HPLC法同時(shí)測定復(fù)方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素的含量Δ

邱紅梅，楊林，何丹（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶400016；.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系，重慶401331）

HPLC法同時(shí)測定復(fù)方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素的含量Δ

邱紅梅1＊，楊林2，何丹1#（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶400016；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，重慶401331）

目的：建立同時(shí)測定復(fù)方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為GL InterSustain-C18，流動相為水-甲醇（55∶45，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：綠原酸、黃芩苷和槲皮素的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.264～12.64 μg/mL（r＝0.999 9）、8.704～87.04 μg/mL（r＝0.999 9）、1.212～12.12 μg/mL（r＝0.999 9）；定量限分別為1.88、2.98、1.94 ng，檢測限分別為0.56、0.89、0.58 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為98.02%～101.10%（RSD＝1.01%，n＝9）、97.48%～101.70%（RSD＝1.38%，n＝9）、98.31%～101.10%（RSD＝1.02%，n＝9）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于復(fù)方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素含量的同時(shí)測定。

高效液相色譜法；復(fù)方魚腥草片；綠原酸；黃芩苷；槲皮素

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of chlorogenic acid，baicalin and quercetin in Compound yuxingcao tablets.METHODS：HPLC method was adopted.The separation was performed on GL InterSustain-C18column with mobile phase consisted of water-methanol（55∶45，V/V）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 270 nm，and the column temperature was 30 ℃.The sample size was 20 μL.RESULTS：Linear ranges of chlorogenic acid，baicalin and quercetin were 1.264-12.64 μg/mL（r＝0.999 9），8.704-87.04 μg/mL（r＝0.999 9）and 1.212-12.12 μg/mL（r＝0.999 9），respectively.The limit of quantification were 1.88，2.98，1.94 ng，respectively.The limits of detection were 0.56，0.89，0.58 ng，respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 98.02%-101.10%（RSD＝1.01%，n＝9），97.48%-101.70%（RSD＝1.38%，n＝9）and 98.31%-101.10%（RSD＝1.02%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The established method is simple，accurate，stable and reproducible，and can be used for simultaneous determination of chlorogenic acid，baicalin and quercetin in Compound yuxingcao tablets.

KEYWORDSHPLC；Compound yuxingcao tablets；Chlorogenic acid；Baicalin；Quercetin

復(fù)方魚腥草片是由魚腥草、黃芩等5味中藥材經(jīng)提取制成的口服制劑，具有清熱解毒的功效，臨床上多用于外感風(fēng)熱引起的咽喉紅腫疼痛、急性咽炎、急性扁桃體炎的治療[1]。本品收載于2015年版《中國藥典》（一部），現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)采用薄層色譜法對魚腥草、連翹苷和綠原酸進(jìn)行鑒別[1]，以高效液相色譜法（HPLC）測定黃芩苷的含量，并規(guī)以黃芩苷計(jì)不得少于2.7 mg/片。魚腥草中除含揮發(fā)油成分外，還含有大量綠原酸和槲皮素[2-4]。綠原酸具有抗菌、抗病毒、降血壓和抗腫瘤等作用[5]；槲皮素屬黃酮類化合物，能顯著抑制癌細(xì)胞生長[6-7]，可抗腫瘤和抗血小板凝集[5，8]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于復(fù)方魚腥草片中有效成分的測定有HPLC法測定桑色素和槲皮素[8]，HPLC法測定黃芩苷[9]，HPLC法測定綠原酸[10]，也有采用毛細(xì)管電泳法測定綠原酸和槲皮素[11]，但未見同時(shí)測定復(fù)方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素含量的報(bào)道。本試驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測定復(fù)方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素含量，以期為復(fù)方魚腥草片的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器（日本Shimadzu公司）；AG135型電子分析天平（瑞士Mett-ler-Toledo公司）；KQ-1100DE型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方魚腥草片（李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號：1605002、1601001、1511004，規(guī)格：0.393 g/片）；綠原酸對照品（批號：110753-201415）、黃芩苷對照品（批號：110896-200001）、槲皮素對照品（批號：100081-201408）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均≥99.0%；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：GL InterSustain-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：水-甲醇（55∶45，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取綠原酸、黃芩苷、槲皮素對照品15.33、10.88、15.15 mg，分別置于50 mL量瓶中，加水溶解并定容，得單一對照品溶液；量取上述單一對照品溶液各0.1 mL，置于同一25 mL量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，得綠原酸、黃芩苷和槲皮素質(zhì)量濃度分別為12.64、87.04、12.12 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品20片，研缽研細(xì)，精密稱取0.4 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇20 mL使溶解，稱定質(zhì)量，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放至室溫（25℃），用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按復(fù)方魚腥草片處方和工藝制備缺魚腥草和黃芩的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)以綠原酸峰計(jì)＞3 000；綠原酸、黃芩苷和槲皮素均能達(dá)到基線分離，分離度均＞2，各成分基線分離良好。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加水定容，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得綠原酸、黃芩苷和槲皮素回歸方程分別為y＝43 567x－388（r＝0.999 9）、y＝59 992x－423（r＝0.999 9）、y＝63 934x－578（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，綠原酸、黃芩苷和槲皮素檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為 1.264～12.64、8.704～87.04、1.212～12.12 μg/mL。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10︰1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3︰1時(shí)，得檢測限。結(jié)果，綠原酸、黃芩苷和槲皮素的定量限分別為1.88、2.98、1.94 ng，檢測限分別為0.56、0.89、0.58 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、黃芩苷和槲皮素峰面積的RSD分別為1.04%、1.33%、0.95%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：1605002）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、黃芩苷和槲皮素峰面積的RSD分別為1.21%、0.98%、1.01%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號：1605002）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，綠原酸、黃芩苷和槲皮素含量的平均值分別為0.452 0、4.402、0.118 4 mg/片，RSD 分別為 1.03%、0.76%、1.02%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號：1605002）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/片）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/tablet）

