TLS9a核酸適配體對小鼠肝癌細胞的靶向作用研究

魏莉平,王鍍津,鄒甜甜,費安興△

(1.湖北省黃石市婦幼保健院團城山院區(qū)檢驗科 435000;2.湖北省黃石市中心醫(yī)院檢驗科 435000)

論著·基礎研究

TLS9a核酸適配體對小鼠肝癌細胞的靶向作用研究

魏莉平1,王鍍津2,鄒甜甜1,費安興1△

(1.湖北省黃石市婦幼保健院團城山院區(qū)檢驗科 435000;2.湖北省黃石市中心醫(yī)院檢驗科 435000)

目的探討TLS9a核酸適配體對小鼠肝癌細胞的靶向作用。方法制備馬來酰亞胺修飾的裝載阿霉素的脂質體(liposome)，合成FITC熒光及巰基修飾的TLS9a核酸適配體，并將其耦聯到脂質體表面。紫外分光光度法檢測阿霉素包封率。動態(tài)光散射法(DLS)測納米粒子粒徑大小及電位分布，倒置熒光顯微鏡觀察小鼠肝癌細胞對阿霉素攝入及用流式細胞技術檢測平均熒光強度，評估小鼠肝癌細胞對藥物攝入量。四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞活性。結果流式細胞術檢測TLS9a核酸適配體與BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌細胞結合率為54.1%,TLS9a耦聯的脂質體平均粒徑分布在(116.0±5.0)nm。TLS9a-liposome/DOX在pH 5.0的環(huán)境中可以快速釋放化療藥物DOX，72 h藥物釋放量超過70%。TLS9a-liposome/DOX在體外能夠有效抑制小鼠肝癌細胞BNL.1ME.A.7R.1生長。結論TLS9a核酸適配體可以特異性與小鼠肝癌細胞BNL.1ME.A.7R.1結合，可用于檢測小鼠肝癌細胞。

肝腫瘤；核酸適配體；TLS9a；靶向治療；小鼠肝癌細胞

盡管化療藥物廣泛應用于癌癥治療，但由于他們不具備腫瘤特異性，而在臨床的應用中受到限制。因此，發(fā)展有效且具有主動靶向功能的化療藥物運輸平臺成為納米醫(yī)藥領域研究的熱點。寡核苷酸適配體不僅能提供與抗體類似的結合效率，同時具備低免疫原、高穩(wěn)定、合成簡單和易改等優(yōu)點，是應用于靶向藥物釋放的一種較好的選擇。TLS9a適配體是由Shangguan等[1]于2008年利用cell-SELEX技術篩選出的一種核酸適配體，其序列為5′-AGT CCA TTT TAT TCC TGA ATA TTT GTT AAC CTC ATG GAC-3′，能夠特異性地與小鼠肝癌細胞系BNL.1ME.A.7R.1結合，而與小鼠胚胎肝細胞BNL.CL.2結合能力弱，是一種具有潛在應用價值的靶向分子。本研究將熒光標記的TLS9a核酸適配體應用于流式細胞技術來檢測游離單個小鼠肝癌細胞，為小鼠肝癌細胞的檢測和診斷提供了新的思路。同時，本課題組利用TLS9a核酸適配體作為主動靶向分子，成功構建TLS9a核酸適配體耦聯的脂質體，并在體外考察其藥物釋放及抗小鼠肝癌細胞效應。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (PEG2000-DSPE)、α-生育酚(α-tocopherol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰亞胺(MAL-PEG2000-DSPE)購自美國Avanti公司；FITC與巰基雙標的TLS9a核酸適配體購自上海生物工程股份有限公司；阿霉素(DOX)購自美國Sigma公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。其他試劑為實驗室常用分析純級。

1.1.2細胞 BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌細胞系，BNL.CL.2小鼠胚胎肝細胞系購自ATCC中國代理公司。

1.2方法

1.2.1流式細胞技術檢測核酸適配體與小鼠肝癌細胞結合率 收集對數期生長的BNL.1ME.A.7R.1 和BNL.CL.2細胞(1×106)，重懸在50 μL清洗緩沖液中[4.5 g/L葡萄糖和5 mmol/L MgCl2的磷酸鹽緩沖液(PBS)]，同時加入40 μL黏附緩沖液[0.2 mg/mL轉移核糖核酸酵母(yeast tRNA)和2.0 mg/mL牛血清清蛋白(BSA)的清洗緩沖液]和10 μL胎牛血清。加入FITC標記的TLS9a適配體，使其終濃度為25 nmol/L。4 ℃孵育30 min。用清洗緩沖液清洗3次，最后細胞重懸在500 μL清洗緩沖液中上流式細胞儀檢測。

