花生種子萌發(fā)過程中子葉內(nèi)肽酶活性研究

李 諾，孔倩瑩，賓金華

（1.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015；2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631）

花生種子萌發(fā)過程中子葉內(nèi)肽酶活性研究

李 諾1，孔倩瑩2，賓金華2

（1.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015；2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631）

探討花生種子在萌發(fā)過程中子葉內(nèi)肽酶的活性及其同工酶數(shù)量的變化，研究金屬型蛋白酶抑制劑EDTA與不同溫度對內(nèi)肽酶的活性的影響。采用直立玻板法萌發(fā)花生種子，運用分光光度法測定內(nèi)肽酶的活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)肽酶活力在種子萌發(fā)6 d達到最大值；運用SDS-PAGE凝膠電泳法發(fā)現(xiàn)在種子萌發(fā)6 d出現(xiàn)5條內(nèi)肽酶同工酶（其中2條是金屬型內(nèi)肽酶）；在種子萌發(fā)8 d和10 d均出現(xiàn)7條內(nèi)肽酶同工酶（其中4條是金屬型內(nèi)肽酶），這些內(nèi)肽酶同工酶的最適溫度約為40℃，EGTA對萌發(fā)6 d時存在的2種金屬型內(nèi)肽酶同工酶有明顯抑制作用，但并不能完全抑制其活性。

花生；種子萌發(fā)；內(nèi)肽酶；同工酶；種子活力；子葉

Abstract：The activity and isozyme of endopeptidases during peanut seeds germination were detected to research the activity of endopeptidase affected by different temperatures and inhibitors of metalloprotease EDTA.In this study，we used the standing boards to germinate peanut seeds，used spectrophotometry to determine the activity of endopeptidase during the germination of seeds. It was found that the ativity of endopeptidase reached the maximum at the sixth day. Using SDS-PAGE gel electrophoresis，we found 5 kinds of endopeptidase isoenzymes，in which there were two kind of metalloprotease of the 6 days of germination，and 7 kinds of endopeptidase isoenzymes，which there were 4 kind of metalloprotease after 8 days and 10 days of germination. The optimum temperature of these endopeptidase isozymes was about 40℃. Gelatin electrophoresis results showed that EGTA had inhibitory effect on two isozymes of metal type at 6 days of germination，but it did not completely inhibit the activity.

Key words：Arachis hypogaea L.；seed germination；endopeptidase；isoenzyme；seed vitality；cotyledon

種子萌發(fā)是種子植物發(fā)育的關(guān)鍵時期，其萌發(fā)過程經(jīng)歷著一系列復(fù)雜的生理生化變化，種子內(nèi)的貯藏物質(zhì)在水解酶作用下轉(zhuǎn)變成供胚生長所需的物質(zhì)［1］。因此在種子萌發(fā)的過程中，水解酶的活力會影響種子的萌發(fā)狀況?；ㄉN子萌發(fā)需要經(jīng)過雙激活過程，一方面是貯藏蛋白需要經(jīng)過修飾成為可降解蛋白，另一方面是需要激活起主要降解作用的內(nèi)肽酶。蛋白質(zhì)降解需要水解酶的作用，蛋白水解酶的作用有多方面，主要包括參與植物生長發(fā)育過程中功能蛋白的降解和周轉(zhuǎn)、清除逆境脅迫下非保護蛋白、參與降解喪失功能和不正常組裝或聚積的蛋白質(zhì)、加工剪接信號肽等［2-3］。蛋白水解酶可分為內(nèi)肽酶（Endopeptidase）和外肽酶（Exopeptidase）兩大類。一個蛋白要被徹底降解，首先要被內(nèi)肽酶作用剪切成小肽，然后再被外肽酶作用降解為氨基酸。內(nèi)肽酶在種子萌發(fā)時貯藏蛋白質(zhì)動員過程中起關(guān)鍵作用［4］。在花生種子萌發(fā)過程中，子葉的內(nèi)肽酶活性不斷增強，降解種子發(fā)育過程積累的貯藏蛋白酶，降解產(chǎn)物將合成新的蛋白質(zhì)以供種子萌發(fā)的需要。

