廣西地不容藥材的HPLC指紋圖譜研究Δ

黃秋潔，葉勇，王捷，王志萍，韋煒，李丹，朱滴新（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧50001；2.廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 50001；.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 50021；.廣西醫(yī)科大學(xué)制藥廠，南寧 50021）

廣西地不容藥材的HPLC指紋圖譜研究Δ

黃秋潔1，2＊，葉勇3#，王捷4，王志萍1，2，韋煒3，李丹3，朱滴新3（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧530001；2.廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001；3.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021；4.廣西醫(yī)科大學(xué)制藥廠，南寧 530021）

目的：建立廣西地不容藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Hypersil ODS2，流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。以延胡索乙素為參照，測(cè)定10批藥材樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行共有峰指認(rèn)和相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：10批廣西地不容的HPLC圖譜有17個(gè)共有峰，10批藥材樣品中有8個(gè)產(chǎn)地藥材指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜比較相似度＞0.900，2個(gè)產(chǎn)地藥材相似度＜0.900。結(jié)論：該研究所建HPLC指紋圖譜可為廣西地不容的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考；廣西區(qū)內(nèi)多數(shù)產(chǎn)地的地不容藥材所含生物堿類成分相似，少數(shù)存在差異。

廣西地不容；高效液相色譜法；指紋圖譜；相似度

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish HPLC fingerprints of Stephania kwangsiensis.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Hypersil ODS2 with mobile phase consisted of acetonitrile-0.5%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 282 nm，and column temperature was 30℃.The sample size was 10 μL.Using tetrahydropalmatine as reference，HPLC fingerprints of 10 batches of medicinal materials were determined.Common peak identification and similarity evaluation were conducted by using Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint（2012 edition）.RESULTS：A total of 17 common peaks were identified in HPLC fingerprints of 10 batches of S.kwangsiensis.Among 10 batches of samples，fingerprint of samples from 8 producing areas were compared with control chromatogram.The similarity was higher than 0.900.The similaritg of samples from 2 producing areas were lower than 0.900.CONCLUSIONS：Established HPLC fingerprint can provide reference for the identification and quality evaluation of S.kwangsiensis；S.kwangsiensis in Guangxi from most producing areas include similar alkaloid components，but samples from other producing areas are different from them.

KEYWORDSStephania kwangsiensis in Guangxi；HPLC；Fingerprint；Similarity

廣西地不容Stephania kwangsiensis H.S.Lo為防己科千金藤屬草質(zhì)藤本植物，別名又稱地不容、金不換，主產(chǎn)于廣西，是廣西壯族等少數(shù)民族民間常用草藥，在《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[1]中收載為金不換的植物來(lái)源品種之一，其塊根是生產(chǎn)中藥顱痛定的重要原料，其功能為清熱解毒、散瘀消腫、健胃止痛，臨床多用于胃/十二指腸潰瘍疼痛、上呼吸道感染、急性胃腸炎、菌痢、牙痛、神經(jīng)痛、癰瘡腫毒、跌打腫痛等癥的治療。研究發(fā)現(xiàn)，廣西地不容塊根中總生物堿含量較高，可達(dá)3%～4%，其具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用[2]。本課題組曾建立了廣西地不容塊根藥材和常見(jiàn)混偽品雪膽塊根的鑒別方法[3]，目前已從地不容塊根中分離出9個(gè)異喹啉生物堿[4-7]，在保健食品和新藥研發(fā)上具有良好的應(yīng)用前景。采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)中藥指紋圖譜進(jìn)行研究可為中藥材的種屬差異、質(zhì)量評(píng)價(jià)和真?zhèn)舞b別提供依據(jù)，從而達(dá)到控制中藥質(zhì)量的目的[8-10]。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)廣西地不容藥材質(zhì)量，本研究建立了廣西地不容生物堿類成分HPLC指紋圖譜，并對(duì)10批廣西地不容生物堿類成分HPLC指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，對(duì)其已知成分延胡索乙素定位，以便能更加全面地反映廣西地不容藥材的質(zhì)量差異，為評(píng)價(jià)和控制廣西地不容藥材綜合質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，包括LC-20A輸液泵、SPDM20A二極管陣列檢測(cè)器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、LC solution工作站（日本Shimadzu公司）；XS205DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

延胡索乙素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110726-200610，純度：＞98%）；乙腈為色譜純，甲醇、乙醇、磷酸均為分析純，水為去離子水。

1.3 藥材

廣西地不容藥材購(gòu)于廣西各地中藥材市場(chǎng)（見(jiàn)表1），并經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)傅鵬副教授鑒定為真品。