3 討論

2015年版《中國藥典》（一部）采用HPLC法對黃芩苷含量進(jìn)行測定，流動相為甲醇、水和磷酸[1]。而本研究所建方法流動相僅需甲醇和水，不使用磷酸，更加經(jīng)濟(jì)環(huán)保。

2015年版《中國藥典》（一部）中魚腥草及其飲片含量測定項(xiàng)下暫無相應(yīng)內(nèi)容[1]。本研究所建方法可以為魚腥草、魚腥草飲片以及魚腥草的相關(guān)制劑中綠原酸和槲皮素的含量測定提供參考。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于復(fù)方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素含量的同時(shí)測定。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：224、302、1234.

[2]葉春，闞建全，譚書明，等.魚腥草葉總黃酮的提取分離[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（10）：227-230.

[3]伍賢進(jìn)，李勝華，李愛明，等.魚腥草化學(xué)成分研究[J].中藥材，2008，31（8）：1168-1170.

[4]李瑞玲，崔運(yùn)啟，秦彩霞.魚腥草中槲皮素的提取及含量測定[J].化學(xué)與生物工程，2014，31（2）：72-74.

[5]王蓮，袁藝.不同產(chǎn)地魚腥草中綠原酸、槲皮素含量測定[J].藥物分析雜志，2008，28（7）：1081-1083.

[6]羅世瓊，彭全材，柳丹丹.高效液相色譜法測定魚腥草不同部位槲皮素的含量[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，26（3）：96-99.

[7]崔山風(fēng).槲皮素的研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2006，21（6）：23-24.

[8]賈小燕，李念兵，羅紅群.超聲提取反相高效液相色譜同時(shí)測定復(fù)方魚腥草片中的桑色素和槲皮素[J].藥物分析雜志，2010，30（2）：266-270.

[9]車曉彥，賀亞玲，尹靖先，等.復(fù)方魚腥草片的鑒別和含量測定[J].華西藥學(xué)雜志，2005，20（1）：65-67.

[10]曹金枝，蘇志剛.HPLC法測定復(fù)方魚腥草片中綠原酸的含量[J].首都醫(yī)藥，2014（10）：93-94.

[11]呂元琦，鄔春華，袁倬斌.毛細(xì)管電泳法測定復(fù)方魚腥草片中的綠原酸和槲皮素[J].分析測試學(xué)報(bào)，2004，23（6）：106-108.

Simultaneous Determination of Chlorogenic Acid，Baicalin and Quercetin in Compound Yuxingcao Tablets by HPLC

QIU Hongmei1，YANG Lin2，HE Dan1（1.College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Dept.Pharmacy，Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 401331，China）

R917

A

1001-0408（2017）27-3846-03

2016-10-10

2016-11-11）

（編輯：張 靜）

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No.KJ14400208）

＊副教授。研究方向：中藥藥理學(xué)、中藥分析。E-mail：qiuhongmei@cqmu.edu.cn

#通信作者：副教授。研究方向：藥物分析。E-mail：ildoctor@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.28