白芍藥材主根與根莖的HPLC指紋圖譜比較研究

宗志勇，鄭金鳳，路廣義，秘硯鴻，蘇爽，王景紅（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京100102）

白芍藥材主根與根莖的HPLC指紋圖譜比較研究

宗志勇＊，鄭金鳳，路廣義，秘硯鴻，蘇爽，王景紅#（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京100102）

目的：建立白芍藥材主根與根莖的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并比較兩者的異同。方法：色譜柱為Phenomenex C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。以芍藥苷為參照，測(cè)定白芍藥材主根與根莖部分的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行共有峰指認(rèn)和相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：白芍藥材主根與根莖的HPLC圖譜有9個(gè)共有峰；白芍藥材主根與根莖之間相似度＞0.9。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜可為白芍藥材的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，白芍藥材主根與根莖有效成分一致，差異性較小。

白芍；主根；根莖；指紋圖譜；相似度分析

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish HPLC fingerprints of taproot and rhizome of Paenoia lactiflora，and to compare the similarity and difference of them.METHODS：The determination was performed on Phenomenex C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 230 nm，and column temperature was 30 ℃.The sample size was 10 μL.Using paeoniflorin as reference，HPLC chromatograms of the taproot and rhizome of P.lactiflora were established.Common peak identification and similarity evaluation were performed by using TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System（2012 edition）.RESULTS：There were 9 common peaks in HPLC chromatograms of taproot and rhizome of P.lactiflora.The similarity of taproot with rhizome of P.lactiflora was higher than 0.9.CONCLUSIONS：Established fingerprints can provide reference for identification and quality evaluation of P.lactiflora.The effective constituent of taproot and rhizome of P.lactiflora are uniform but have small difference.

KEYWORDSPaenoia lactiflora；Taproot；Rhizome；Fingerprint；Similarity analysis

白芍是一味常用中藥，應(yīng)用廣泛，為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)的作用[1]。白芍主產(chǎn)于安徽亳州、浙江杭州、四川中江等地，主要成分為芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷等單萜類成分、三萜類成分和黃酮類成分等[2]。白芍藥材根莖在加工過程中，屬于非藥用部位，被去除，但目前市場(chǎng)收購(gòu)者眾多；前期試驗(yàn)也表明，同株白芍藥材根莖的芍藥苷含量高于主根[3]。中藥指紋圖譜可以綜合分析多種成分，近年來已成為中藥質(zhì)量控制的主要分析方法，目前以指紋圖譜用于白芍藥材質(zhì)量控制的研究較多[4-6]。筆者從高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜角度來分析白芍藥材主根和根莖主要成分之間的差異，探討白芍藥材根莖是否可作為藥材使用，以期為白芍藥材資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1200B型HPLC儀，包括G1315C DAD檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；BP211D型電子分析天平（德國(guó)Sautoris公司）；KQ5200DB型超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司）。

1.2 試劑

芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201337，純度：＞98%）、白芍對(duì)照藥材（批號(hào)：120905-201109）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

取來自同一種植基地3年生白芍藥材（經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院王景紅主任藥師鑒定為真品）10株，洗凈，去除雜質(zhì)、須根，保留其主根和根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，5%→15%A；10～30 min，15%→20%A；30～40 min，20%→45%A；40～50 min，45%～65%A；50～55 min，65%→80%A；55～60 min，80%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，加乙醇制成芍藥苷質(zhì)量濃度為83.2 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材樣品粉末0.2 g，加50%乙醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）提取30 min，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用50%乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對(duì)照藥材溶液 精密稱取白芍對(duì)照藥材粉末（過2號(hào)篩）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成對(duì)照藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以芍藥苷的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，9個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.17%，相對(duì)峰面積的RSD＜0.58%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以芍藥苷的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，9個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.46%（n＝8），相對(duì)峰面積的RSD＜0.95%（n＝8），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批藥材樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以芍藥苷的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，9個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.84%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD＜1.23%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的生成

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批藥材樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)10批藥材樣品（主根、根莖）的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1～圖4。

圖1 10批藥材主根樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 10 batches of the taproot of medicinal materials

2.4.2 共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)10批藥材樣品（主根、根莖）的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。10批藥材主根、根莖樣品均共有9個(gè)共有峰，共有峰的峰面積總和大于總峰面積的90%，通過對(duì)照品HPLC色譜確定4號(hào)峰為芍藥苷。以4號(hào)峰為參照峰，計(jì)算其他共有峰相對(duì)于4號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間，詳見表1、表2。

圖2 藥材主根樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprints of the taproot of medicinal materials

圖4 藥材根莖樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 4 HPLC control fingerprint of the rhizome of medicinal materials

2.4.3 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)10批藥材主根和根莖樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析[7]。結(jié)果，10批藥材主根和根莖樣品相似度均＞0.9，詳見表3、表4。

2.4.4 藥材主根和根莖樣品指紋圖譜對(duì)比 將藥材主根和根莖樣品生成的指紋對(duì)照?qǐng)D譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版），進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，白芍藥材主根和根莖之間相似度為0.997，圖譜整體結(jié)構(gòu)基本一致，相似度很高，說明從指紋圖譜研究來看，兩者主要成分一致，差異性較小，關(guān)系很近。

表1 10批藥材主根樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 1 Relative retention time of common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of the taproot of medicinal materials

表2 10批藥材根莖樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 2 Relative retention time of common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of the rhizome of medicinal materials

表3 10批藥材主根樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 3 Similarity evaluation results of 10 batches of the taproot of medicinal materials

表4 10批藥材根莖樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 4 Similarity evaluation results of 10 batches of the rhizome of medicinal materials

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)白芍藥材HPLC指紋圖譜的色譜方法進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)色譜柱型號(hào)、流動(dòng)相比例、流速、柱溫等進(jìn)行篩選，建立了白芍藥材主根和根莖有效成分的HPLC分析方法。

試驗(yàn)結(jié)果表明，白芍藥材主根和根莖之間指紋圖譜相似度很高，主要成分差異性較小。周學(xué)剛等[8-9]研究結(jié)果顯示，白芍藥材地下各部分中芍藥苷含量差異明顯，均呈現(xiàn)根莖＞須根＞主根。白芍藥材主根和根莖之間指紋圖譜的相似度高，其共性可以說明白芍藥材根莖有作為藥用資源利用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜可為白芍藥材的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，芍藥材主根與根莖之間有效成分無(wú)明顯差異。

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（編輯：張 靜）

Comparative Study on HPLC Fingerprints of Taproot and Rhizome of Paeonia lactiflora

ZONG Zhiyong，ZHENG Jinfeng，LU Guangyi，MI Xianhong，SU Shuang，WANG Jinghong（Wangjing Hospital of Chinese Academy of TCM，Beijing 100102，China）

R283.3

A

1001-0408（2017）27-3865-03

2017-03-07

2017-06-20）

＊主管藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：tonyzong@sina.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、臨床藥學(xué)。E-mail：wangjinghong2002@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.34