腦得生固體分散體膠囊的HPLC指紋圖譜研究Δ

羅蘭，李明麗，康家珍，2，3，王淑美，2，3，梁生旺，2，3#（.廣東藥科大學中藥學院，廣州50006；2.廣東藥科大學國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點研究室，廣州 50006；3.廣東藥科大學廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣州 50006）

腦得生固體分散體膠囊的HPLC指紋圖譜研究Δ

羅蘭1，2，3＊，李明麗1，康家珍1，2，3，王淑美1，2，3，梁生旺1，2，3#（1.廣東藥科大學中藥學院，廣州510006；2.廣東藥科大學國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點研究室，廣州 510006；3.廣東藥科大學廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣州 510006）

目的：建立腦得生固體分散體膠囊的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Hyspersil ODS2，流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm（葛根素）、345 nm（羥基紅花黃色素A），柱溫為30℃，進樣量為10 μL。以葛根素、羥基紅花黃色素A為參照，測定10批樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進行相似度評價，共有峰指認及其化學成分確認。結(jié)果：在210、345 nm波長處，10批樣品的HPLC圖譜分別有29、23個共有峰；相似度均＞0.90；各共有峰藥材歸屬分別為三七、川芎、紅花、葛根、山楂；在210、345 nm波長處各確認了7種化學成分。結(jié)論：該研究所建HPLC指紋圖譜可為腦得生固體分散體膠囊的鑒別和質(zhì)量評價提供參考。

腦得生固體分散體膠囊；高效液相色譜法；指紋圖譜

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish HPLC fingerprints of Naodesheng solid dispersion capsules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Hyspersil ODS2 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were 210 nm（puerarin），345 nm（hydroxfsafflor yellow A）.The column temperature was 30 ℃，and sample size was 10 μL.Using puerarin and hydroxysafflor yellow A as reference，HPLC fingerprints of 10 batches of sample were determined.Similarity evaluation，common peak identification and chemical components confirmation were performed by using Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprints（2012 edition）.RESULTS：There were 29 and 23 common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of samples at 210 nm and 345 nm，respectively.The similarity was higher than 0.90.The medicinal material attribute of common peaks were Panax notoginseng，Ligusticum chuanxiong，Carthamus tinctorius，Pueraia lobata and Crataegus pinnatifida.Moreover，7 chemical components were identified at 210，345 nm，respectively.CONCLUSIONS：Established HPLC fingerprints can provide reference for identification and quality evaluation of Naodesheng solid dispersion capsules.

KEYWORDSNaodesheng solid dispersion capsules；HPLC；Fingerprint

腦得生固體分散體膠囊是由三七、川芎、紅花、葛根、山楂（去核）組合而成的中成藥，具有活血化瘀、疏風通經(jīng)、醒腦開竅的功效，臨床上用于治療腦動脈硬化、缺血性腦中風及腦出血后遺癥等，療效顯著[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，腦得生固體分散體膠囊所含藥材的有效成分具有抗模型大鼠腦缺血自由基損傷和改善腦血管循環(huán)障礙、降低腦缺血模型大鼠全血黏度水平的作用[3-4]。此外，腦得生固體分散體膠囊能降低腦缺血模型大鼠的腦含水量，對腦局部缺血具有保護作用[5]。

本課題組前期優(yōu)化了固體分散體制備工藝，采用熔融法，以PEG6000為載體，藥載比為1∶2（m/m），對所制的腦得生固體分散體膠囊進行質(zhì)量考察，經(jīng)檢測符合2015年版《中國藥典》（二部）項下膠囊和固體分散體的各項檢查。腦得生固體分散體膠囊較普通膠囊提高了體外溶出度，溶出效果好。本試驗采用高效液相色譜法（HPLC）[6-10]，分別在210、345 nm波長處建立10批腦得生固體分散體膠囊HPLC指紋圖譜，并對14個化學成分進行了鑒定，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括2996型二極管激光陣列檢測器（美國Waters公司）；BSZZ4S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

