頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析川芎酒炙前后的揮發(fā)性成分

曹 利，盧金清，葉 欣，王 樊（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/湖北省藥用植物研發(fā)中心，武漢 430065）

頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析川芎酒炙前后的揮發(fā)性成分

曹 利＊，盧金清#，葉 欣，王 樊（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/湖北省藥用植物研發(fā)中心，武漢 430065）

目的：比較川芎生品和酒炙品揮發(fā)性成分的差異，為川芎的藥理活性研究及臨床應(yīng)用提供參考。方法：采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析川芎酒炙前后的揮發(fā)性成分，并運(yùn)用面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)百分含量。結(jié)果：從川芎生品中分離出28個(gè)成分，鑒定出24個(gè)成分，占總揮發(fā)性成分的99.70%，含量較高的分別為2-甲基-2，3-二氫-1H-茚-2-醇（20.06%）、α-芹子烯（17.97%）及4-乙基-壬烯-5-炔（9.24%）。從川芎酒炙品中分離出21個(gè)成分，鑒定出18個(gè)成分，占總揮發(fā)性成分的89.74%，含量最高的為4-乙基-壬烯-5-炔（12.97%），其次為4-蒈烯（11.74%）和α-芹子烯（10.79%）；與生品相比，有效鎮(zhèn)痛成分α-蒎烯、β-欖香烯含量有所增加。結(jié)論：川芎酒炙前后揮發(fā)性成分及相對(duì)百分含量存在一定差異，酒炙后揮發(fā)性成分相對(duì)減少，但有鎮(zhèn)痛作用的成分含量增加，鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于生品。

川芎；生品；酒炙品；揮發(fā)性成分；頂空固相微萃?。粴赓|(zhì)聯(lián)用

川芎為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，屬栽培植物，主產(chǎn)于四川灌縣，在云南、貴州、廣西等地均有栽培，生長(zhǎng)于溫和氣候環(huán)境。川芎性辛、溫，歸肝、膽、心包經(jīng)，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛之功效，主要用于治療胸痹心痛、胸脅刺痛、跌撲腫痛、閉經(jīng)痛經(jīng)、頭痛、風(fēng)濕痹痛、癥瘕腹痛[1]。

川芎生品中含有揮發(fā)油、生物堿、有機(jī)酸、多糖等化學(xué)成分。揮發(fā)性成分是揮發(fā)油的主要組成部分，而揮發(fā)油是川芎中重要的活性物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理研究表明，川芎揮發(fā)油不僅可解痙，而且對(duì)缺血性腦血管疾病療效顯著；除此之外，其還具有抗凝血、解熱鎮(zhèn)痛等作用[3]。中醫(yī)認(rèn)為，酒炙能改變藥性、引藥上行，或能增強(qiáng)活血通絡(luò)作用，或能矯臭去腥。與川芎生品相比，川芎酒炙品顏色較深，氣味較淡，且鎮(zhèn)痛、活血、調(diào)經(jīng)的作用更優(yōu)[4]，臨床上多用于治療疼痛病癥[5]。目前，川芎化學(xué)成分研究主要集中于揮發(fā)油、生物堿、有機(jī)酸、多糖等，揮發(fā)性成分的分析及鑒定涉及較少，且尚未見(jiàn)川芎生品和酒炙品揮發(fā)性成分的比較研究。因此，筆者在本研究中采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析川芎酒炙前后揮發(fā)性成分的變化，為后續(xù)藥理活性研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，考察酒炙對(duì)川芎中揮發(fā)性成分的組成和相對(duì)百分含量的影響，為川芎的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為其進(jìn)一步研究及綜合開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent6890/MS5973型GC-MS儀（美國(guó)Agilent公司）；65 μm 聚二甲基硅氧烷（PDMS）-二乙烯基苯（DVB）萃取頭、100 μm PDMS萃取頭（美國(guó)Supelco公司）；ALC-210.2型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.2 藥材與試劑

川芎生品購(gòu)于湖北聚瑞中藥飲片有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室張秀橋教授鑒定為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖；黃酒（浙江古越龍山紹興酒股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 川芎酒炙品的制備

參照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）0213炮制通則中的炮制方法。取100 g川芎生品，加10 g黃酒拌勻、悶透，置炒制容器內(nèi)，用文火炒至表面微黃時(shí)取出，放涼，備用。

2.2 GC-MS色譜與質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初始溫度50 ℃，以15℃/min升溫至70℃，保留1 min，以7℃/min升溫至110℃，以20℃/min升溫至160℃，以15℃/min升溫至190℃，保留2 min；進(jìn)樣口溫度：230℃；載氣：高純氦氣（純度：99.999%）；載氣流速：0.8 mL/min。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：電子轟擊（EI）源；離子源溫度：230℃；四級(jí)桿溫度：150℃；接口溫度：280℃；電子能量：70 eV；倍增管電壓：1.2 kV；質(zhì)荷比（m/z）范圍：35～550。

