炮山甲的HPLC指紋圖譜研究Δ

嚴(yán)丹，劉玉杰，胡美變，肖禾，李永川，吳純潔，3#（.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都637；.成都岷江源藥業(yè)股份有限公司，成都 6000；3.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)重點(diǎn)研究室，成都 673）

炮山甲的HPLC指紋圖譜研究Δ

嚴(yán)丹1＊，劉玉杰1，胡美變1，肖禾2，李永川2，吳純潔1，3#（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都611137；2.成都岷江源藥業(yè)股份有限公司，成都 611000；3.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)重點(diǎn)研究室，成都 611731）

目的：建立炮山甲的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Capcell Pak MgⅡS5 C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。以酪氨酸為參照，測(cè)定11批藥材的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）進(jìn)行共有峰指認(rèn)和相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：11批炮山甲藥材的HPLC圖譜有23個(gè)共有峰，相似度均＞0.90。經(jīng)驗(yàn)證，11批藥材樣品HPLC圖譜與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：該研究所建HPLC指紋圖譜可為炮山甲的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

炮山甲；高效液相色譜法；指紋圖譜；質(zhì)量評(píng)價(jià)

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish HPLC fingerprint of stir-baked Manis pentadactyla.METHODS：HPLC method was conducted.The determination was performed on Capcell Pak MgⅡS5 C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（gradient elution）at the flow rate of 0.8 mL/min.The detection wavelength was set at 275 nm，and column temperature was 30 ℃.The sample size was 10 μL.Using oxyphenylaminopropionic acid as reference，HPLC chromatograms of 11 batches of medicinal materials were determined.TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System（2004 A edition）was used for common peak identification and similarity evaluation.RESULTS：There were 23 common peaks in 11 batches of stir-baked M.pentadactyla，with similarity＞0.90.After validation，HPLC chromatograms of 11 batches of medicinal materials were in good agreement with control fingerprints.CONCLUSIONS：Established HPLC fingerprint can provide reference for the identification and quality evaluation of stir-baked M.pentadactyla.

KEYWORDSStir-baked Manis pentadactyla；HPLC；Fingerprint；Quality evaluation

穿山甲為鯪鯉科動(dòng)物穿山甲Manis pentadactyla Linnaeus的鱗甲，為貴細(xì)類中藥材，其味咸、性微寒，入肝、胃二經(jīng)，具有通經(jīng)下乳、消腫排膿、活血消癥、搜風(fēng)通絡(luò)的功效[1]。穿山甲始載于《名醫(yī)別錄》，在歷版的《中國(guó)藥典》中均有收載，可用于經(jīng)閉癥瘕、癰腫瘡毒、乳汁不通、麻木拘攣、關(guān)節(jié)痹痛等癥的治療?，F(xiàn)代藥理研究表明，穿山甲具有降低血液黏度，延長(zhǎng)凝血時(shí)間，升高白細(xì)胞等作用[2-5]。臨床上，穿山甲一般經(jīng)炮制后使用，其中炮山甲是穿山甲常用炮制品。然而，2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中收載的炮山甲僅有鑒別、檢查項(xiàng)，且“同藥材”，嚴(yán)重影響了炮山甲的質(zhì)量控制，也不能體現(xiàn)炮制的必要性。因此，對(duì)炮山甲進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，建立并完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)保障炮山甲質(zhì)量具有重要意義。

中藥指紋圖譜是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究基礎(chǔ)上的一種綜合的、可量化的鑒定手段，能全面反映中藥多組分復(fù)雜體系，并能綜合反映和有效控制中藥的質(zhì)量，以指紋圖譜作為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制已成為國(guó)際共識(shí)[6-8]。而作為動(dòng)物藥的炮山甲，目前尚未建立有效控制質(zhì)量的指紋圖譜。本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立炮山甲指紋圖譜，以期為完善炮山甲的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；BP211D型十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；AS10200AT型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試劑

酪氨酸對(duì)照品（成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：150204，純度：＞98%）；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

11批炮山甲藥材均由成都岷江源藥業(yè)有限公司提供（見(jiàn)表1），經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李敏教授鑒定為真品。

表1 炮山甲藥材來(lái)源Tab 1 Source of stir-baked M.pentadactyla

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Capcell Pak MgⅡS5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，98%B；20～40 min，98%→78%B；40～60 min，78%→72%B；60～65 min，72%→98%B）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取酪氨酸對(duì)照品5 mg，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品粉末（過(guò)80目篩）約2.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加10倍量水回流提取1 h，濾過(guò)，殘?jiān)偌?倍量水回流提取1 h，合并濾液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以酪氨酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，23個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以酪氨酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，23個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（編號(hào)：S1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以酪氨酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，23個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的生成及共有峰相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取11批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)11批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 11批藥材樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 11 batches of samples