1.2.2馬來酰亞胺修飾的脂質體(TSL9a-liposome)制備 10 μmol脂質體(POPC∶PEG2000-DSPE∶α-tocopherol∶MAL-PEG2000-DSPE 物質量比例為1.0∶1.0∶0.1∶0.1)溶解在1 mL氯仿中。加到圓底燒瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀上抽真空10 min使氯仿完全揮發(fā)。室溫真空干燥4 h，取出加入1 mL的D-Hank′s緩沖液(pH 6.5)超聲波恒溫水浴5 min，使其形成脂質體懸液，將上述溶液加入擠推器中的玻璃注射器中，分別過孔徑為200 nm及100 nm的聚碳酸酯膜各20次以上，即得到馬來酰亞胺修飾的脂質體。

1.2.3TLS9a核酸適配體耦聯的脂質體制備 將TLS9a和MAL-PEG2000-DSPE(1∶10)加入到上述制備的馬來酰亞胺修飾的從脂質體中，混勻，氮氣保護下4 ℃孵育24 h，最后產物用超濾濃縮管(3 500 MWCO)清洗3次,去除未結合的小分子物質,產物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4TLS9a-liposome包封DOX 將脂質體pH值調整到7.5，與脂質體按照物質量比例為1∶10加入，37 ℃振蕩孵育4 h,透析去除未包封的DOX，終產物4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｗ贤夥止夤舛确z測上清液中DOX水平，計算包封率。

1.2.5適配體修飾的脂質體粒徑電位檢測 利用動態(tài)光散射法(DLS)測量納米材料的粒徑和電位分布圖。取適量脂質體溶于1 mL去離子水，25 ℃環(huán)境下檢測納米材料粒徑和電位分布，重復3次。

1.2.6納米材料體外藥物釋放考察 分別配置pH 7.4和pH 5.0的PBS，將載藥脂質體濃度調整到1 mg DOX/mL濃度，加入到透析袋中(截留相對分子質量為3 500)，分別置于30 mL pH 7.4和pH 5.0的PBS中。在避光條件下，37 ℃ 100 r/min水浴振蕩。在預定的時間取500 μL透析液用熒光光度計測算藥物釋放量。重復3次計算平均值。

1.2.7評估DOX攝入量 在6孔板內接種BNL.1ME.A.7R.1(3×105/孔)細胞，培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為10 μg/mL的liposome/DOX、TLS9a-liposome/DOX,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)1 h，收集細胞，PBS洗3次，500 μL重懸，流式細胞儀檢測每組收集的10 000細胞，得到DOX熒光強度。分別收集上述細胞1×106，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.2 mg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色15 min，PBS重懸，1 000 r/min離心6 min，清洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀察小鼠肝癌細胞對DOX的攝入量。

1.2.8MTT法評估靶向藥物體外殺傷效果 BNL.1ME.A.7R.1細胞(1×104/孔)接種于96孔板，每組重復8孔，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度的DOX、liposome/DOX、TLS9a -liposome/DOX，再培養(yǎng)24 h，移除培養(yǎng)液，加入100 μL不含血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，20 μL MTT液，培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，100 r/min室溫搖床振蕩10 min。酶標儀上490 nm波長處檢測吸光度值。計算細胞活力。

2 結 果

2.1TLS9a用于檢測小鼠肝癌細胞 TLS9a核酸適配體可以特異性地與BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌細胞結合，25 nmol/L時的結合率為54.1%，而與正常的小鼠胚胎肝細胞BNL.CL.2的結合率只有6.4%，見圖1。

A:BNL.CL.2細胞(對照);B:BNL.CL.2細胞與25 nmol/L FITC標記的TLS9a核酸適配體;C:BNL.1ME.A.7R.1細胞(對照);D:BNL.1ME.A.7R.1細胞與25 nmol/L FITC標記的TLS9a核酸適配體

圖1流式細胞儀檢測TLS9a與小鼠肝癌細胞的結合率

2.2TLS9a核酸適配體耦聯的脂質體表征 本實驗中制備的TLS9a-liposome粒徑和電位分布如圖2所示。liposome納米材料粒徑分布在(109.0±3.1)nm,TLS9a -liposome納米材料粒徑分布在(116.0±5.0)nm;liposome電位分布在+30 mV左右，TLS9a-liposome電位分布在-23 mV左右，見圖2。

A：liposome粒徑分布圖;B：liposome電位分布圖;C：TLS9a-liposome粒徑分布圖;D：TLS9a-liposome電位分布圖

圖2 DLS檢測liposome及TLS9a-liposome納米粒子粒徑和電位分布圖

2.3TLS9a-liposome體外藥物釋放測定 TLS9a-liposome在pH 7.4的環(huán)境中72 h內藥物釋放不超過20%，而在pH 5.0的環(huán)境中累積釋放超過70%，人體體液循環(huán)中的pH值接近7.4，腫瘤微環(huán)境中pH值處于酸性環(huán)境,見圖3。

2.4TLS9a-liposome靶向釋放藥物測定 修飾后TLS9a-liposome能明顯提高小鼠肝癌細胞對DOX的攝入量。圖4A中藍色為細胞核，紅色為DOX，可見耦聯TLS9a-liposome組紅色熒光明顯強于未修飾靶向分子組；TLS9a-liposome組細胞內DOX熒光曲線明顯右移，見圖4B。

