1,25(OH)2D3對(duì)潰瘍性腸炎小鼠紅細(xì)胞及脾臟免疫功能的影響

趙紅偉，張 建，和麗麗，郎曉猛，朱葉珊，劉建平△

(1.河北省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，石家莊 050051；2.河北省人民醫(yī)院老年病科，石家莊 050051；3.河北省中醫(yī)院脾胃科，石家莊 050071；4.河北省唐山市中醫(yī)院脾胃科 063000)

論著·基礎(chǔ)研究

1,25(OH)2D3對(duì)潰瘍性腸炎小鼠紅細(xì)胞及脾臟免疫功能的影響

趙紅偉1，張 建1，和麗麗2，郎曉猛3，朱葉珊4，劉建平3△

(1.河北省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，石家莊 050051；2.河北省人民醫(yī)院老年病科，石家莊 050051；3.河北省中醫(yī)院脾胃科，石家莊 050071；4.河北省唐山市中醫(yī)院脾胃科 063000)

目的探討1,25-二羥基維生素D3[1,25(OH)2D3]對(duì)腸炎模型小鼠紅細(xì)胞、脾臟免疫機(jī)制的作用。方法30只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、1,25(OH)2D3組，建立動(dòng)物模型；觀察小鼠一般情況、結(jié)腸病理變化，酵母菌花環(huán)法檢測(cè)紅細(xì)胞免疫復(fù)合物(RCIC)和紅細(xì)胞表面C3b受體(RC3bR)花環(huán)變化，測(cè)量脾臟質(zhì)量、長(zhǎng)度，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)脾臟免疫細(xì)胞陽(yáng)性率。結(jié)果與模型組比較，1,25(OH)2D3組、空白對(duì)照組血中RBC-C3bR明顯增高，紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)(RBC-ICR)明顯降低(P<0.01)。與空白對(duì)照組相比，模型組脾臟單個(gè)核細(xì)胞中CD3、CD4、CD8、CD45R細(xì)胞陽(yáng)性率明顯升高(P<0.01)；經(jīng)1,25(OH)2D3干預(yù)后，1,25(OH)2D3組脾臟單個(gè)核細(xì)胞中CD3、CD4、CD8、CD45R細(xì)胞陽(yáng)性率與模型組比較明顯下降(P<0.01)。結(jié)論1,25(OH)2D3對(duì)慢性腸炎的紅細(xì)胞及外周脾臟淋巴細(xì)胞均有免疫調(diào)節(jié)作用。

1,25(OH)2D3；紅細(xì)胞免疫；脾臟淋巴細(xì)胞；潰瘍性結(jié)腸炎；慢性動(dòng)物模型

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因尚不明確的慢性非特異性炎癥性結(jié)腸病變。根據(jù)流行病學(xué)資料提示，本病的發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外均有逐年上升的趨勢(shì)。此病遷延數(shù)月，反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的正常生活和工作。目前關(guān)于其發(fā)病機(jī)制的基本共識(shí)是：易感個(gè)體在特定的環(huán)境因素作用下，有害物質(zhì)觸發(fā)了機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)生并產(chǎn)生過(guò)度的級(jí)聯(lián)免疫反應(yīng)，使炎癥反復(fù)發(fā)生[1-2]；1,25-二羥維生素D3[1,25(OH)2D3]是維生素D的活性代謝產(chǎn)物，具有免疫調(diào)節(jié)作用，有研究顯示其可緩解UC癥狀[3-5]，本研究旨在探索1,25(OH)2D3對(duì)慢性UC模型小鼠的治療作用是否通過(guò)紅細(xì)胞免疫和脾臟淋巴細(xì)胞免疫機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 30只雄性C57BL/6小鼠(7～12周，體質(zhì)量18～22 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)；1,25(OH)2D3(瑞士羅氏有限公司)；右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS，相對(duì)分子質(zhì)量36 000～50 000，美國(guó)Sigma公司)；酵母多糖試劑；2%DSS配制：10 g DSS 溶于500 mL蒸餾水中，配成2%濃度的液體，放入4 ℃冰箱保存且備用。

1.2方法

1.2.1造模方法 動(dòng)物造模與實(shí)驗(yàn)分組慢性期造模及1,25(OH)2D3干預(yù)：30只雄性C57BL/6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分入空白對(duì)照組、模型組和1,25(OH)2D3組，每組10只。第1～28天空白對(duì)照組一直飲用蒸餾水；模型組和1,25(OH)2D3組小鼠飲用2%DSS的時(shí)間段分別為第1～5天、第8～12天、第15～19 天、第22～28天，其他時(shí)間段均飲用蒸餾水。各組在造模第14天時(shí)給予干預(yù)，空白對(duì)照組與模型組均給予等體積花生油灌胃以做對(duì)照，1,25(OH)2D3組給予1,25(OH)2D3(0.005 μg/d，溶于花生油中)灌胃干預(yù)，每天1次，共干預(yù)14 d；所有的動(dòng)物均在第29天處死。

