響應(yīng)面法優(yōu)化梔子中總多酚、總黃酮的提取工藝Δ

黃 瀟，劉 婧，彭水梅，劉德鴻，付小梅，裴建國(guó)，吳志瑰（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330004）

·制劑與工藝·

響應(yīng)面法優(yōu)化梔子中總多酚、總黃酮的提取工藝Δ

黃 瀟＊，劉 婧，彭水梅，劉德鴻，付小梅#，裴建國(guó)，吳志瑰（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330004）

目的：優(yōu)化梔子中總多酚、總黃酮的提取工藝。方法：通過(guò)Plackett-burman（PB）設(shè)計(jì)篩選乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、藥材粒徑、提取時(shí)間、提取溫度5個(gè)因素中對(duì)梔子總多酚、總黃酮提取的關(guān)鍵影響因素，再采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)提取工藝中關(guān)鍵影響因素進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：梔子總多酚的最優(yōu)提取條件為40%乙醇、藥材粒徑0.20 mm、提取溫度60℃、液料比20倍、提取時(shí)間20 min；總黃酮的最優(yōu)提取條件為40%乙醇、藥材粒徑0.20 mm、提取溫度30℃、液料比20倍、提取時(shí)間20 min。驗(yàn)證試驗(yàn)中梔子總多酚、總黃酮的含量分別為1.70%（RSD＝1.43%，n＝3）、3.23%（RSD＝3.72%，n＝3），與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差分別為1.80%、8.75%。結(jié)論：采用基于PB和星點(diǎn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法優(yōu)化梔子總多酚、總黃酮的提取工藝簡(jiǎn)便、合理、可行，本方法可為其工業(yè)化提取提供參考。

梔子；多酚；黃酮；Plackett-burman設(shè)計(jì)；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法；提取工藝；優(yōu)化

梔子為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥成熟果實(shí)，被歷版《中國(guó)藥典》收載。國(guó)內(nèi)外學(xué)者從梔子中發(fā)現(xiàn)了近80個(gè)黃酮類及多酚類化合物[1-2]，而這2類化合物多開(kāi)發(fā)為天然的抗氧化劑[3-4]。為深度開(kāi)發(fā)梔子這一江西道地藥材，本研究聯(lián)用Placket-burman（PB）-星點(diǎn)設(shè)計(jì)（Central composite design，CCD），通過(guò)響應(yīng)面法分析優(yōu)化梔子中黃酮類及多酚類化合物的提取工藝，為梔子的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

KQ-250超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；BS224S電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；116搖擺式粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；UV-2100紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.2 藥材、對(duì)照品與試劑

梔子（購(gòu)自江西樟樹(shù)天齊堂中藥飲片有限公司，批號(hào)：20140708，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)范崔生教授鑒定為梔子的果實(shí)，憑證標(biāo)本存于江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)科組）；沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110813-201204，純度：98.50%）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：11040302，純度：98.32%）均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子總多酚的測(cè)定方法

2.1.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線與方法學(xué)考察 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中，用80%乙醇稀釋至刻度，分別精密吸取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于10 mL量瓶中，加水至4.0 mL，再加入2 mL福林酚試劑，搖勻，靜置5 min；再加入10%碳酸鈉溶液2 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，避光放置120 min，于764 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[5]。以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y＝0.095x－0.103（R2＝0.998 0），表明沒(méi)食子酸質(zhì)檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為3～8μg/mL。按相關(guān)方法學(xué)考察方法操作，精密度試驗(yàn)中吸光度的RSD＝0.09%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗(yàn)中樣品溶液室溫放置8 h含量的RSD＝0.29%（n＝6）；分別按80%、100%、120%精密加入適量沒(méi)食子酸對(duì)照品的樣品溶液的平均回收率分別為98.94%、97.83%、98.90%（RSD＝2.24%，n＝3）。上述試驗(yàn)結(jié)果提示，本含量測(cè)定方法均符合相關(guān)方法學(xué)要求。

2.1.2 梔子總多酚的測(cè)定 精密稱取梔子粉末0.5 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入20 mL 80%乙醇溶液，超聲提取20 min（頻率：40 kHz，功率：250 W），取出，放至室溫，離心20 min（3 000 r/min，離心半徑為6.5 cm）。取上清液置于10 mL量瓶中，加水至4.0 mL，先加入2 mL福林酚試劑，搖勻，靜置5 min；再加入2 mL 10%碳酸鈉溶液，用水定容至刻度，搖勻，避光放置120 min。于764 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算梔子總多酚含量，每組試驗(yàn)平行3次。