內(nèi)肽酶根據(jù)活性位點的性質(zhì)以及對專一性抑制劑的敏感性的不同，又可分為絲氨酸蛋白酶（EC 3.4.21）、半胱氨酸蛋白水解酶（EC 3.4.22）、天門冬氨酸蛋白水解酶（EC 3.4.23）、金屬蛋白酶（EC 3.4.24）、蘇氨酸蛋白水解酶（EC 3.4.25）五類。其中，金屬蛋白酶抑制劑可與金屬蛋白酶的活性中心結(jié)合，使金屬蛋白酶活力降低，甚至消失，但不使酶蛋白變性。EGTA是其中一種金屬蛋白酶抑制劑，EGTA鈣螯合物比較穩(wěn)定，而EGTA鎂螯合物穩(wěn)定性較差［5-7］。

植物種子的內(nèi)肽酶通常有多種同工酶，如浩浩巴（Simmondsia chinensis）有5條同工酶［8］，大麥有 3 條同工酶［9］。賓金華等［10］從萌發(fā)5 d的花生種子子葉中分離提純內(nèi)肽酶，發(fā)現(xiàn)該酶有兩條同工酶，均為半胱氨酸型內(nèi)肽酶，并證明花生子葉的內(nèi)肽酶不是在種子萌發(fā)的過程中重新合成，而是在種子發(fā)育的過程中合成并貯存于成熟種子中，這一發(fā)現(xiàn)也印證了種子萌發(fā)的雙激活理論。但是關(guān)于內(nèi)肽酶活性的表達機制及其在種子萌發(fā)過程中的變化情況目前還不清晰。為此，本研究深入探討花生種子在萌發(fā)過程中子葉內(nèi)肽酶的活性及其同工酶數(shù)量的變化，內(nèi)肽酶的活性受金屬型蛋白酶抑制劑和溫度的影響等。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試花生品種為汕油523，由廣東省農(nóng)科院作物研究所提供；BSA、BAPNA、EGTA、牛血紅蛋白等試劑均購自上海生化試劑廠。

1.2 試驗方法

試驗采用直立玻板發(fā)芽法萌發(fā)花生種子。選取完整、健壯、大小均一的花生種子，在1%的次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，超純水沖洗6次，用直立玻板發(fā)芽法在28℃下暗萌發(fā)，每板10粒種子。在種子萌發(fā) 0、2、4、6、8、10 d分別取出其中的3板，每板種子作為一個重復(fù)，記錄種子的萌發(fā)率。

測量并記錄萌發(fā)種子下胚軸與胚根的生長情況，計算種子活力：

1.3 測定項目及方法

1.3.1 粗酶液提取 每個重復(fù)選取5片子葉，按1∶5（M/V）加入磷酸緩沖液（pH 7.2，0.02 mol/L，含0.01 mol/L β-巰基乙醇），在冰浴中研磨成勻漿，在4℃條件下浸提4 h后離心（12 096×g，30 min），上清液即為粗酶提取液。

1.3.2 可溶性蛋白質(zhì)含量 采用考馬斯亮藍法測定萌發(fā)花生種子子葉可溶性蛋白質(zhì)含量。按Bradford［11］的方法，用牛血清蛋白做標準曲線。將以上所得的子葉粗酶提取液分別稀釋50倍，取25 μL稀釋后的粗酶提取液和1.5 mL考馬斯亮藍G-250反應(yīng)90 s，使用分光光度計測定OD595。

1.3.3 內(nèi)肽酶活力 參照Harris等［12］的方法，以牛血紅蛋白為底物測定萌發(fā)花生種子子葉內(nèi)肽酶活力，以波長280 nm下OD值每分鐘增加0.01為1個酶活力單位。