A：空白對(duì)照組；B：模型組；C：1,25(OH)2D3組

圖1各組小鼠結(jié)腸黏膜組織光鏡下病理學(xué)表現(xiàn)(HE，×200)

1.2.2一般情況及結(jié)腸病理組織染色 從實(shí)驗(yàn)第1天開始每天觀察小鼠體質(zhì)量變化、便血情況、大便性狀、精神狀態(tài)、飲食等。在第29天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物，同時(shí)截取部分結(jié)腸段置于多聚甲醛內(nèi)固定，進(jìn)行包埋和切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，行組織病理學(xué)觀察。

1.2.3紅細(xì)胞免疫的檢測(cè) 紅細(xì)胞C3b受體酵母菌花環(huán)(RBC-C3bR)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)迅速?gòu)男∈笱矍蛉⊙? mL，注入枸櫞酸鈉抗凝管中離心，從上層取出血漿備用，從下層取出50 μL紅細(xì)胞加450 μL生理鹽水混勻，檢測(cè)紅細(xì)胞濃度，加生理鹽水稀釋，終濃度1.25×107/mL。將冷凍致敏酵母菌充分吹打混勻，50 μL配好紅細(xì)胞+50 μL血漿+50 μL酵母菌，50 μL配好紅細(xì)胞+50 μL酵母菌，混勻37 ℃水浴，加入0.25%戊二醛25 μL，分別取1/2的量以毛細(xì)吸管涂片，吹干，加2滴甲醇固定，瑞士染液與緩沖液(1∶3)染色30 s，自來(lái)水沖洗去染液，濕片鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞花環(huán)形成率(與紅細(xì)胞結(jié)合2個(gè)以上酵母菌)。同法檢測(cè)紅細(xì)胞表面C3b受體(RC3bR)。

1.2.4脾臟長(zhǎng)度和脾臟質(zhì)量的測(cè)量 第29天實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物后留取各組小鼠的脾臟，分別稱取、測(cè)量脾臟量長(zhǎng)度和質(zhì)量，并記錄，統(tǒng)計(jì)各組脾臟質(zhì)量、脾臟長(zhǎng)度的變化。

1.2.5脾臟中免疫細(xì)胞陽(yáng)性率的檢測(cè) 分離脾臟中單個(gè)核細(xì)胞，用生理鹽水漂洗2～3次，最終將其濃度調(diào)整為2×105/50 μL，第1管加入FITC標(biāo)記的免疫球蛋白G(IgG) 5.0 μL和PE-Cy5標(biāo)記的IgG2b 12.5 μL；第2管加入FITC標(biāo)記抗小鼠CD4+2.5 μL，PE-Cy5標(biāo)記的抗小鼠CD3+2.5 μL 和PE標(biāo)記的抗小鼠CD8+抗體2.5 μL；第3管加入FITC標(biāo)記CD45R 2.5 μL和IgG Cy5標(biāo)記CD3+2.5 μL；避光作用30 min后，生理鹽水洗1～3次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，100 μL生理鹽水重懸，用流式細(xì)胞儀熒光法檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況 從實(shí)驗(yàn)研究第1天開始，各組動(dòng)物的體質(zhì)量均增加，進(jìn)食及飲食均較多；從第3天開始模型組、1,25(OH)2D3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量開始逐漸下降，進(jìn)食量及飲水明顯減少，精神狀態(tài)差、大便松散，但無(wú)稀便，無(wú)黏液及膿血便；第13～15天時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量下降較明顯，精神萎靡，進(jìn)食量及飲水量均明顯減少，少動(dòng)并出現(xiàn)稀便，肛周可見黏液及膿血便；1,25(OH)2D3組從第14天起給予1,25(OH)2D3灌胃干預(yù)，干預(yù)后動(dòng)物的體質(zhì)量仍繼續(xù)下降，精神狀態(tài)差，并出現(xiàn)稀便及血便；自第17天起1,25(OH)2D3組中的動(dòng)物體質(zhì)量下降不明顯，基本平穩(wěn)，精神癥狀均有好轉(zhuǎn)，活動(dòng)增多；從第18天起，1,25(OH)2D3組動(dòng)物的體質(zhì)量逐漸增加，但不太明顯，大便稀且量多，便血不明顯，精神可，進(jìn)食及飲水增加；第29天，動(dòng)物的體質(zhì)量基本回到初始體質(zhì)量的水平，大便量多，稀松但無(wú)膿血，精神狀態(tài)良好，進(jìn)食及飲水量較正常。