圖3 TLS9a -liposome/DOX納米材料在不同pH值下藥物釋放結果

A：熒光顯微鏡檢測DOX攝入量；B：流式細胞術檢測藥物攝入量

圖4 BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌細胞DOX攝入效果評估

*：P<0.05，與liposome/DOX比較

圖5 MTT法檢測結果

2.5MTT法檢測不同濃度的TLS9a-liposome/DOX對小鼠肝癌細胞抑制率 TLS9a-liposome/DOX比liposome/DOX對小鼠肝癌細胞抑制能力更強，見圖5。

3 討 論

核酸適配體在生物傳感、生物檢測和生物靶向治療方面受到越來越多的重視[2-6]。適配體是小的DNA或RNA鏈，免疫原性極低，對人體無毒副作用。現今的技術可以篩選得到很多針對人肝癌的特異性適配體，將其應用到生物醫(yī)藥靶向診治領域前景極其廣闊，必將產生極大的社會和經濟效應。利用核酸適配體構建各種新型的生物傳感器用于腫瘤檢測的研究也給臨床診斷帶來了新的希望[7-8]。

本研究在核酸適配體TLS9a上修飾FITC熒光基團，通過流式細胞術可以用于檢測BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌細胞。相對于傳統(tǒng)的檢測方法，核酸適配體價格低廉、合成簡單、易于修飾，為腫瘤的臨床診斷與檢測方法提供了新的思路[9]。脂質體是一種已經應用于臨床的傳統(tǒng)納米材料，具有很好的生物相容性，被廣泛應用于生物醫(yī)藥領域[10-11]。DOX因其極大的不良反應而在臨床上受到極大限制[12-13]。本實驗通過在脂質體表面修飾TLS9a核酸適配體，實現化療藥物的主動靶向釋放，使小鼠肝癌細胞對化療藥物的攝入量增加，從而提高化療藥物對小鼠肝癌細胞的殺傷效果。同時本研究發(fā)現TLS9a-liposome/DOX在模擬體內pH7.4環(huán)境時藥物釋放量很低，而在腫瘤局部酸性環(huán)境下可以快速持久釋放藥物，這說明TLS9a-liposome納米材料在體循環(huán)中能保持相對穩(wěn)定狀態(tài)，并能減少化療藥物在到達腫瘤部位前的泄露，從而避免化療藥物對人體產生較大的不良反應。伴隨著生物靶向治療的興起，適配體修飾的各種靶向載體必將不斷涌現[14-15]，這為生物靶向治療提供了很好的發(fā)展契機。

綜上所述，標記熒光基團的TLS9a核酸適配體可以用于小鼠肝癌細胞的檢測，并且TLS9a-liposome/DOX納米載體可以有效靶向釋放化療藥物，從而提高化療藥物對小鼠肝癌細胞的殺傷能力。隨著篩選方法的不斷創(chuàng)新，新型的適配體也將源源不斷出現，這將給臨床對腫瘤的診斷檢測和納米醫(yī)藥領域的發(fā)展提供新的機遇。

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TargetingeffectofTLS9anucleicacidaptameronmicehepaticcancercells

WeiLiping1,WangDujin2,ZouTiantian1，FeiAnxing1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TuanchengshanBranchHospital,HuangshiMunicipalMaternalandChildHealthCareHospital,Huangshi,Hubei435000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,HuangshiMunicipalCentralHospital,Huangshi,Hubei435000,China)

ObjectiveTo investigate the targeting effect of TLS9a nucleic acid aptamer on mice hepatic cancer cells.MethodsThe liposome modified with maleimide and loading doxorubicin(DOX) was prepared,then TLS9a nucleic acid aptamer modified by FITC fluorescence and sulfydryl was synthesized,which was coupled to the liposome surface.The entrapment efficiency of DOX was detected by UV spectrophotometry.The dynamic light scattering(DLS) was applied to measure the particle size of nanoparticles and the potential distribution.The uptake of DOX in mice hepatic cancer cells was detected by the Nikon inverted microscope and the mean fluorescence intensity of liposome/DOX and TLS9a -liposome/DOX was detected by flow cytometry.The cells activity was detected by MTT.ResultsFlow cytometry assay showed that the binding rate of TLS9a nucleic acid aptamer with BNL.1ME.A.7R.1 mice hepatic cancer cells was 54.1%.TLS9a-liposome particle size distribution was in (116.0±5.0)nm.TLS9a-liposome/DOX released DOX quickly at pH 5.0,and the release amount in 72 h was more than 70% of the total release amount.TLS9a-liposome/DOX effectively inhibited the growth of mice hepatic cancer cells BNL.1ME.A.7R.1.ConclusionTLS9a nucleic acid aptamer could specifically combined with mice hepatic cancer cells BNL.1ME.A.7R.1,which could be used to detect mice hepatic cancer cells.

liver neoplasms;nucleic acid aptamer;TLS9a;targeted therapy;mice hepatic cancer cells

R73-36

A

1671-8348(2017)26-3623-03

2017-02-18

2017-06-06)

魏莉平(1986-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤生物靶向診斷方面研究。△

，E-mail:809427843@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.008