2.3 GC條件的優(yōu)化

2.3.1 萃取纖維頭的選擇 取川芎生品粗粉1.5 g，在100℃下平衡20 min后，再壓縮手柄伸出萃取頭萃取10 min，分別考察65 μm PDMS-DVB和100 μm PDMS兩種萃取頭對(duì)川芎生品揮發(fā)性成分的萃取能力。按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，以樣品中主要揮發(fā)性成分2-甲基-2，3-二氫-1H-茚-2-醇、α-芹子烯和 4-乙基-壬烯-5-炔的峰面積來(lái)評(píng)價(jià)這2種萃取頭效果。結(jié)果，65 μm PDMS-DVB萃取頭對(duì)這3種化合物的響應(yīng)均優(yōu)于100 μm PDMS萃取頭，故選用65 μm PDMS-DVB萃取頭。2種萃取頭對(duì)川芎生品中3種主要成分峰面積的響應(yīng)結(jié)果詳見(jiàn)圖1。2.3.2 取樣量的優(yōu)化 分別精密稱取川芎生品粗粉0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g，在100 ℃下平衡20 min后，再壓縮手柄伸出65 μm PDMS-DVB萃取頭萃取10 min，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，當(dāng)取樣量≥2.0 g時(shí)，萃取吸附量達(dá)到飽和，故2.0 g為最佳取樣量。取樣量-總峰面積關(guān)系圖見(jiàn)圖2A。

圖1 2種萃取頭對(duì)川芎生品中3種主要成分峰面積的響應(yīng)結(jié)果Fig 1 Response results of 2 extraction heads on peak areas of 3 main components in the raw products of L.chuanxiong

圖2 頂空固相微萃取條件優(yōu)化的單因素考察結(jié)果Fig 2 Investigation results of single factor optimized by headspace solid phase microextraction conditions

2.3.3 萃取溫度的優(yōu)化 精密稱取川芎生品粗粉2.0 g，在其他條件不變的情況下，分別在80、90、100、110、120℃條件下對(duì)川芎生品粗粉進(jìn)行萃取，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，溫度為100℃時(shí)，能達(dá)到最佳萃取效果。萃取溫度-總峰面積關(guān)系圖見(jiàn)圖2B。

2.3.4 萃取時(shí)間的優(yōu)化 精密稱取川芎生品粗粉2.0 g，100℃下加熱平衡20 min，緩緩伸出65 μm PDMS-DVB萃取頭，分別萃取5、10、15、20、25、30 min，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，當(dāng)萃取時(shí)間為15 min時(shí)，吸附量趨于平衡，故確定15 min為最佳萃取時(shí)間。萃取時(shí)間-總峰面積關(guān)系圖見(jiàn)圖2C。

2.3.5 解吸時(shí)間的優(yōu)化 精密稱取川芎生品粗粉2.0 g，100℃下加熱平衡20 min，伸出萃取頭萃取15 min，取出，立即插入色譜儀進(jìn)樣口，分別解吸1、2、3、4、5 min，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，當(dāng)解吸時(shí)間為3 min時(shí)，總峰面積趨于最大，故確定3 min為最佳解吸時(shí)間。解吸時(shí)間-總峰面積關(guān)系圖見(jiàn)圖2D。

2.3.6 GC條件的確定 綜合“2.3.1”～“2.3.5”項(xiàng)下考察結(jié)果，確定GC的最佳條件為：取川芎生品粗粉2.0 g，置于15 mL頂空瓶中，插入裝有65 μm PDMS-DVB萃取纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在100℃下平衡20 min后，再壓縮手柄伸出萃取頭萃取15 min，取出，立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口（溫度230℃）解吸3 min，不分流進(jìn)樣。川芎酒炙品萃取條件同上。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取川芎生品、川芎酒炙品各6份，按“2.3.6”項(xiàng)下條件萃取，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，生品和酒炙品中各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別小于2.85%、3.05%（n＝6），表明該方法重復(fù)性較好，適合川芎生品和酒炙品揮發(fā)性成分的分析鑒定。

2.4 川芎酒炙前后揮發(fā)性成分的考察

按照“2.3.6”項(xiàng)下條件，采用GC-MS法對(duì)川芎酒炙前后的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)分析，得到各自揮發(fā)性成分的總離子流圖。各峰的質(zhì)譜圖經(jīng)化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理，用面積歸一化法從各總離子流圖中計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量，按各峰的質(zhì)譜圖經(jīng)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（2005年版）檢索，并結(jié)合相對(duì)保留時(shí)間，對(duì)檢測(cè)出的成分進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3、表1。

圖3 川芎生品與酒炙品揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig 3 Total ion flow of volatile components in raw products and wine processed products of L.chuanxiong