2.2各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)腸組織病理學(xué)變化 空白對(duì)照組動(dòng)物的結(jié)腸病理光鏡下觀察可見黏膜光滑、完整，無(wú)缺損，無(wú)糜爛、水腫、充血等表現(xiàn)；模型組動(dòng)物的結(jié)腸病理光鏡下觀察可見結(jié)腸黏膜不完整、紊亂、缺損，可見黏膜、黏膜下層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩增生，炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，呈典型慢性炎癥改變。1,25(OH)2D3組結(jié)腸病理光鏡下觀察可見結(jié)腸黏膜稍完整，缺損不明顯，黏膜層及黏膜下層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減少，炎癥程度較模型組明顯減輕，見圖1。

2.3紅細(xì)胞免疫的檢測(cè) 與模型組比較，1,25(OH)2D3組、空白對(duì)照組血中RBC-C3bR明顯增高，紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)(RBC-ICR)明顯降低(P<0.01)，見表1。

表1 紅細(xì)胞免疫的比較

a：P<0.01，與模型組比較

2.4脾臟長(zhǎng)度、質(zhì)量的變化 3組小鼠脾臟長(zhǎng)度和質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組脾臟長(zhǎng)度和質(zhì)量比較

2.5脾臟CD3、CD4、CD8、CD45R細(xì)胞陽(yáng)性率的改變 與空白對(duì)照組相比，模型組脾臟單個(gè)核細(xì)胞中CD3、CD4、CD8、CD45R細(xì)胞陽(yáng)性率明顯升高(P<0.01)；經(jīng)1,25(OH)2D3干預(yù)后，1,25(OH)2D3組脾臟單個(gè)核細(xì)胞中CD3、CD4、CD8、CD45R細(xì)胞陽(yáng)性率與模型組比較明顯下降(P<0.01)，見表3。

表3 脾臟CD3、CD4、CD8、CD45R細(xì)胞陽(yáng)性率的改變

a：P<0.01，與模型組比較

3 討 論

UC發(fā)病機(jī)制目前認(rèn)為是有害物質(zhì)引起宿主反應(yīng)，使免疫失衡作用的結(jié)果，故免疫調(diào)節(jié)在本病的發(fā)病中起重要作用。1,25(OH)2D3是機(jī)體內(nèi)活性的維生素D，維生素D3受體在淋巴細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，從而在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究表明，IL-10敲除小鼠，當(dāng)維生素D缺乏時(shí)，小鼠很快自發(fā)便血、消耗等結(jié)腸炎癥狀并伴隨很高的病死率。給予足量的維生素D或1,25(OH)2D3會(huì)緩解癥狀[6-10]。

脾臟是重要的免疫器官，富含大量淋巴細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中起調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞，傳遞抗原信息，CD8+T細(xì)胞為抑制性和殺傷性T細(xì)胞，具有抑制CD4+T細(xì)胞的功能，也有免疫抑制作用，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值是反映T淋巴細(xì)胞活性的重要指標(biāo)。研究表明，人類紅細(xì)胞膜含有免疫黏附作用的C3b受體，它能清除血液循環(huán)中的免疫復(fù)合物。UC患者紅細(xì)胞免疫黏附功能降低，清除免疫復(fù)合物(CIC)的能力減退，使體內(nèi)CIC增高，即RBC-ICR增高，CIC可通過(guò)多種途徑引起免疫損傷，最終導(dǎo)致UC的發(fā)生[11-13]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2%DSS予小鼠飲用，可造成腹瀉、血便，體質(zhì)量下降等，結(jié)腸病理可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫，說(shuō)明模型復(fù)制成功。給予1,25(OH)2D3干預(yù)后黏膜組織水腫情況有明顯改善，增加血清中RC3bR水平，降低了免疫復(fù)合物在腸道黏膜上的大量沉積；使外周脾臟細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞降低，從而調(diào)節(jié)了免疫系統(tǒng)反應(yīng)，其機(jī)制可能是通過(guò)減少免疫細(xì)胞數(shù)量，降低免疫性細(xì)胞活性，從而降低炎性細(xì)胞因子對(duì)結(jié)腸黏膜的損傷。

[1]Dupont A,Kaconis Y,Yang I,et al.Intestinal mucus affinity and biological activity of an orally administered antibacterial and anti-inflammatory peptide[J].Gut,2015,64(2):222-232.

[2]Long TM,Nisa S,Donnenberg MS,et al.Enteropathogenic Escherichia coli inhibits type Ⅰ interferon-and RNase L-mediated host defense to disrupt intestinal epithelial cell barrier function[J].Infect Immun,2014,82(7):2802-2814.

