復(fù)方守宮散的質(zhì)量標準提高研究Δ

王曉玉，孟 楣，汪永忠（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部/國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，合肥230031）

復(fù)方守宮散的質(zhì)量標準提高研究Δ

王曉玉＊，孟 楣#，汪永忠（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部/國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，合肥230031）

目的：提高復(fù)方守宮散的質(zhì)量標準。方法：采用顯微鑒別法對制劑中壁虎、梅花進行顯微鑒別；采用薄層色譜法（TLC）對制劑中制何首烏進行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）測定制劑中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（簡稱“二苯乙烯苷”）的含量：色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18，流動相為乙腈-水（19∶81，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為320 nm，柱溫為25℃，進樣量為10 μL。結(jié)果：壁虎的皮膚碎片和鱗片、梅花的花粉粒顯微特征明顯，陰性對照無干擾。制何首烏的TLC圖斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾。二苯乙烯苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍為23～368 μg/mL（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜1.0%；加樣回收率為98.69%～101.61%（RSD＝0.94%，n＝9）。結(jié)論：提高的標準能更加有效地控制復(fù)方守宮散的質(zhì)量。

復(fù)方守宮散；顯微鑒別法；薄層色譜法；含量測定；高效液相色譜法

ABSTRACTOBJECTIVE：To improve the quality standard of Compound shougong powder.METHODS：Gekko japonicas and Armeniaca mume were identified by microscopic identification.TLC method was adopted to identify processed Fallopia multiflora qualitatively.The content of 2，3，5，4-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside（stilbene glycoside）was determined by HPLC.The determination was performed on Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（19∶81，V/V）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 320 nm，and column temperature was 25℃.The sample size was 10 μL.RESULTS：Microscopic characteristics of skin fragments and scales of G.japonicas and the pollen grains of A.mume were significant without interference from negative control.TLC spots of F.multiflora were clear and well-separated without interference from negative control.The linear range of stilbene glucoside were 23-368 μg/mL（r＝0.999 9）.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 1.0%.The recoveries ranged 98.69%-101.61%（RSD＝0.94%，n＝9）.CONCLUSIONS：Improved standard can effectively control the quality of Compound shougong powder.

KEYWORDSCompound shougong powder；Microscopy identification method；TLC；Content determination；HPLC

復(fù)方守宮散為安徽省中醫(yī)院腫瘤科特色醫(yī)院制劑（批準文號：皖藥制字Z20080001），由制何首烏、梅花、三七、人參、沒藥、壁虎6味中藥組方而成，具有補虛解毒、消腫止痛之功效，主治腫瘤伴體虛、乏力、納差、疼痛等，且不良反應(yīng)小，易為患者接受，在該院應(yīng)用十余年效果良好[1-5]。該制劑原標準只建立了方中三七、人參的定性鑒別方法，其余藥味尚未建立有效的鑒別項目，亦無含量測定項目，故有必要對其質(zhì)量標準進一步完善和提高，從而保證其臨床使用的安全性和穩(wěn)定性。為此，本研究采用顯微鑒別法對制劑中壁虎、梅花進行顯微鑒別；采用薄層色譜法（TLC）對制劑中制何首烏進行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）測定制劑中制何首烏的主要成分2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（以下簡稱“二苯乙烯苷”）的含量，從而達到全面控制該制劑質(zhì)量的目的，以保障臨床用藥安全、有效。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；HH-S型水浴鍋（上海予華儀器公司）；BCD-277型電冰箱（德國Siemens公司）；SK3200H型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)儀器公司）；D2F-6020型真空干燥箱（天津順諾儀器公司）；BX43型電子顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方守宮散（安徽省中醫(yī)院制劑中心自制，批號：20150305、20150507、20150807、20150903、20151129、20151216，規(guī)格：50 g/袋）；二苯乙烯苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110844-201310，純度：100%）；硅膠G薄層板（青島海洋化工總廠）；甲醇、磷酸、乙醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

壁虎、梅花藥材（安徽省中醫(yī)院中草藥房提供）由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部孟楣主任中藥師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