2.2 梔子總黃酮的測(cè)定方法

2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線與方法學(xué)考察 精密稱取蘆丁對(duì)照品6.2 mg，置于25 mL量瓶中，用80%乙醇稀釋至刻度，分別精密吸取1.3、1.6、1.9、2.1、2.4、2.8 mL置于10 mL量瓶中（不足2.4 mL者加水至2.4 mL），先加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；然后加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；最后加入4.3%氫氧化鈉溶液4.0 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，于508 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[6]。以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y＝12.056x－0.148 5（R2＝0.999 6），表明蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為32.24～69.44 μg/mL。按相關(guān)方法學(xué)考察方法操作，精密度試驗(yàn)中吸光度的RSD＝0.12%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗(yàn)中樣品溶液室溫放置8 h含量的RSD＝0.35%（n＝6）；分別按80%、100%、120%精密加入適量蘆丁對(duì)照品的樣品溶液的平均回收率分別為98.12%、97.93%、98.45%（RSD＝2.09%，n＝3）。上述試驗(yàn)結(jié)果提示，本含量測(cè)定方法均符合相關(guān)方法學(xué)要求。

2.2.2 梔子總黃酮的測(cè)定 精密稱取梔子粉末0.5 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入20 mL的80%乙醇溶液，超聲提取20 min（頻率：40 kHz，功率：250 W），取出，放至室溫，離心20 min（3 000 r/min，離心半徑為6.5 cm）。取上清液置于10 mL量瓶中，加水至2.4 mL，先加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；最后加入4.3%氫氧化鈉溶液4 mL，用水定容至刻度，搖勻，放置10～15 min。于508 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算梔子總黃酮的含量，每組試驗(yàn)平行3次。

2.3 梔子總多酚和總黃酮提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 提取方法 精密稱取一定量的已過(guò)工業(yè)篩的梔子粉末（根據(jù)不同目數(shù)的工業(yè)篩來(lái)篩選出不同粒徑大小的梔子粉末），置于具塞錐形瓶中，加入一定量的不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，用鐵架臺(tái)固定于超聲清洗器中，在保持超聲清洗器中一定的提取水溫的情況下（即提取溫度），超聲提取一定時(shí)間，過(guò)濾，收集提取液備用。

2.3.2 PB設(shè)計(jì) 查閱文獻(xiàn)[7-8]，分別設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、液料比（X2）、藥材粒徑（X3）、提取時(shí)間（X4）及提取溫度（X5）5個(gè)考察因素。在前期的單因素試驗(yàn)中每個(gè)因素均考察了5個(gè)水平。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，得到各因素的取值范圍為X1：40%～80%，X2：10～30倍[加醇量（mL）∶梔子質(zhì)量（g）]，X3：0.20～1.45 mm，X4：10～30 min，X5：30～70℃。以總多酚含量[TPC，即總多酚質(zhì)量（g）/梔子質(zhì)量（g）×100%]及總黃酮含量[TFC，即總黃酮質(zhì)量（g）/梔子質(zhì)量（g）×100%]為指標(biāo)，用Design Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。PB試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 PB試驗(yàn)的因素與水平Tab 1 Factors and levels in PB test

表2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 PB test design and results

表3 PB試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis of PB test

從表3可知，各因素對(duì)TFC影響大小為X3＞X1＞X5＞X2＞X4；對(duì) TPC 影 響 大 小 為 ：X3＞X5＞X1＞X4＞X2。對(duì)5個(gè)因素進(jìn)行回歸分析和檢驗(yàn)得知：X2、X4、X5與TPC、TFC響應(yīng)值均具有正相關(guān)性；X3對(duì)這2個(gè)指標(biāo)的響應(yīng)值均具有極顯著影響；X1、X5對(duì)響應(yīng)值具有顯著影響；X2、X4對(duì)響應(yīng)值均不具有顯著影響。

綜合考慮，將乙醇體積分?jǐn)?shù)、藥材粒徑、提取溫度這3個(gè)顯著因素作為星點(diǎn)設(shè)計(jì)中的因素；而液料比和提取時(shí)間這2個(gè)非顯著因素不再進(jìn)一步優(yōu)化，而直接采用PB試驗(yàn)中的0水平，即分別為20倍、20 min。

2.3.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì) 根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果分析，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、藥材粒徑（X3）、提取溫度（X5）為考察變量，以TPC、TFC為指標(biāo)，進(jìn)一步采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)對(duì)梔子提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)包括12個(gè)析因試驗(yàn)和3個(gè)中心試驗(yàn)（估計(jì)誤差）。在星點(diǎn)設(shè)計(jì)中每個(gè)因素取3個(gè)水平，以[－l，0，1]表示；試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到帶交互項(xiàng)和平方項(xiàng)的二次方程；分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定的水平范圍內(nèi)求出最佳值。星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素與水平見(jiàn)表4，星點(diǎn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素與水平Tab 4 Factor and levels in CCD test