1.3.4 內(nèi)肽酶同工酶檢測 采用明膠電泳法檢測萌發(fā)花生種子子葉內(nèi)肽酶同工酶。按Jameel等［13］的方法，配制分離膠為12.5%的SDSPAGE，明膠按終濃度4%配制于膠中，樣品與明膠上樣緩沖液（體積比為1∶1）37℃溫浴2 h后電泳。電泳在4℃冰箱中進行，在電泳結(jié)束后，用含有2%TritonX-100的Tris-HCl緩沖液處理凝膠45 min，用于去除SDS。用蒸餾水沖洗4次后，凝膠轉(zhuǎn)入0.2 mmol/L pH 5.4的醋酸緩沖液中，40℃恒溫處理12 h。反應(yīng)結(jié)束后用考馬斯亮藍R250染色1 h，再用脫色液（含12%甲醇、7%冰醋酸）進行脫色，膠中亮白色的帶即為內(nèi)肽酶同工酶帶。

1.3.5 EGTA對內(nèi)肽酶活性的影響 采用分光光度法檢測EGTA對萌發(fā)花生種子子葉內(nèi)肽酶活性的影響。用濃度為0.1 mol/L的EGTA處理酶液，以BAPNA為底物測定內(nèi)肽酶活性，參照Harris等［12］的方法，以波長410 nm下OD值每分鐘增加0.01為1個酶活力單位。

1.3.6 EGTA對葉內(nèi)肽酶同工酶的影響 采用明膠電泳法檢測EGTA對萌發(fā)花生種子子葉內(nèi)肽酶同工酶的影響。按Jameel［13］的方法，取10 μL酶液，加入0.2 mol/L EGTA溶液10 μL，于4℃下處理2 h，再加入20 μL明膠上樣緩沖液，37℃溫浴2 h后電泳，電泳后操作同1.3.4，膠中亮白色的帶即為內(nèi)肽酶同工酶帶。

1.3.7 溫度對內(nèi)肽酶同工酶的影響 按Jameel［13］方法，分別于 20、30、40、50、60℃下測定萌發(fā)花生種子子葉內(nèi)肽酶同工酶帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生種子活力的變化

花生種子置于垂直玻板盒中暗萌發(fā)處理，種子吸水膨脹，由靜止的休眠狀態(tài)恢復(fù)代謝生理活動，24 h后就能看出有胚根的長出，萌發(fā)6 d開始有側(cè)根長出（圖1，封二）?；ㄉN子進入萌發(fā)狀態(tài)，萌發(fā)前24 h是吸水膨脹的重要時期，繼吸水24 h后大部分花生都呈現(xiàn)出芽狀態(tài)，萌發(fā)2 d后超過50%的種子長出胚根，隨著萌發(fā)時間的延長，花生的胚軸、胚根持續(xù)伸長，其中萌發(fā)2～4 d增長較為明顯。萌發(fā)4 d后，種子活力指數(shù)的增長主要依賴于下胚軸與胚根的生長（表1）。從表1可以看出，花生種子的活力在萌發(fā)過程逐漸增加，萌發(fā)后2 d，種子吸脹明顯，活力為0.40±0.11，萌發(fā)率為51.7%，下胚軸+胚根長為0.78±0.06 cm；萌發(fā)后4 d，萌發(fā)率達到100%，下胚軸+胚根長為1.89±0.20 cm，下胚軸+胚根長較萌發(fā)2 d時顯著增加，是萌發(fā)后2 d的1.42倍，活力也明顯增加。萌發(fā)4 d后，活力持續(xù)增加，但在萌發(fā)8 d后，活力增速減緩，萌發(fā)10 d的活力與萌發(fā)8 d差異不顯著。

表1 萌發(fā)花生種子活力

2.2 萌發(fā)花生種子子葉可溶性蛋白質(zhì)含量與內(nèi)肽酶活力的變化

通過考馬斯亮藍法測量不同萌發(fā)天數(shù)的萌發(fā)花生子葉中的可溶性蛋白含量，使用分光光度法測量其內(nèi)肽酶活性，結(jié)果見圖2。種子萌發(fā)2 d與未萌發(fā)種子相比，子葉可溶性蛋白的含量下降十分明顯，蛋白質(zhì)含量減少49%，差異極顯著（P = 0.007＜0.01）；至萌發(fā)4 d，蛋白含量依然呈現(xiàn)一個下降的趨勢，但幅度相對較??；種子萌發(fā)4 d后，子葉可溶性蛋白含量開始增加，萌發(fā)6 d的蛋白含量比萌發(fā)4 d增加12.11%，差異顯著（P = 0.035＜0.05）；萌發(fā)6 d后子葉中可溶性蛋白質(zhì)含量增加緩慢，增長幅度小，差異不明顯。