[3]Mohammadi M,Zahedi MJ,Nikpoor AR,et al.Determination of vitamin D serum levels and status of the C3435T polymorphism of multidrug resistance 1 gene in southeastern iranian patients with ulcerative colitis[J].Middle East J Dig Dis,2015,7(4):245-252.

[4]Lima CA,Lyra AC,Rocha R,et al.Risk factors for osteoporosis in inflammatory bowel disease patients[J].World J Gastrointest Pathophysiol,2015,6(4):210-218.

[5]Amiriani T,Besharat S,Pourramezan Z,et al.Correlation between low bone density and disease activity in patients with ulcerative colitis[J].Middle East J Dig Dis,2015,7(1):25-30.

[6]Del PR,Pietropaoli D,Chandar AK,et al.Association between inflammatory bowel disease and vitamin D deficiency:a systematic review and meta-analysis[J].Inflamm Bowel Dis,2015,21(11):2708-2717.

[7]Krela-Ka?mierczak I,Szymczak A,Lykowska-Szuber L,et al.The importance of vitamin D in the pathology of bone metabolism in inflammatory bowel diseases[J].Arch Med Sci,2015,11(5):1028-1032.

[8]Piodi LP,Poloni A,Ulivieri FM.Managing osteoporosis in ulcerative colitis:something new[J].World J Gastroenterol,2014,20(39):14087-14098.

[9]Mouli VP,Ananthakrishnan AN.Review article:vitamin D and inflammatory bowel diseases[J].Aliment Pharmacol Ther,2014,39(2):125-136.

[10]Ananthakrishnan AN,Cheng SC,Cai T,et al.Association between reduced plasma 25-hydroxy vitamin D and increased risk of cancer in patients with inflammatory bowel diseases[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2014,12(5):821-827.

[11]Singh D,Srivastava S,Pradhan M,et al.Inflammatory bowel disease:pathogenesis,causative factors,issues,drug treatment strategies,and delivery approaches[J].Crit Rev Ther Drug Carrier Syst,2015,32(3):181-214.

[12]Stocco G,Cuzzoni E,De Iudicibus S,et al.Thiopurine metabolites variations during co-treatment with aminosalicylates for inflammatory bowel disease:effect of N-acetyl transferase polymorphisms[J].World J Gastroenterol,2015,21(12):3571-3578.

[13]Ricanek P,Lunde LK,Frye SA,et al.Reduced expression of aquaporins in human intestinal mucosa in early stage inflammatory bowel disease[J].Clin Exp Gastroenterol,2015(8):49-67.

Effectsof1,25-dihydroxyvitaminD3onimmunefunctionofRBCandspleeninulcerativecolitismice

ZhaoHongwei1,ZhangJian1，HeLili2，LangXiaomeng3，ZhuYeshan4，LiuJianping3△

(1.DepartmentofGastroenterology,HebeiProvincialPeople′sHospital,Shijiazhuang,Hebei050051,China;2.DepartmentofGerontology,HebeiProvincialPeople′sHospital,Shijiazhuang,Hebei050051,China;3.DepartmentofSpleenandStomach,HebeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Shijiazhuang,Hebei050071,China;4.DepartmentofSpleenandStomach,TangshanMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Tanghan,Hebei063000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of 1,25-dihydroxy vitamin D3[1,25(OH)2D3] on immune mechanism of RBC and spleen in colitis model mice.MethodsThirty mice were randomly grouped as follows:blank control group,model group and 1,25(OH)2D3group.The animal models were established.Then the general condition and colon pathological changes in mice were observed,the changes of the RBC immune compound(RCIC) and RBC surface C3b receptor(RC3bR) wreath were detected by the yeast wreath method,the weight and length of spleen were measured，the positive rates of spleen immune cells were detected by flow cytometry.ResultsCompared with the model group,RBC-C3bR in the 1,25(OH)2D3group and blank control group was significantly increased and RBC-ICR was significantly decreased (P<0.01).Compared with the blank control group,the positive rates of CD3,CD4,CD8 and CD45R in spleen mononuclear cell were significantly increased (P<0.01);after the 1,25(OH)2D3intervention,the positive rates of CD3,CD4,CD8 and CD56R in spleen mononuclear cells were significantly decreased compared with the model group(P<0.01).Conclusion1,25(OH)2D3has the immune regulatory effect on RBC and peripheral spleen lymphocytes in chronic colitis mice.

1,25(OH)2D3;RBC immune;spleen lymphocytes；ulcerative colitis;chronic animal model

R974

A

1671-8348(2017)26-3617-03

2017-02-18

2017-06-06)

趙紅偉(1979-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事胃腸疾病方面研究?！?/p>

,E-mail:13603396653@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.006