yōu)解。綜合考慮，擬定的提取工藝條件為加10倍量水，提取3次，每次60 min。此時(shí)，Y1、Y2、Y3預(yù)測(cè)值分別為：Y1預(yù)＝80.65±3.86，Y2預(yù)＝96.06±2.63，Y3預(yù)＝19.16±1.08；Y預(yù)測(cè)＝Y(jié)方程±Uα×S[Uα（0.01）＝2.576，Uα（0.05）＝1.960]。

2.4.4 結(jié)果驗(yàn)證 按處方比例稱取五指毛桃、茯苓、燀苦杏仁、紫蘇子等6味藥材共485 g，各3份，加10倍量水，加熱提取3次，每次60 min，合并濾液，同“2.1”“2.2”“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定提取液中苦杏仁苷、補(bǔ)骨脂素含量并計(jì)算轉(zhuǎn)移率及出膏率，結(jié)果見表3。

表3 提取工藝驗(yàn)證結(jié)果Tab 3 Verification results of extraction technology

工藝驗(yàn)證結(jié)果表明，在優(yōu)化工藝條件下，補(bǔ)骨脂素、苦杏仁苷的平均轉(zhuǎn)移率及出膏率分別為82.51%（RSD＝1.45%，n＝3）、93.69%（RSD＝0.85%，n＝3）、18.89%（RSD＝0.74%，n＝3），實(shí)測(cè)值置于預(yù)測(cè)結(jié)果的95%置信區(qū)間內(nèi)，提示優(yōu)化后的工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

3.1 考察指標(biāo)的選擇

提取液化學(xué)成分中補(bǔ)骨脂素常被用作評(píng)價(jià)方中君藥五指毛桃質(zhì)量?jī)?yōu)劣的指標(biāo)[4，11-12]，苦杏仁苷為苦杏仁藥材中止咳平喘的有效成分[13]。因此，從質(zhì)量控制、藥理等方面分析，以二者的轉(zhuǎn)移率作為考察指標(biāo)均具有一定的意義；且二者極性差異大，能較全面地反映藥材被提取的程度。出膏率作為輔助性指標(biāo)，為劑型的選擇提供了依據(jù)。

提取液中苦杏仁苷既為藥效成分，也屬于內(nèi)源性毒性成分，含量過(guò)高時(shí)易導(dǎo)致氫氰酸中毒[14]。因本研究主要針對(duì)提取工藝，注重的是藥材被提取利用的程度，對(duì)于制劑中苦杏仁苷可能造成的毒性效應(yīng)，后期筆者將通過(guò)開展制劑的系統(tǒng)毒理學(xué)和藥理學(xué)研究，合理設(shè)計(jì)藥物臨床使用劑量，保證臨床用藥的安全性和有效性。

3.2 數(shù)據(jù)分析變量的引入

在進(jìn)行線性回歸預(yù)分析時(shí)，筆者曾選擇以Y1、Y2、Y3對(duì) 2 組分析變量[（X1、X2、X3、X12、X22、X32）、（X1、X2、X3、X12、X22、X32、X1X2、X2X3、X1X3、X1X2X3）]進(jìn)行了逐步回歸分析，結(jié)果前者擬合出的方程線性關(guān)系更好，引入方程的變量均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），因此在數(shù)據(jù)分析時(shí)，選擇了前者。

結(jié)合表2實(shí)測(cè)值及數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，加水量及提取次數(shù)2個(gè)因素對(duì)補(bǔ)骨脂素提取率有顯著影響，提取時(shí)間及提取次數(shù)2個(gè)因素對(duì)苦杏仁苷提取率有顯著影響，提取次數(shù)為二者共同的顯著性因素，故確定藥材提取3次。加水量為10倍量時(shí)補(bǔ)骨脂素提取效果最優(yōu)，提取時(shí)間為60 min時(shí)苦杏仁苷提取效果最優(yōu)。因此綜合各指標(biāo)考慮，確定工藝條件為藥材加10倍量水，提取3次，每次60 min。

本研究采用均勻設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)，使各試驗(yàn)在試驗(yàn)點(diǎn)范圍內(nèi)充分地均勻分散，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，選取對(duì)提取效率影響較大的溶劑倍量、提取時(shí)間及提取次數(shù)為因素，合理安排各因素水平，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，預(yù)測(cè)出最優(yōu)工藝條件參數(shù)。通過(guò)進(jìn)行3次放大驗(yàn)證工藝預(yù)測(cè)，得出補(bǔ)骨脂素、苦杏仁苷的平均轉(zhuǎn)移率及出膏率與均勻設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，優(yōu)化出了經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可行的提取工藝，可為復(fù)方五指毛桃顆粒的后續(xù)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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Study on the Extraction Technology of Compound Radix Fici Hirta Granule

SUN Lina1，LIU Xiaohong1，LIU Jianbo2，SHAO Yaoxin3，HUANG Huiting2，ZHANG Zhiqiang1，WANG Shuohui1，WANG Zhenhua1（1.College of TCM，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510006，China；2.Dept.of Respiratory，the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405，China；3.Science and Technology Park Co.，Ltd.，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510445，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Compound radix fici hirta granule.METHODS：Using the transfer rate of psoralen and amygdalin in extraction liquid of Compound radix fici hirta granule and extraction rate as indexes，U12（6×4×3）uniform design was used for the test，the effects of amount of adding water，extraction time，extraction times on the extraction technology were investigated，and optimized technology was verified by three pilot scale tests.RESULTS：The optimal technology was as follow as 10-fold water，extracting for 3 times，60 min each time.Under the conditions，transfer rate of psoralen and amygdalin and extraction rate were 82.51%（RSD＝1.45%，n＝3），93.69%（RSD＝0.85%，n＝3），18.89%（RSD＝0.74%，n＝3），respectively.The validated results were in the 95%confidence interval of predictive value.CONCLUSIONS：The optimized extraction technology is stable and feasible，and provides the scientific basis for the follow-up development of the preparation.

Compound radix fici hirta granule；Uniform design；Extraction technology；Psoralen；Amygdalin

R284.2

A

1001-0408（2017）28-3976-04

2017-01-25

2017-03-07）

（編輯：劉 萍）

廣東省中醫(yī)藥強(qiáng)省建設(shè)專項(xiàng)資金醫(yī)院中藥制劑建設(shè)項(xiàng)目（No.粵中醫(yī)辦函〔2015〕102號(hào)）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014B050-502013、2014B040404066、2015B020234003）

＊碩士研究生。研究方向：藥物新劑型、新技術(shù)。E-mail：1083532885@qq.com

#通信作者：副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：藥物新劑型、新技術(shù)。E-mail：wzh@gzucm.edu.cn

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.24