圖2 花生種子萌發(fā)過程中子葉可溶性蛋白含量與內(nèi)肽酶活性變化

與此同時，子葉內(nèi)肽酶活性一直處于逐漸增強的狀態(tài)。種子萌發(fā)0～10 d之間每隔2 d，內(nèi)肽酶活性的增長率分別為2.72%、11.76%、34.15%、6.94%、3.73%。其中萌發(fā)4～6 d期間花生的內(nèi)肽酶活性增強最為明顯，差異極顯著（P= 0＜0.01），之后子葉的內(nèi)肽酶活性增強幅度較小，差異不明顯。內(nèi)肽酶活性變化與種子活力指數(shù)變化相對比，可看出花生種子萌發(fā)的活力指數(shù)與子葉內(nèi)肽酶活性呈正比關(guān)系。

2.3 萌發(fā)花生種子子葉內(nèi)肽酶同工酶活性變化

花生種子萌發(fā)后6 d，出現(xiàn)了5條內(nèi)肽酶同工酶帶（EP1～2、EP5～7）；萌發(fā)后8 d和10 d均出現(xiàn)7條內(nèi)肽酶同工酶帶（EP1～7），由此可見，隨著萌發(fā)時間的延長，子葉內(nèi)肽酶同工酶的種類有所增加（圖4）。種子萌發(fā)6 d和8 d時，EP2、EP5、EP6、EP7這4種內(nèi)肽酶的條帶較其他條帶清晰；萌發(fā)10 d，EP1和EP5的條帶較之前清晰，但EP2、EP6和EP7條帶亮度較之前降低。說明在萌發(fā)6～8 d時，EP2、EP5、EP6、EP7這4種內(nèi)肽酶同工酶的活性較高，是降解蛋白質(zhì)的主要內(nèi)肽酶；而在萌發(fā)10 d時，EP2、EP6、EP7等同工酶的活性降低，而EP1和EP5活性增加，起主要的降解蛋白質(zhì)的作用（圖3）。由于分離膠中明膠濃度過大，或萌發(fā)0～4 d的種子內(nèi)肽酶活性較弱，未出現(xiàn)條帶。

2.4 EGTA對萌發(fā)花生種子子葉內(nèi)肽酶活性的影響

圖3 萌發(fā)花生種子子葉內(nèi)肽酶同工酶凝膠圖譜

圖4 EGTA對萌發(fā)花生子葉內(nèi)肽酶活性的影響

圖5 EGTA對萌發(fā)花生種子子葉內(nèi)肽酶同工酶的影響

由圖4可知，EGTA對萌發(fā)0～4 d的子葉內(nèi)肽酶活力無抑制作用，對萌發(fā)6～10 d的子葉內(nèi)肽酶的抑制作用也不明顯。從明膠電泳結(jié)果（圖5）可以看出，萌發(fā)6 d時，EGTA對內(nèi)肽酶同工酶EP1和EP6有抑制作用；萌發(fā)8 d時，EGTA對EP1、EP3、EP4、EP6有抑制作用；萌發(fā)10 d時，EGTA對條帶顯著增亮的EP1有明顯的抑制作用，同時還抑制了EP3、EP4、EP6的活性。表明在萌發(fā)6 d時存在2種金屬型內(nèi)肽酶同工酶EP1、EP6，在萌發(fā)8 d和10 d時存在4種金屬型內(nèi)肽酶同工酶EP1、EP3、EP4、EP6，但在萌發(fā)6、8、10 d時，EGTA對EP6均不能完全抑制。

