HPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)紅花藥材中9種非法染色物Δ

李婷婷，李 良，劉 莉，曾 楨，孔衛(wèi)東，劉 芬，孫 茜（.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，成都6005；2.武警江西總隊(duì)醫(yī)院，南昌 0006；.南昌大學(xué)藥學(xué)院，南昌 00；.上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院，上海 200）

HPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)紅花藥材中9種非法染色物Δ

李婷婷1＊，李 良2#，劉 莉1，曾 楨1，孔衛(wèi)東1，劉 芬3，孫 茜4（1.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，成都610045；2.武警江西總隊(duì)醫(yī)院，南昌 330006；3.南昌大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330031；4.上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院，上海 200431）

目的：建立同時(shí)檢測(cè)紅花藥材中9種非法染色物的方法。方法：采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）。色譜條件：色譜柱為SB-C18，流動(dòng)相為10 mmol/L甲酸銨-乙腈（梯度洗脫），流速為0.2 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源，監(jiān)測(cè)方式為負(fù)離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)，離子噴霧電壓為3 500 V，干燥氣溫度為350℃，干燥氣流速為10 L/min，碰撞氣為高純氮?dú)?，掃描范圍為m/z 50～1 000。結(jié)果：麗春紅、酸性紅73、檸檬黃、偶氮玉紅、誘惑紅、金橙Ⅱ、日落黃、赤蘚紅和金橙G檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為5.313 5～531.35 ng/mL（r＝0.987 0）、1.312 0～1 312.00 ng/mL（r＝0.994 8）、124.480 0～2 824.00 ng/mL（r＝0.983 2）、6.300 0～630.00 ng/mL（r＝0.964 8）、1.035 8～517.92 ng/mL（r＝0.996 4）、0.552 0～1 104.00 ng/mL（r＝0.909 0）、5.046 3～2 018.52 ng/mL（r＝0.996 2）、5.046 3～2 018.52 ng/mL（r＝0.997 6）、1.079 5～2 159.00 ng/mL（r＝0.990 0）；定量限分別為10.418 7、1.131 0、68.401 0、13.695 7、1.670 7、0.238 0、3.973 3、1.064 7、1.285 0 ng/kg，檢測(cè)限分別為3.125 6、0.339 3、20.520 3、4.108 7、0.501 2、0.071 4、1.192 0、0.319 4、0.385 5 ng/kg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3.0%；回收率為91.2%～99.1%（RSD為0.7%～2.2%，n＝6）。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快捷，適用于紅花藥材中9種非法染色物的同時(shí)檢測(cè)。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；紅花；麗春紅；酸性紅73；檸檬黃；偶氮玉紅；誘惑紅；金橙Ⅱ；日落黃；赤蘚紅；金橙G

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish the method for the determination of 9 illegal dyes in Carthamus tinctorius.METHODS：HPLC-MS/MS was adopted.The determination was performed on SB-C18column with mobile phase consisted of 10 mmol/L ammonium formate-acetonitrile（gradient elution）at the flow rate of 0.2 mL/min.The column temperature was 30℃，and the sample size was 10 μL.Mass spectrometry condition：electrospray ion source，negative ion multi-ion reaction monitoring mode，ion spray voltage of 3 500 V，drying gas temperature of 350℃，drying gas flow rate of 10 L/min，colliding gas of high pure nitrogen gas，scanning range of m/z 50～1 000.RESULTS：The linear ranges of ponceau，acid red 73，lemon yellow，azorubin，allura red，gold orangeⅡ，sunset yellow，pyrosine and golden orange G were 5.313 5～531.35 ng/mL（r＝0.987 0），1.312 0～1 312.00 ng/mL（r＝0.994 8），124.480 0～2 824.00 ng/mL（r＝0.983 2），6.300 0～630.00 ng/mL（r＝0.964 8），1.035 8～517.92 ng/mL（r＝0.996 4），0.552 0～1 104.00 ng/mL（r＝0.909 0），5.046 3～2 018.52 ng/mL（r＝0.996 2），5.046 3～2 018.52 ng/mL（r＝0.997 6），1.079 5～2 159.00 ng/mL（r＝0.990 0），respectively.The limits of quantitation were 10.418 7，1.131 0，68.401 0，13.695 7，1.670 7，0.238 0，3.973 3，1.064 7，1.285 0 ng/kg.The limits of detection were 3.125 6，0.339 3，20.520 3，4.108 7，0.501 2，0.071 4，1.192 0，0.319 4，0.385 5 ng/kg，respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3.0%.The recoveries were 91.2%-99.1%（RSD＝0.7%-2.2%，n＝6）.CONCLUSIONS：The established method is specific，sensitive，simple and rapid，and can be used for the detection of 9 illegal dyes in C.tinctorius.