腦得生固體分散體膠囊（廣東藥科大學中藥學院中藥分析實驗室自制，批號：091102、091109、091116、091123、091123、091129、091206、091213、091220、091227（S1～S10），規(guī)格：0.28 g/粒，相當于1.37 g藥材/粒）；三七皂苷R1對照品（批號：110745-200415）、人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-200726）、人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-200318）、葛根素對照品（批號：110752-200108）、阿魏酸對照品（批號：110773-200002）、羥基紅花黃色素A對照品（批號：111637-200502）、金絲桃苷對照品（批號：111521-200303）、牡荊素對照品（批號：111687-200501）、牡荊素鼠李糖苷對照品（批號：111668-200401）、蘆丁對照品（批號：100080-200306）、槲皮素對照品（批號：111632-200506）均購自中國食品藥品檢定研究院；大豆苷對照品（上海君創(chuàng)生物科技有限公司，批號：Th0110020）；大豆苷元對照品（批號：08-0137）、染料木素對照品（批號：08-0118）均購自上海順勃生物工程有限公司，以上對照品純度均＞98%；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hyspersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm（葛根素）、345 nm（羥基紅花黃色素A）；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取各待測成分對照品適量，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成單一對照品溶液。精密量取上述單一對照品溶液各1.0 mL，置于20 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品10粒，全部傾出內(nèi)容物，混勻，取約1.5 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）提取30 min，室溫冷卻后，再次稱定質(zhì)量，加70%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，既得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，在210 nm波長處，以葛根素的保留時間和峰面積為參照，在345 nm波長處，以羥基紅花黃色素A的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，在210 nm波長處，29個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6）；在345 nm波長處，23個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：091102）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、18、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，在210 nm波長處，以葛根素的保留時間和峰面積為參照，在345 nm波長處，以羥基紅花黃色素A的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，在210 nm波長處，29個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝7）；在345 nm波長處，23個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝7），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（批號：091102）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，在210 nm波長處，以葛根素的保留時間和峰面積為參照，在345 nm波長處，以羥基紅花黃色素A的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，在210 nm波長處，29個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6）；在345 nm波長處，23個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成及共有峰相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對10批樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 共有峰的歸屬和指認 比較圖2中各圖譜，并對HPLC圖譜共有峰進行歸屬。結(jié)果顯示，在210 nm波長處，樣品HPLC圖譜29個共有峰中9、15、16、20、21、24、25、26、28、29號色譜峰來源于三七；8、13號色譜峰來源于川芎；1、11、14、19號色譜峰來源于紅花；3、4、5、6、7、8、11、12、13、17、18、22、23號色譜峰來源于葛根；2、10、11、12、27號色譜峰來源于山楂。在345 nm波長處，樣品HPLC圖譜23個共有峰中10、18、20、21、23號色譜峰來源于三七；9、15、16、20號色譜峰來源于川芎；1、3、14、17、19、20號色譜峰來源于紅花；4、5、6、7、8、14、16、22號色譜峰來源于葛根；2、11、12、13、14、19號色譜峰來源于山楂。在210 nm波長處，共有峰中3、6、17、20、21、23、25號峰被分別指認為葛根素、大豆苷、大豆苷元、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、染料木素、人參皂苷Rb1；在345 nm波長處，3、9、11、12、13、14、19號峰被分別指認為羥基紅花黃色素A、阿魏酸、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素。

圖1 10批樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 10 batches of samples

圖2 樣品HPLC對照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprints of samples

2.4.3 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對10批樣品的HPLC圖譜進行比較分析。結(jié)果，在210、345 nm波長處，10批樣品（S1～S10）相似度均在0.90～0.99范圍內(nèi)，表明10批樣品HPLC圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性。