取3批樣品（批號：20150507、20150903、20151216）粉末少許，備用。分別按復(fù)方守宮散處方和工藝制備缺壁虎、梅花的單一陰性對照品。按2015年版《中國藥典》“通則2001”項下的顯微鑒別法，采用粉末制片法，分別置于載玻片上，加水合氯醛透化，裝片，置于電子顯微鏡下觀察，拍照并保存圖像。從樣品粉末中主要成分的顯微特征方面進行顯微鑒別，并對其顯微特征加以歸納總結(jié)。

2.1.1 壁虎 （1）皮膚碎片。3批樣品均可觀察到壁虎皮膚碎片，且陰性對照無干擾。壁虎皮膚碎片的具體顯微特征概括如下：皮膚碎片較多見，呈淺棕色或黃褐色，團塊狀，表面觀察細胞界限不清楚，密布有棕色或黑色色素顆粒，色素顆粒多聚集呈星芒狀，分枝較多[6-7]，詳見圖1。

圖1 壁虎皮膚碎片的顯微鑒別圖（200×）Fig 1 Microscopic identification of skin fragments of Gekko.japonicas（200×）

（2）鱗片。3批樣品均可觀察到壁虎鱗片，且陰性對照無干擾。壁虎鱗片的具體顯微特征概括如下：鱗片邊緣多無色透明，單個鱗片較大，呈卵圓形、多角形、類三角形或類六角形，多呈覆瓦狀排列，鱗片中分布有細小的棕褐色至黑色的組織色素顆粒[6-7]，詳見圖2。

圖2 壁虎鱗片的顯微鑒別圖（400×）Fig 2 Microscopic identification of the scales of G.japonicas（400×）

2.1.2 梅花 3批樣品均可觀察到梅花花粉粒，且陰性對照無干擾。梅花花粉粒的具體顯微特征概括如下：花粉粒類球圓形或鈍三角形，直徑35～45 μm，表面光滑，具3個萌發(fā)孔[8]，詳見圖3。

圖3 梅花花粉粒的顯微鑒別圖（200×）Fig 3 Microscopic identification of the pollen grains ofA.mume（200×）

2.2 制何首烏的TLC鑒別

取樣品5 g，加稀乙醇40 mL，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，搖勻，靜置，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取二苯乙烯苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成二苯乙烯苷質(zhì)量濃度為20μg/mL的對照品溶液。按復(fù)方守宮散處方和工藝制備缺制何首烏的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][8]試驗，吸取上述供試品溶液和對照品溶液各5μL、陰性對照溶液2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（7∶3，V/V）為展開劑，展至約3.5 cm，展開，取出，晾干，再以三氯甲烷-甲醇（20∶1，V/V）為展開劑，展開至約7 cm，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖4。

圖4 薄層色譜圖Fig 4 TLC chromatograms

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（19∶81，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：320 nm；柱溫：25 ℃：進樣量：10 μL[9]。

2.3.2 對照品溶液的制備 取二苯乙烯苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成二苯乙烯苷質(zhì)量濃度為0.23 mg/mL的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取樣品約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加稀乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用稀乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 按復(fù)方守宮散處方和工藝制備缺制何首烏的陰性樣品，并按“2.3.3”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.3.2”“2.3.3”“2.3.4”項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖5。結(jié)果，供試品色譜中二苯乙烯苷峰的保留時間與二苯乙烯苷對照品的保留時間一致，且與其他物質(zhì)峰分離度＞1.5，理論板數(shù)按二苯乙烯苷峰計為12 553（將理論板數(shù)定為不少于2 000為宜）；陰性對照色譜中，在供試品色譜中二苯乙烯苷峰相應(yīng)的保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對照無干擾。

圖5 高效液相色譜圖Fig 5 HPLC chromatograms

2.3.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取對照品溶液（0.46 mg/mL）0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加稀乙醇定容，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各10 μL，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以二苯乙烯苷質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程y＝23.371x－1.115 9（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，二苯乙烯苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍為23～368 μg/mL。

2.3.7 精密度試驗 取“2.3.2”項下對照品溶液適量，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，二苯乙烯苷峰面積的RSD＝0.49%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.3”項下供試品溶液（批號：20150507）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，二苯乙烯苷峰面積的RSD＝0.39%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.9 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品（批號：20150507）適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，二苯乙烯苷峰面積的RSD＝0.71%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（批號：20150507）適量，共6份，分別加入低、中、高質(zhì)量的二苯乙烯苷對照品，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.3.11 樣品含量測定 取6批樣品各適量，分別按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