KEYWORDSHPLC-MS/MS；Carthamus tinctorius；Ponceau；Acid red 73；Lemon yellow；Azorubin；Allura red；Gold orangeⅡ；Sunset yellow；Pyrosine；Golden orange G

紅花來源于菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥不帶子房的管狀花[1]，表面紅色或紅黃色，主產(chǎn)河南、湖南、四川、新疆等地；具有活血通徑、散瘀止痛之功效，臨床常用于經(jīng)閉、痛經(jīng)、惡露不行、癥瘕痞塊、跌打損傷的治療。近年來，由于紅花藥材應(yīng)用廣泛，來源有限，而存在造假、摻假的情況，嚴(yán)重影響藥材質(zhì)量，損害消費(fèi)者健康[2-3]。

本試驗(yàn)采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS），參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-10]，對(duì)從中藥材市場、醫(yī)院、藥店等流通環(huán)節(jié)收集的紅花藥材進(jìn)行了摻偽染色檢測(cè)方法的研究，以期為進(jìn)一步完善紅花藥材摻偽染色檢測(cè)方法、加強(qiáng)紅花藥材的監(jiān)督管理、提高紅花飲片質(zhì)量、打擊相關(guān)非法摻偽摻假行為提供可行手段。

1 材料

1.1 儀器

1290型G6460C MS/MS三重四級(jí)桿HPLC-MC儀（美國Agilent公司）；AE-240型電子分析天平、AEG-220型電子分析天平（日本Shimadzu公司）；SK1200B型超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

麗春紅對(duì)照品（德國Dr.Ehrenstorfer公司，批號(hào)：91117，純度：81.0%）；酸性紅73對(duì)照品（批號(hào)：111955-200701，純度：99.0%）、檸檬黃對(duì)照品（批號(hào)：510004-201401，純度：95.9%）、偶氮玉紅對(duì)照品（批號(hào)：520054-201401，純度：99.9%）、誘惑紅對(duì)照品（批號(hào)：510003-201401，純度：91.0%）、金橙Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)：111769-201302，純度：98.2%）、日落黃對(duì)照品（批號(hào)：510005-201401，純度：89.0%）、赤蘚紅對(duì)照品（批號(hào)：111772-201202，純度：97.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；金橙G對(duì)照品（美國Acros公司，批號(hào)：A0338124，純度：85.0%）；甲酸銨、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

紅花藥材（批號(hào)：20150007、20150009、20150010、20150019、20150020、20150022、20150024、20150029、20150039、20150043、20150045、20150047、20150069、20150070、20150071、20150072、20150085）來自中藥材市場、醫(yī)院、藥店等流通環(huán)節(jié)，經(jīng)成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院孔衛(wèi)東主任中藥師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：SB-C18（50 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動(dòng)相：10 mmol/L甲酸銨（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution process

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；監(jiān)測(cè)方式：負(fù)離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子噴霧電壓：3 500 V；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：10 L/min；碰撞氣：高純氮?dú)?；掃描范圍：m/z 50～1 000。質(zhì)譜參數(shù)見表2；提取離子流見圖1。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab 2 Parameters of mass spectrometry

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取各待測(cè)成分對(duì)照品約5 mg，分別置于100 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解并定容，制成單一對(duì)照品溶液；精密量取上述單一對(duì)照品溶液各1 mL，置于25 mL量瓶中，加50%乙腈溶液定容，搖勻，即得。