2.4.4 共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對10批樣品的HPLC圖譜進行比較分析。在210、345 nm波長處，10批樣品分別共有29、23個特征峰，通過對照品HPLC色譜確定3號峰為葛根素（210 nm）、羥基紅花黃色素A（345 nm）。以3號峰為參照峰，計算其他特征峰相對于3號峰的相對保留時間。結(jié)果，在210 nm波長處，各共有特征峰的相對保留時間的RSD均＜0.96%；在345 nm波長處，各共有特征峰的相對保留時間的RSD均＜1.23%，詳見表2、表3。

表2 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時間（210 nm）Tab 2 Relative retention time of common peaks for HPLC chromatograms of 10 batches of samples（210 nm）

3 討論

本試驗根據(jù)腦得生固體分散體膠囊有效部位中黃酮類、皂苷類、有機酸三大類成分的性質(zhì)，反復優(yōu)化以選取最佳色譜條件?？紤]到乙腈具有末端吸收和黏度較小的優(yōu)勢，筆者只對乙腈-酸系統(tǒng)進行考察，主要考察了乙腈-磷酸溶液和乙腈-醋酸溶液作為供試品分離的流動相。由于醋酸的揮發(fā)性較大，易導致流動相系統(tǒng)不穩(wěn)定，故圖譜存在重復性差的問題，而乙腈-磷酸溶液流動相系統(tǒng)檢測出的圖譜分離度、穩(wěn)定性、重復性均較好，可以作為本試驗的流動相。由于本制劑化學成分復雜，且極性相差較大，等度洗脫難以實現(xiàn)成分分離，故采用梯度洗脫以兼顧偏強極性和弱極性成分的分析，得到的信息量較為豐富，各成分峰形尖銳且分離度較好。故確定乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動相，方式為梯度洗脫。

表3 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時間（345 nm）Tab 3 Relative retention time of common peaks for HPLC chromatograms of 10 batches of samples（345 nm）

本試驗考察了同一色譜條件下，4個不同柱溫（20、25、30、35℃）對腦得生固體分散體膠囊有效部位分離效果的影響。結(jié)果表明，柱溫越高，分離效果越好，但考慮到色譜柱的使用壽命，在分離度良好的前提下，選擇30℃為色譜柱的柱溫。

本試驗對檢測波長進行了篩選。將供試品溶液于190～500 nm波長掃描，發(fā)現(xiàn)在210、250、345和400 nm波長處均有較強吸收。比較這4個波長下的HPLC圖譜，由于各成分最大吸收波長差異較大，故確定210 nm和345 nm為測定檢測波長。本試驗建立的色譜方法可在140 min內(nèi)展開本制劑主要有效成分，并使大部分色譜峰達到基線分離，但由于流動相梯度變化較大，使得基線有些漂移。

本試驗采用同一批藥材自制了10批樣品，對其指紋色譜進行測定。結(jié)果，在210、345 nm波長處，各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均符合指紋圖譜要求。同時，本試驗闡明了腦得生固體分散體膠囊指紋圖譜中共有峰的藥材來源，并對其中14個共有峰進行了化學成分確定。由于對照品的有限，對有效部位的化學成分歸屬和確定還需進一步研究。

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Study on HPLC Fingerprints of Naodesheng Solid Dispersion Capsules

LUO Lan1，2，3，LI Mingli1，KANG Jiazhen1，2，3，WANG Shumei1，2，3，LIANG Shengwang1，2，3（1.College of TCM，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.State Key Laboratory of TCM Digital Quality Evaluation Technology，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；3.Engineering Technology Research Center for TCM Quality of the Universities of Guangdong，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

R917

A

1001-0408（2017）27-3828-04

2016-10-20

2016-12-14）

（編輯：張 靜）

國家自然科學基金資助項目（No.81274059）

＊高級實驗師，博士。研究方向：中藥復方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。電話：020-39352672

#通信作者：教授，博士生導師。研究方向：中藥復方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。E-mail：swliang371@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.23