表5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 5 CCD test design and results

應(yīng)用Design Expert 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸，經(jīng)回歸擬合后，各影響因素對(duì)各響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示（Y1為 TPC，Y2為 TFC）：Y1＝1.22－0.17X1－0.32X3+0.13X5－0.041X1X3+0.032X1X5+0.055X3X5－0.055X12+0.15X32－ 0.055X52（R12＝0.846 5）；Y2＝2.19 －0.36X1－0.28X3+0.09X5－0.27X1X3+0.22X1X5+0.25X3X5+0.12X12+0.049X32－0.14X52（R22＝0.865 7）。

對(duì)回歸方程和方程的各因子進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)與方差分析結(jié)果Tab 6 Results of significance test of the regression equation and variance analysis

根據(jù)方差分析結(jié)果得知，各模型方程P值均小于0.01，即表明指標(biāo)值與自變量的多元回歸關(guān)系極其顯著，且失擬值均不顯著（P＞0.05），表明試驗(yàn)相對(duì)于純誤差不具有顯著性，模型合適。因此可以利用以上方程對(duì)梔子中總多酚、總黃酮的提取進(jìn)行預(yù)測(cè)。

對(duì)于TPC模型方程，其R12＝0.846 5，表明Y1方程擬合情況較好（R2值＞0.7即認(rèn)為該方程擬合較好）。并且從方差結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，X1、X3、X5對(duì)TPC具有顯著影響（P＜0.05），但是各因素之間的交互作用影響不明顯（P＞0.05）。

對(duì)TFC模型方程，其R22＝0.865 7，表明Y2方程擬合情況較好。并且從方差結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，X1、X3、X1X3、X1X5以及X3X5對(duì)TFC具有顯著影響（P＜0.05）。

2.3.4 響應(yīng)面分析 利用Design Expert 7.0軟件作出各因素之間交互作用的等高線圖及響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖1、圖2。

由圖1可知，各因素對(duì)TPC的影響大小依次為X3＞X1＞X5，因此減小藥材粒徑、增加乙醇體積分?jǐn)?shù)、升高提取溫度，都可使TPC響應(yīng)值增加。3個(gè)因素的等高線并沒(méi)有趨向橢圓，故無(wú)交互作用。

由圖2可知，對(duì)TFC的影響大小依次為X1＞X3＞X5，X3、X1的等高線趨向于橢圓，故兩者有交互作用。當(dāng)X5固定為50℃、X2固定為20倍、X1固定在40%～80%范圍中任一值的條件下，X3在0.20～1.45 mm范圍內(nèi)，隨著粒徑減少TFC逐漸增加。同樣，若其他條件都固定，而X1值在40%～80%范圍內(nèi)，隨著X1的升高，TFC響應(yīng)值逐漸增加。

2.3.5 最優(yōu)工藝條件的確定和模型的驗(yàn)證 通過(guò)Design Expert 7.0數(shù)據(jù)分析軟件得出回歸模型，預(yù)測(cè)出總多酚的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，藥材粒徑0.20 mm、提取溫度57.87℃。預(yù)測(cè)梔子TPC為1.67%?？紤]到試驗(yàn)的可操作性，將提取溫度優(yōu)化為60℃?？傸S酮的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、藥材粒徑0.20 mm、提取溫度30℃。預(yù)測(cè)梔子TFC為2.97%。

為了對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，在以上最優(yōu)提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，共進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。精密稱取500 g粒徑為0.20 mm的梔子粉末，加入40%乙醇溶液，液料比為20倍，提取水溫控制為60℃，超聲提取20 min，結(jié)果梔子TPC平均值為1.70%（RSD＝1.43%，n＝3）。精密稱取500 g粒徑為0.20 mm的梔子粉末，加入40%乙醇溶液，液料比為20倍，提取水溫控制為30℃，超聲提取20 min，結(jié)果TFC平均值為3.23%（RSD＝3.72%，n＝3）。二者與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差分別為1.80%、8.75%，提示建立的最優(yōu)提取條件穩(wěn)定、可靠。

圖1 各因素對(duì)TPC的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig 1 Contours plots and response surfaces of each factor on TPC

