不同干燥方式對(duì)杜仲葉4種活性成分含量的影響Δ

鄭艷萍，潘艷瓊，秦昆明，徐虹#（.南京海昌中藥集團(tuán)有限公司，南京006；.江蘇省第二中醫(yī)院藥劑科，南京 006）

不同干燥方式對(duì)杜仲葉4種活性成分含量的影響Δ

鄭艷萍1＊，潘艷瓊2，秦昆明1，徐虹2#（1.南京海昌中藥集團(tuán)有限公司，南京210061；2.江蘇省第二中醫(yī)院藥劑科，南京 210061）

目的：考察不同干燥方式對(duì)杜仲葉中活性成分含量的影響，為建立杜仲葉在產(chǎn)地采收后的干燥加工方式提供參考。方法：取杜仲葉采用不同干燥方法[自然陰干72 h、自然曬干36 h、烘干（60℃6 h、80℃2 h、100℃1 h、120℃0.5 h）、微波真空冷凍干燥12 h、真空冷凍干燥12 h]對(duì)杜仲葉進(jìn)行處理；采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定樣品中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷的含量，并與未處理的鮮品進(jìn)行比較。結(jié)果：2種冷凍干燥后的樣品與鮮品中的4種成分含量接近，并高于其他干燥方式處理的樣品。結(jié)論：干燥方法對(duì)杜仲葉有效成分具有較顯著的影響，微波真空冷凍干燥和真空冷凍干燥較自然陰干、自然曬干、烘干更能保留杜仲鮮葉中的活性成分。

杜仲葉；桃葉珊瑚苷；京尼平苷酸；綠原酸；京尼平苷；干燥方式；微波真空冷凍干燥；真空冷凍干燥

杜仲葉為杜仲科杜仲屬植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）的干葉[1]。杜仲傳統(tǒng)以樹皮入藥，是中國(guó)自古以來的名貴滋補(bǔ)藥材[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，杜仲中有效成分對(duì)免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)均有不同程度的調(diào)節(jié)作用，還能興奮垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)，增強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)功能[3]。

由于杜仲傳統(tǒng)加工方式導(dǎo)致剝皮樹死，為保護(hù)杜仲植物資源，作為替代資源的杜仲葉的化學(xué)成分及藥理作用研究近年來已取得初步進(jìn)展。杜仲葉與傳統(tǒng)杜仲皮的化學(xué)成分和藥理作用極其相似，均具有降壓作用[4]。桃葉珊瑚苷是杜仲葉中重要的生物活性物質(zhì)，具有清濕熱、利尿、鎮(zhèn)痛、降壓、保護(hù)肝臟、抗腫瘤等作用，能促進(jìn)干細(xì)胞再生，顯著抑制乙型肝炎病毒DNA的復(fù)制[5]；杜仲葉中的活性成分京尼平苷酸具有消炎、利膽等功效，臨床用于降壓效果非常顯著[6]；杜仲葉中含量較高的活性成分之一綠原酸具有抗菌消炎、特殊的抗誘變及抗惡性腫瘤等多種藥理療效[7]；另一種活性成分京尼平苷對(duì)心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病均有獨(dú)特的療效，同時(shí)，京尼平苷還有抗炎和治療軟組織損傷的療效[8]。杜仲葉在產(chǎn)地采收以后需要干燥后儲(chǔ)存，傳統(tǒng)干燥方式以低溫烘干為主[9]，而近年來又出現(xiàn)多種新的干燥方式，如微波真空冷凍干燥和真空冷凍干燥等。為比較各干燥方式的效果，筆者在本試驗(yàn)中較系統(tǒng)地研究了杜仲葉經(jīng)自然陰干、自然曬干、烘干、冷凍干燥后，主要活性成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷的含量變化，比較各干燥工藝對(duì)杜仲葉主要活性成分的影響，為杜仲葉干燥方式的改進(jìn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AB高效液相色譜（HPLC）儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（DAD）（日本Shimadzu公司）；FA1104電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ3200DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：350 W，頻率：40 kHz）；TGL-16C離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；真空冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)儀器公司）；YHW-4S微波真空冷凍干燥機(jī)（南京亞泰微波能技術(shù)研究所）。

1.2 藥材、藥品與試劑

杜仲葉（于2016年7月采摘自北京林業(yè)科學(xué)研究院，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定為杜仲植物的新鮮葉）；桃葉珊瑚苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-11091601，純度：＞98%）、京尼平苷酸對(duì)照品（批號(hào)：MUST-11121502，純度：＞98%）均來自成都曼思特生物科技有限公司；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-200413，純度：＞98%）、京尼平苷對(duì)照品（批號(hào)：110749-200613，純度：＞98%）均來自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同干燥方式制備杜仲葉樣品