圖1 提取離子流圖Fig 1 Extraction ion chromatograms

2.2.2 供試品溶液 取樣品0.2 g，精密稱定，加70%乙醇溶液20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：59 kHz）處理20 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液適量，加70%乙醇溶液制成麗春紅、酸性紅73、檸檬黃、偶氮玉紅、誘惑紅、金橙Ⅱ、日落黃、赤蘚紅和金橙G質(zhì)量濃度均為0.5、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、250.00、500.00 ng/mL的系列單一對(duì)照品溶液。精密量取上述系列單一對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表3。

表3 回歸方程、線性范圍與定量限、檢測(cè)限Tab 3 Regression equation，linear range and the limits of quantitation and detection

2.4 定量限與檢測(cè)限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限，詳見表3。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，麗春紅、酸性紅73、檸檬黃、偶氮玉紅、誘惑紅、金橙Ⅱ、日落黃、赤蘚紅和金橙G峰面積的RSD分別為1.3%、1.1%、2.4%、1.3%、1.8%、1.6%、1.2%、1.5%、1.2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20150019）適量，分別于室溫下放置0、3、6、12、18、24 h 時(shí)按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，麗春紅、酸性紅73、檸檬黃、偶氮玉紅、誘惑紅、金橙Ⅱ、日落黃、赤蘚紅和金橙G峰面積的RSD分別為1.1%、1.0%、1.5%、1.3%、1.2%、1.4%、1.3%、1.1%、1.2%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：20150019）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，麗春紅、酸性紅73、檸檬黃、偶氮玉紅、誘惑紅、金橙Ⅱ、日落黃、赤蘚紅和金橙G峰面積的RSD分別為2.2%、1.1%、1.5%、1.3%、1.2%、1.8%、0.9%、1.2%、1.1%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號(hào)：20150019）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 4 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品中染色物的檢測(cè)

取17批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表5（表中“ND”為未檢測(cè)出）。

表5 樣品檢測(cè)結(jié)果（n＝3）Tab 5 Results of samples test（n＝3）

3 討論

本研究測(cè)定的9種目標(biāo)物均為紅花藥材中常用的染色劑，根據(jù)其性質(zhì)和分子結(jié)果，可知在負(fù)離子掃描模式下靈敏度最高。選擇電噴霧離子源為電離模式，對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，確定分子離子峰，在此基礎(chǔ)上，選擇出峰度最大的2個(gè)子離子作為定量和定性離子，確定最佳碰撞能量，以獲得最大靈敏度。

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，目前紅花藥材中確實(shí)存在非法染色問題。本次檢出2種以上染料染色的紅花藥材有9批，可見紅花藥材染色問題相當(dāng)突出，且染料種類繁多，呈現(xiàn)多樣化、復(fù)雜化趨勢(shì)。

綜上所述，本研究確立了紅花藥材中麗春紅、酸性紅73、檸檬黃、偶氮玉紅、誘惑紅、金橙Ⅱ、日落黃、赤蘚紅和金橙G的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，17批次藥材樣品中存在不同程度金橙Ⅱ、酸性紅73、檸檬黃、偶氮玉紅、日落黃5種非法染色物。該研究本方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快捷，適用于紅花藥材中9種非法染色物的同時(shí)檢測(cè)。

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Simultaneous Determination of 9 Illegal Dyes in Carthamus tinctorius by HPLC-MS/MS

LI Tingting1，LI Liang2，LIU Li1，ZENG Zhen1，KONG Weidong1，LIU Fen3，SUN Qian4（1.Chengdu Institute for Food and Drug Control，Chengdu 610045，China；2.Armed Police Jiangxi Corps Hospital，Nanchang 330006，China；3.College of Pharmacy，Nanchang University，Nanchang 330031，China；4.Renhe Hospital of Shanghai Baoshan District，Shanghai 200431，China）

R927

A

1001-0408（2017）27-3842-04

2016-10-04

2017-03-13）

（編輯：張 靜）

江西省衛(wèi)生計(jì)生委中醫(yī)藥科研課題（No.2015A069）

＊主管藥師。研究方向：藥物含量測(cè)定與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：028-85362592

#通信作者：主管藥師，碩士。研究方向：藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：278623586@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.27