3 討論

本研究采用GC-MS技術(shù)，共鑒定出川芎生品及酒炙品中30個(gè)成分。其中，從川芎生品中共分離得到了28個(gè)峰，鑒定出24個(gè)成分，占總揮發(fā)性成分的99.70%；其主要成分有烯類、醇類、酯類及烷烴類，含量最高的為2-甲基-2，3-二氫-1H-茚-2-醇（20.06%），其次是α-芹子烯（17.97%）及4-乙基-壬烯-5-炔（9.24%）。從川芎酒炙品中共分離得到了23個(gè)峰，鑒定出18個(gè)成分，占總揮發(fā)性成分的89.74%；其主要成分為烯類和醇類，其次還有酸類及酚類等，含量從高到低依次為4-乙基-壬烯-5-炔（12.97%）、4-蒈烯（11.74%）和α-芹子烯（10.79%）。兩者共有的揮發(fā)性成分有12種，其中含量最高的是α-芹子烯（生品：17.97%、酒炙品：10.79%），其次是4-乙基-壬烯-5-炔（生品：9.24%、酒炙品：12.97%）、4-蒈烯（生品：4.75%、酒炙品：11.74%）。川芎酒炙前后揮發(fā)性成分及其相對(duì)百分含量存在一定差異，且川芎酒炙后揮發(fā)性成分明顯減少。

表1 川芎酒炙前后總揮發(fā)性成分測(cè)定結(jié)果Tab 1 Determination results of total volatile components in L.chuanxiong before and after processed with wine

川芎酒炙前后的相同成分中，γ-松油烯具有較強(qiáng)的抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，且抑制作用呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系[6]；β-欖香烯可以作為廣譜抗腫瘤新藥[7]；α-芹子烯具有較強(qiáng)的抗炎、抗菌作用[8]；4-萜品醇可以減輕炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷，還可有效減輕組胺引起的水腫反應(yīng)[9]；丁酸對(duì)于防治腸道疾病的益生菌具有較大的研究?jī)r(jià)值[10]；以上成分可能是川芎抗炎、抗癌、抗腫瘤作用的活性成分。此外，川芎生品中的鎮(zhèn)痛成分乙酸龍腦酯[11]和β-蒎烯[12]的相對(duì)百分含量分別為0.22%、0.71%，二者相對(duì)百分含量低且酒炙后消失；而川芎酒炙品中產(chǎn)生的新鎮(zhèn)痛成分α-蒎烯的相對(duì)百分含量為4.23%，遠(yuǎn)大于川芎生品中乙酸龍腦酯和β-蒎烯二者相對(duì)百分含量之和，且相同的鎮(zhèn)痛成分β-欖香烯[13]在酒炙后相對(duì)百分含量增加了0.29%。這為川芎酒炙后鎮(zhèn)痛作用增強(qiáng)提供了依據(jù)。

綜上所述，川芎酒炙前后其揮發(fā)性成分的組成和含量變化較大，酒炙后川芎治療疼痛的效果更好。本研究對(duì)比分析了川芎酒炙前后揮發(fā)性成分的差異，為后期川芎進(jìn)一步的開發(fā)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，并為川芎在臨床上的合理應(yīng)用提供了參考。

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（編輯：劉明偉）

Analysis of Volatile Ingredients of Ligusticum chuanxiong before and after Processed with Wine by Headspace Solid Phase Microextraction-GC/MS

CAO Li，LU Jinqing，YE Xin，WANG Fan（School of Pharmacy，Hubei University of Chinese Medicine/Research and Development Center of Medicinal Plant in Hubei Province，Wuhan 430065，China）

OBJECTIVE：To compare the differences in the volatile ingredients of raw products and wine processed products of Ligusticum chuanxiong，and provide reference for its pharmacological activity research and clinical application.METHODS：Headspace solid phase microextraction-GC/MS was used to analyze the volatile components of L.chuanxiong before and after processed with wine.And area normalization method was adopted to calculate the relative percentage content of each component.RESULTS：28 components were isolated from the raw products and 24 components were identified，accounting for 99.70%of total volatile components.2-methyl-2，3-dihydro-1H-inden-2-ol（20.06%），α-selinene（17.97%）and 4-ethyl-3-nonen-5-yne（9.24%）were higher in contents.21 components were isolated from the wine processed products and 18 components were identified，accounting for 89.74%of total volatile components.4-ethyl-nonen-5-yne（12.97%）was the highest in content，followed by 4-carene（11.74%）and α-selinene（10.79%）.Compared with raw products，the contents of active components α-pinene and β-elemene were increased.CONCLUSIONS：The volatile components and their relative contents of L.chuanxiong before and after processed with wine show certain differences，and volatile components after wine processed are relatively reduced.However，contents of the components with analgesic effect are increased，and its analgesic effect is superior to raw products.

Ligusticum chuanxiong；Raw products；Wine processed products；Volatile components；Headspace solid phase microextraction；GC-MS

R284.1

A

1001-0408（2017）28-3945-04

2016-10-07

2017-06-11）

＊碩士研究生。研究方向：中藥及其天然產(chǎn)物活性成分。電話：027-68890101。E-mail：15377575302@163.com

#通信作者：教授。研究方向：中藥及其天然產(chǎn)物活性成分。電話：027-68890101。E-mail：ljq59168@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.16