通過參考文獻(xiàn)[9]方法及預(yù)試驗(yàn)篩選，本試驗(yàn)采用以下幾種干燥方式。

2.1.1 自然陰干 取杜仲葉鮮品1份，50 g，于室內(nèi)通風(fēng)處自然陰干（72 h），備用，樣品編號(hào)S1。

2.1.2 自然曬干 取杜仲葉鮮品1份，50 g，于日光下曬干（36 h），備用，樣品編號(hào)S2。

2.1.3 烘干 取杜仲葉鮮品4份，每份50 g，分別平鋪于瓷托盤上，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，分別于60、80、100、120℃下加熱，各溫度下分別干燥6、2、1、0.5 h后取出，備用，樣品編號(hào)分別為S3、S4、S5、S6。

2.1.4 微波真空冷凍干燥 取杜仲葉鮮品1份，50 g，－40℃預(yù)凍后放入微波真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥（微波功率為700 W，冷阱溫度為－40℃，真空度為0.07 kPa），干燥12 h后取出，備用，樣品編號(hào)S7。

2.1.5 真空冷凍干燥 取杜仲葉鮮品1份，50 g，－40℃預(yù)凍后放入真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥（冷阱溫度為－45℃，真空度為0.06 kPa），干燥12 h后取出，備用，樣品編號(hào)S8。

2.1.6 未干燥 另取杜仲葉鮮品不作任何處理，樣品編號(hào)為S9。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

[10-13]確定色譜條件。色譜柱：YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。取“2.3”項(xiàng)下供試品（S7）溶液和混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。

由圖1可見，4個(gè)主成分的峰之間及與相鄰峰之間分離度均大于1.5，雜質(zhì)及其他成分不干擾主成分的測(cè)定。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液 參考文獻(xiàn)[12]方法制備。分別取不同干燥方式制得的杜仲葉樣品適量，粉碎后過3號(hào)篩；其中冷凍干燥的樣品，在干冰保護(hù)下研缽搗碎后過篩。取過篩粉末約1 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，加入20 mL石油醚超聲30 min，過濾棄去濾液；濾渣揮干，精密加入80%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷；再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm濾膜過濾；取續(xù)濾液，即得供試品溶液。新鮮杜仲葉取約4.1 g（相當(dāng)于干燥品1 g），剪碎后同法處理。

2.3.2 混合對(duì)照品溶液 分別精密制備質(zhì)量濃度為2.1 mg/mL的桃葉珊瑚苷、0.72 mg/mL的京尼平苷酸、0.692 mg/mL的綠原酸和1.4 mg/mL的京尼平苷的甲醇對(duì)照品溶液，分別吸取0.5、1、1、0.5 mL置于5 mL量瓶中，用甲醇定容，即得混合對(duì)照品溶液。

2.4 線性關(guān)系與定量限考察

精密量取混合對(duì)照品溶液 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加80%甲醇定容至刻度，搖勻。將上述制備好的不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品的峰面積（y）對(duì)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。以各化合物的信噪比等于10時(shí)的相應(yīng)質(zhì)量濃度確定定量限（LOQ），結(jié)果見表2。

表2 4種成分的線性關(guān)系和定量限Tab 2 Linear relationship and LOQ of 4 ingredients

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄保留時(shí)間和峰面積。計(jì)算得桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷峰面積的RSD分別為4.56%、2.34%、4.72%、2.71%（n＝6），保留時(shí)間的RSD分別3.03%、2.64%、3.88%、1.48%（n＝6）。結(jié)果表明，該儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取S7樣品粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算得桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷含量的RSD分別為2.37%、1.79%、1.70%、4.17%（n＝6），保留時(shí)間的RSD分別為1.15%、0.83%、0.79%、1.04%（n＝6）。結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S7樣品的供試品溶液，分別在放置0、1、6、12、18、24 h后進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積和保留時(shí)間。結(jié)果桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷峰面積的RSD分別為 3.70%、1.03%、3.04%、3.69%（n＝6），保留時(shí)間的RSD分別為 2.35%、3.73%、2.73%、3.22%（n＝6）。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取已測(cè)定含量的S7樣品6份，精密稱定，分別精密加入一定量的桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷平均加樣回收率分別為98.61%、98.56%、99.50%、101.28%，RSD分別為1.82%、3.25%、1.80%、1.47%（n＝6）。

2.9 樣品中4種成分含量測(cè)定

取9種樣品制備的供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷的含量（以干燥品計(jì)）。各數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)行多重比較，分析采用LSD法。結(jié)果見表3。

表3 樣品中4種成分含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3 Determination results of 4 ingredients of samples（n＝3，mg/g）

通過表3可知，除S1、S2外，各干燥樣品中京尼平苷含量與鮮葉比較變化不大；S7、S8與鮮葉中4種成分的含量均接近，并高于其他方式干燥后的樣品。

3 討論

本試驗(yàn)在考察杜仲葉的自然陰干、曬干、烘干、冷凍干燥工藝的基礎(chǔ)上，建立了同時(shí)測(cè)定杜仲葉中4種活性成分即桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷含量的HPLC法，并對(duì)不同干燥方式的效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，本文建立的含量測(cè)定方法重復(fù)性好、可操作性強(qiáng)，所測(cè)結(jié)果比較全面、直觀地反映了不同干燥方式處理后的杜仲葉中4種活性成分的差異，可用于杜仲葉藥材的功效成分定量研究及質(zhì)量控制。