表1 地不容藥材來(lái)源Tab 1 Sources of S.kwangsiensis

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，0→20%A；8～40 min，20%→30%A；40～60 min，30%→45%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：282 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取延胡索乙素對(duì)照品適量，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成延胡索乙素質(zhì)量濃度為2.250 mg/mL的對(duì)照品貯備液；精密量取上述對(duì)照品貯備液3.00 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品粉末約2 g（過(guò)60目篩），精密稱定，置于250 mL錐形瓶中，精密加60%乙醇溶液100 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：50 kHz）處理15 min，加熱回流提取60 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用60%乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以延胡索乙素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，17個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以延胡索乙素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，17個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（編號(hào)：S1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以延胡索乙素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，17個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成及共有峰相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)10批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 10批藥材樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 10 batches of samples

圖2 藥材樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprints of samples

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)10批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果，10批藥材樣品（S1～S10）相似度分別為0.984、0.980、0.953、0.962、0.988、0.973、0.966、0.869、0.891、0.921，表明10批藥材樣品中有8個(gè)產(chǎn)地藥材指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜比較相似度＞0.900，2個(gè)產(chǎn)地藥材相似度＜0.900，說(shuō)明廣西省內(nèi)多數(shù)產(chǎn)地的地不容藥材所含成分相似，少數(shù)存在差異。

2.4.3 共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)10批藥材樣品的共有HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。10批藥材樣品共有17個(gè)特征指紋峰，共有峰的峰面積總和大于總峰面積的90%，通過(guò)對(duì)照品HPLC色譜確定14號(hào)峰為延胡索乙素。以14號(hào)峰為參照峰，計(jì)算其他共有峰相對(duì)于14號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，詳見(jiàn)表2、表3。

表2 10批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 2 Relative retention time of common peaks for HPLC fingerprints of 10 batches of samples

表3 10批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab 3 Relative peak areas of common peaks for HPLC fingerprints of 10 batches of samples

3 討論

本試驗(yàn)所建HPLC指紋圖譜分析方法靈敏度高、重復(fù)性好、精密度好、操作簡(jiǎn)便。在樣品前期處理時(shí)，筆者比較了超聲和加熱回流兩種提取方法，結(jié)果兩種方法差異不大，為簡(jiǎn)化操作，筆者選擇程序簡(jiǎn)單的超聲提取法。

本試驗(yàn)采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，廣西地不容生物堿成分在282 nm波長(zhǎng)處所檢測(cè)到的共有峰較多，多數(shù)生物堿成分在此處出峰，且峰強(qiáng)度較高、背景噪音小、基線平穩(wěn)，經(jīng)過(guò)考察最終選擇282 nm波長(zhǎng)作為HPLC圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。筆者又分別考察了以甲醇-水、甲醇-0.5%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行等度或梯度洗脫。結(jié)果表明，采用乙腈-0.5%磷酸溶液為流動(dòng)相（梯度洗脫），所得HPLC指紋圖譜各成分特征峰分布均勻、分離度高、峰形尖銳，故最終選擇乙腈-0.5%磷酸溶液作為流動(dòng)相。

對(duì)廣西區(qū)內(nèi)10個(gè)不同產(chǎn)地地不容藥材的HPLC指紋圖譜進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，其差異并不顯著，其中有8個(gè)產(chǎn)地藥材指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜比較，相似度＞0.900，2個(gè)產(chǎn)地藥材相似度＜0.900，說(shuō)明產(chǎn)地對(duì)藥材所含成分有一定的影響。但由于10批藥材均采集于廣西區(qū)內(nèi)，其所在區(qū)域的氣候及生長(zhǎng)環(huán)境較為相似，推測(cè)除與多數(shù)產(chǎn)地藥材HPLC指紋圖譜相似度較高有關(guān)外，還與藥材加工方法、貯存條件、采集季節(jié)、運(yùn)輸方式有關(guān)，其內(nèi)在質(zhì)量也會(huì)因這些影響因素而存在一定差異。

[1]廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第二冊(cè)[S].南寧：廣西科技出版社，1996：153-157.

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Study on HPLC Fingerprints of Stephania kwangsiensis in Guangxi

HUANG Qiujie1，2，YE Yong3，WANG Jie4，WANG Zhiping1，2，WEI Wei3，LI Dan3，ZHU Dixin3（1.School of Pharmacy，Guangxi University of TCM，Nanning 530001，China；2.Key Lab of Generic Technology R&D for TCM Preparations in Guangxi Universities，Nanning 530001，China；3.School of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；4.Pharmaceutical Factory of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

R282

A

1001-0408（2017）27-3856-03

2016-09-07

2016-11-24）

（編輯：張 靜）

廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No.LX2014062）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)性研究課題（No.ZJGX201402003）；廣西醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目（No.201510598063）

＊副教授。研究方向：中藥新劑型與新技術(shù)。E-mail：hqj8@163.com

#通信作者：副教授。研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)。E-mail：yong-ye@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.31