圖2 藥材樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprints of samples

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)11批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，11批藥材樣品相似度均＞0.90（見(jiàn)表2）；經(jīng)驗(yàn)證，11批藥材樣品HPLC圖譜與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性。

表2 11批藥材樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Similarity evaluation of 11 batches of samples

2.4.3 共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)11批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。11批藥材樣品共有23個(gè)共有峰，通過(guò)對(duì)照品HPLC色譜確定9號(hào)峰為酪氨酸。以9號(hào)峰為參照峰，計(jì)算其他特征峰相對(duì)于9號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，詳見(jiàn)表3、表4。

3 討論

表3 11批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 3 Relative retention time of common peaks for HPLC chromatograms of 11 batches of samples

表4 11批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab 4 Relative peak areas of common peaks for HPLC chromatograms of 11 batches of samples

3.1 藥材樣品的代表性

穿山甲已被列為我國(guó)二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，就《關(guān)于加強(qiáng)賽加羚羊、穿山甲、稀有蛇類資源保護(hù)和規(guī)范其產(chǎn)品入藥管理的通知》，要求停止野外獵捕活動(dòng)，核查原料庫(kù)存并限定使用范圍，實(shí)行產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度[9]。本課題組所用樣品均來(lái)自四川省林業(yè)廳核查封存庫(kù)存的生山甲片，由藥材公司炮制加工而成，炮制操作過(guò)程規(guī)范，能保證試驗(yàn)所用藥材樣品的質(zhì)量。生山甲片的采集來(lái)自全國(guó)不同產(chǎn)地，包括廣西、云南、貴州和四川等，因此所用藥材樣品具有代表性。

3.2 提取溶劑和方法的考察

本研究對(duì)樣品提取溶劑（水、甲醇、乙醇、50%乙醇）進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以水為提取溶劑時(shí)，色譜峰個(gè)數(shù)較多、且峰面積大，故選擇水作為提取溶劑。此外，筆者對(duì)超聲提取法和加熱回流提取法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)加熱回流的提取效率高，因此選擇加熱回流提取法進(jìn)行樣品提取。

3.3 色譜條件的考察

筆者分別考察了甲醇-水-磷酸、乙腈-水-磷酸、乙腈-水3個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)[10-11]，結(jié)果表明采用乙腈-水-磷酸為流動(dòng)相時(shí)，各色譜峰的分離度較好、峰形穩(wěn)定，且基線平穩(wěn)，因此選用其作為流動(dòng)相。為了得到質(zhì)量好的色譜圖，筆者對(duì)流動(dòng)相濃度和流速作了進(jìn)一步試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)等度洗脫分離效果不好，易造成峰形堆積，使用梯度洗脫后，可得到較好的色譜。隨后，又分別考察了25、30、35℃的柱溫對(duì)色譜峰的影響，結(jié)果表明柱溫為30℃時(shí)，色譜峰分離度和峰形最好，因此選擇30℃柱溫進(jìn)行檢測(cè)。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

以二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，同時(shí)比較了230、254、275、283 nm不同波長(zhǎng)下的色譜圖信息。結(jié)果顯示，在275 nm波長(zhǎng)處，藥材樣品色譜峰信息量較多、基線噪音比較低，樣品中各成分分離度相對(duì)較好。因此，選擇275 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行指紋圖譜分析。

綜上所述，本課題組首次采用HPLC法建立了炮山甲的指紋圖譜。結(jié)果表明，不同批次炮山甲樣品之間相似度較高，相關(guān)性較好，可滿足中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的基本要求。方法學(xué)考察結(jié)果表明，本研究建立的HPLC指紋圖譜方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可用于炮山甲的質(zhì)量評(píng)價(jià)，有利于保障穿山甲藥材的質(zhì)量。

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Study on HPLC Fingerprint of Stir-baked Manis pentadactyla

YAN Dan1，LIU Yujie1，HU Meibian1，XIAO He2，LI Yongchuan2，WU Chunjie1，3（1.College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China；2.Chengdu Minjiangyuan Pharmaceutical Co.，Ltd.，Chengdu 611000，China；3.Key Laboratory of TCM Processing Technology，State Administration of TCM，Chengdu 611731，China）

R283；R917

A

1001-0408（2017）27-3839-04

2016-12-28

2017-02-15）

（編輯：張 靜）

國(guó)家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（No.201207004-6）

＊碩士研究生。研究方向：中藥炮制與制劑。E-mail：478357452@qq.com

#通信作者：研究員，博士生導(dǎo)師，博士。研究方向：中藥炮制與制劑。電話：028-61801001。E-mail：wcj-one@263.net

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.26