筆者在前期試驗(yàn)中分別比較了不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇、80%甲醇、乙醇、50%乙醇、80%乙醇）、不同提取方法（超聲、回流、索氏提取等）、不同流動(dòng)相組成（乙腈-0.2%乙酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.2%乙酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液）條件下的提取效果，以及在HPLC-DAD全波段190～800 nm波長(zhǎng)下的掃描結(jié)果。結(jié)果顯示，提取溶劑為80%甲醇時(shí)被測(cè)成分提取率最高；3種提取方法的效果相近，但因超聲方法簡(jiǎn)單易行，故選取超聲提??；流動(dòng)相選擇乙腈-0.2%磷酸水溶液、檢測(cè)波長(zhǎng)在200 nm時(shí)，被測(cè)成分分離度好、干擾小、色譜圖基線平穩(wěn)。

真空冷凍干燥機(jī)和微波真空冷凍干燥機(jī)一次干燥最大容量為1.2 L，因?yàn)槎胖偃~體積較大，所以每次干燥量一般約為50 g。與真空冷凍干燥機(jī)比較，微波真空冷凍干燥機(jī)增加了微波功能，而微波可以穿透物料，可以在物料內(nèi)部形成均勻的內(nèi)熱源，補(bǔ)充了物料凍干所需能量，故其干燥時(shí)間縮短。真空冷凍干燥機(jī)由于沒有微波功能，故其冷凍效率更低，若要達(dá)到相同的冷凍效果就要降低冷凍溫度，因此本試驗(yàn)中真空冷凍干燥溫度設(shè)置為－45℃，由于溫度低，真空度只能達(dá)到0.06 kPa。

通過比較9種杜仲葉樣品中活性成分的含量發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)地、品種、采收時(shí)間等因素都相同的情況下，采取不同的干燥方式制得的杜仲葉樣品活性成分含量相差較大，與文獻(xiàn)結(jié)論[14-15]一致。桃葉珊瑚苷和綠原酸在烘干方式下，隨著烘干溫度升高，含量降低，尤其以桃葉珊瑚苷含量變化尤為明顯，可能與這2種成分的熱穩(wěn)定性差有很大的關(guān)系。2種真空冷凍干燥處理后的樣品，其中的活性成分含量與鮮葉樣品最接近，表明冷凍干燥工藝更能保留杜仲葉的活性成分。

為提高杜仲葉藥材的有效利用率，必須選擇高效、穩(wěn)定、可靠的干燥方式并加以規(guī)范操作，才能更有效地利用藥材資源。本研究為篩選適用于杜仲葉的產(chǎn)地干燥方式、提高和控制杜仲葉藥材質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

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Effects of Different Drying Methods on Contents of 4 Active Ingredients in Leaves of Eucommia ulmoides

ZHENG Yanping1，PAN Yanqiong2，QIN Kunming1，XU Hong2（1.Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co.，Ltd.，Nanjing 210061，China；2.Dept.of Pharmacy，Jiangsu Second TCM Hospital，Nanjing 210061，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of different drying methods on contents of active ingredients in leaves of Eucommia ulmoides，and provide reference for establishing its drying methods after habitat harvesting.METHODS：Different drying methods[natural drying in the shade for 72 h，natural drying in the sunlight for 36 h，drying beside or over a fire（60℃ 6 h，80℃ 2 h，100℃ 1 h，120℃ 0.5 h），microwave vacuum freeze drying for 12 h，vacuum freeze drying for 12 h]were used for processing.HPLC was conducted to determine the contents of aucubin，geniposidic acid，chlorogenic acid and geniposide in samples and compare with the untreated fresh products.RESULTS：Contents of 4 ingredients in samples after the 2 freeze drying were close to these in fresh samples，which were higher than samples after other drying.CONCLUSIONS：Drying methods show significant effects on the effective ingredients in leaves of E.ulmoides.Compared with natural drying in the shade and natural drying sunlight and drying beside or over a fire，microwave vacuum freeze drying and vacuum freeze drying can make better retention of the active ingredients in fresh leaves of E.ulmoides.

Leaves of Eucommia ulmoides；Aucubin；Geniposidic acid；Chlorogenic acid；Geniposide；Drying method；Microwave vacuum freeze drying；Vacuum freeze drying

R283

A

1001-0408（2017）28-3973-04

2017-01-05

2017-04-20）

（編輯：劉 萍）

國(guó)家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)專項(xiàng)——30味中藥飲片產(chǎn)地加工及飲片生產(chǎn)一體化研究（No.201507002-2）

＊助理研究員，碩士。研究方向：中藥分析與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：zyp611@163.com

#通信作者：副主任中藥師。研究方向：中藥制劑與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：2541999692@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.23