3 討論

PB設(shè)計(jì)法是一種通過(guò)N次試驗(yàn)可以研究最多K＝N－1個(gè)變量（N一般為4的倍數(shù)）的2水平的試驗(yàn)方法，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素，供進(jìn)一步研究用。本試驗(yàn)采用PB設(shè)計(jì)方法對(duì)影響梔子中總多酚、總黃酮提取的5個(gè)因素即乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、藥材粒徑、提取時(shí)間及提取溫度進(jìn)行篩選，快速地優(yōu)化出3個(gè)關(guān)鍵的影響因素即乙醇體積分?jǐn)?shù)、藥材粒徑、提取溫度，為CCD-響應(yīng)面法的最優(yōu)提取工藝的研究提供了基礎(chǔ)。

圖2 各因素對(duì)TFC的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig 2 Contours plots and response surfaces of each factor on TFC

江西是梔子的道地產(chǎn)區(qū)，也是《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GAP）產(chǎn)地。梔子中主要含有環(huán)烯醚萜類、西紅花苷類、三萜類、有機(jī)酸類、黃酮類、多酚類等成分。歷來(lái)文獻(xiàn)主要對(duì)梔子中環(huán)烯醚萜類尤其是對(duì)其中的京尼平苷的分析測(cè)定較多，其次是對(duì)西紅花苷類的含量測(cè)定，對(duì)酚酸類僅有極少量報(bào)道，如綠原酸、熊果酸、藏紅花酸的含量測(cè)定[9-11]。有關(guān)梔子的總多酚、總黃酮的含量及提取工藝研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)通過(guò)聯(lián)用PB-CCD設(shè)計(jì)方法進(jìn)行梔子中總多酚、總黃酮成分的提取工藝研究，首先利用PB設(shè)計(jì)方法對(duì)提取過(guò)程中的因素進(jìn)行篩選，再利用CCD-響應(yīng)面法優(yōu)化最終提取工藝參數(shù)，建立具有較高預(yù)測(cè)性的提取模型，為今后對(duì)梔子總多酚、總黃酮的工業(yè)提取制備提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

多酚類和黃酮類化合物具抗氧化、清除自由基、抗衰老、降血脂、降血壓、降血糖、抗癌、鎮(zhèn)痛、免疫、抗炎、抗菌等作用[12-14]。合成的抗氧化劑如叔丁基羥基茴香、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚、叔丁基對(duì)苯二酚因具有毒性而被限制使用[15]。因此，從植物中尋找安全、天然的抗氧化劑成為研究熱點(diǎn)。本試驗(yàn)研究結(jié)果為梔子開(kāi)發(fā)成天然的抗氧化劑提供了一定的科學(xué)基礎(chǔ)，為促進(jìn)江西道地藥材梔子資源的充分利用與深度開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of Extraction Technology of Total Polyphenols and Total Flavonoids in Gardenia jasminoides by Response Surface Method

HUANG Xiao，LIU Jing，PENG Shuimei，LIU Dehong，F(xiàn)U Xiaomei，PEI Jianguo，WU Zhigui（School of Pharmacy，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of total polyphenol and total flavonoid in Gardenia jasminoides.METHODS：Plackett-burman（PB）design was used to select the ethanol volume fraction，liquid-solid ratio，particle size，extraction time and extraction temperature to determine the key factor affecting the extraction of total polyphenol and total flavonoids in G.jasminoides.Then central composite design（CCD）was combined with response surface method to optimize the extraction technology，and verification test was conducted.RESULTS：The optimal extraction conditions of total polyphenol were 40%ethanol，particle size of 0.20 mm，extraction temperature of 60℃，liquid-solid ratio of 20，and extraction time of 20 min；the optimal extraction conditions of total flavonoids were 40%ethanol，particle size of 0.20 mm，extraction temperature of 30℃，liquid-solid ratio of 20，and extraction time of 20 min.In verification test，the contents of total polyphenol and total flavonoids in G.jasminoi-des were 1.70%（RSD＝1.43%，n＝3），3.23%（RSD＝3.72%，n＝3），with relative error of 1.80%，8.75%with predicted values，respectively.CONCLUSIONS：The response surface method based on PB and CCD is simple，reasonable and feasible to optimize the extraction technology of total polyphenol and total flavonoids in G.jasminoides.The method can provide reference for its industrial extraction.

Gardenia jasminoides；Polyphenol；Flavonoid；Plackett-burman design；Central composite design；Response surface method；Extraction technology；Optimization

R284.2

A

1001-0408（2017）28-3964-05

2017-03-10

2017-05-22）

（編輯：劉 萍）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81360620）

＊講師，碩士。研究方向：中藥制劑。電話：0791-87118645。E-mail：54682090@qq.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)。電話：0791-87118993。E-mail：smilefxm@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.21