筆者參考2015年版《中國藥典》和相關(guān)文獻資料，綜合考慮用顯微鑒別法比較方便、快捷，更適合散劑的質(zhì)量控制。因此，筆者選擇對制劑中的壁虎、梅花、制何首烏、三七、人參等藥味分別進行了顯微鑒別研究。結(jié)果，壁虎的皮膚碎片和鱗片、梅花的花粉粒的顯微鑒別特征較為明顯，陰性對照無干擾，且方法重復(fù)性好，而其他藥味顯微鑒別均存在不同程度的陰性對照干擾。TLC鑒別中，筆者發(fā)現(xiàn)，制劑中制何首烏的薄層色譜斑點清晰，分離度好，且陰性對照無干擾。因此，壁虎和梅花的顯微鑒別法、制何首烏的TLC鑒別法均可作為定性鑒別考察指標，建議納入復(fù)方守宮散的質(zhì)量標準修訂草案。

預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，制何首烏中的水溶性成分二苯乙烯苷含量很高，而2015年版《中國藥典》（一部）制何首烏的含量測定項下收載了HPLC法測定二苯乙烯苷含量的具體方法[8]。因此，本研究確定以二苯乙烯苷作為制劑的質(zhì)量控制指標。筆者參考文獻[9-11]建立了制劑中二苯乙烯苷的HPLC含量測定方法，經(jīng)方法學(xué)考察證實本方法簡便、準確、可靠、重復(fù)性好，可有效控制該制劑質(zhì)量。

綜上所述，本研究所建立的標準提高方法能更加有效地控制復(fù)方守宮散的質(zhì)量。

[1]胡金鳳，夏黎明.復(fù)方守宮散臨床療效的研究現(xiàn)狀[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2015，27（10）：1486-1488.

[2]張良軍，夏黎明.復(fù)方守宮散聯(lián)合化療治療晚期或術(shù)后復(fù)發(fā)胃癌30例[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（5）：837-839.

[3]許曉洲，蘇麗，凡巧云.復(fù)方守宮散聯(lián)合放療化療治療局部晚期非小細胞肺癌90例[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，29（3）：15-17.

[4]盧會琴.復(fù)方守宮散治療癌因性疲乏的臨床研究[D].合肥：安徽中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[5]孫彤，王曙光，吳飛雪，等.復(fù)方守宮散治療腫瘤惡病質(zhì)的臨床觀察[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，22（6）：19-20.

[6]包華音，石俊英.壁虎藥材顯微鑒別質(zhì)量標準研究[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，38（5）：496-497.

[7]陳明，王玉蘭.無蹼壁虎的生藥學(xué)鑒定[J].福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1995，5（1）：31-32.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：176-177、311.

[9]劉志輝，錢芳，陸超.HPLC法測定首烏軟膠囊中二苯乙烯苷的含量[J].中國藥事，2009，23（2）：131-133.

[10]李林福.制何首烏化學(xué)成分及其質(zhì)量標準研究[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院，2008.

[11]李奇，王伽伯，肖小河，等.何首烏不同提取物清除羥自由基的活性研究[J].中國藥房，2013，24（19）：1760-1762.

Study on the Improvement of Quality Standard of Compound Shougong Powder

WANG Xiaoyu，MENG Mei，WANG Yongzhong（Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Anhui University of TCM/Third Level Lab of TCM Preparation，State Administration of TCM，Hefei 230031，China）

R927

A

1001-0408（2017）27-3832-04

2016-11-28

2017-02-19）

（編輯：張 靜）

國家科技支撐計劃新安醫(yī)學(xué)傳承與發(fā)展研究項目（No.2012BAI26B03）

＊主管藥師，博士。研究方向：中藥新藥研發(fā)。電話：0551-62838558。E-mail：kane.wang@sohu.com

#通信作者：主任中藥師，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥新藥研發(fā)。電話：0551-62838558。E-mail：ahzyymm@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.24