綜合生化測定和明膠電泳的結(jié)果，花生種子萌發(fā)6 d存在2種金屬型內(nèi)肽酶同工酶，在萌發(fā)8 d和10 d時存在4種金屬型內(nèi)肽酶同工酶，但在花生種子萌發(fā)過程中，由于金屬型內(nèi)肽酶活性總體較弱，在生化測定中EGTA對內(nèi)肽酶活力無明顯抑制作用。

2.6 溫度對萌發(fā)花生種子子葉內(nèi)肽酶同工酶的影響

分別于 20、30、40、50、60℃測定內(nèi)肽酶同工酶帶，結(jié)果顯示，萌發(fā)花生種子子葉內(nèi)肽酶同工酶的最適溫度約為40℃，溫度過低或過高均會明顯降低酶活力，甚至完全抑制某些內(nèi)肽酶同工酶的活性（圖6）。內(nèi)肽酶同工酶EP2和EP5具有較強的溫度適應(yīng)性，其中EP2在20～60℃均顯示出酶活力，酶活性受溫度變化影響不大；EP5在20～50℃均顯示出酶活力，但在60℃時酶活力消失，說明高于50℃時，EP5失去了酶活力；EP1在20℃和60℃時也具有酶活力；其余幾種內(nèi)肽酶同工酶在高于或低于40℃時酶活力均被抑制。因此在種子萌發(fā)的過程中應(yīng)控制好萌發(fā)溫度，使內(nèi)肽酶活力達到最適的水平，利于種子萌發(fā)。

圖6 溫度對萌發(fā)花生種子內(nèi)肽酶同工酶的影響

3 結(jié)論與討論

內(nèi)肽酶是在植物生長發(fā)育全過程中起著非常重要作用的蛋白水解酶，參與各項生命活動中蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的過程［4］。因此，研究細胞內(nèi)內(nèi)肽酶的活性影響因素及其種類變化顯得十分有必要。在萌發(fā)的過程中，種子的貯藏蛋白會被降解利用，在水解酶作用下轉(zhuǎn)變成供胚生長所需的物質(zhì)。在萌發(fā)初期，內(nèi)肽酶活力顯著增加，蛋白質(zhì)被大量降解，其含量顯著降低，被內(nèi)肽酶降解成小肽的蛋白質(zhì)在外肽酶的作用下進一步降解為氨基酸，植物體利用這些游離的氨基酸可以合成新的蛋白質(zhì)，同時內(nèi)肽酶活力有所降低，因此在種子萌發(fā)后期，蛋白質(zhì)的含量有所增加。這與本研究結(jié)果一致，即花生種子萌發(fā)6～8 d可溶性蛋白質(zhì)亦有輕微增加的趨勢。

賓金華等［10］將花生子葉內(nèi)肽酶經(jīng)硫酸銨沉淀，Sephadex G-100凝膠層析，從萌發(fā)5 d的花生種子子葉中分離提純內(nèi)肽酶，發(fā)現(xiàn)該酶有兩條同工酶，這兩條內(nèi)肽酶同工酶分子量非常接近，分子量分別為58 kD和55 kD，很可能是本試驗中分離出來的兩種內(nèi)肽酶同工酶EP6和EP7。本研究明膠電泳的結(jié)果顯示，EGTA對萌發(fā)6 d時存在的2種金屬型內(nèi)肽酶同工酶（EP1和EP6）有抑制作用，但并不能完全抑制EP6的活性，其原因可能是EGTA對花生的金屬性內(nèi)肽酶同工酶的抑制作用不明顯，將酶液與EGTA混合處理后，EGTA與金屬離子形成螯合劑的能力較弱，無法完全抑制金屬型內(nèi)肽酶同工酶的活性，活性較弱的金屬型內(nèi)肽酶同工酶則被EGTA抑制，活性較強的金屬型內(nèi)肽酶同工酶活性則無法完全被抑制，并由此推斷EP 6酶活性中心很可能不含Ca2+。在萌發(fā)8 d和10 d時出現(xiàn)的EP3、EP4，以及在萌發(fā)10 d時活性明顯增加的EP1均被EGTA完全抑制酶活力，由此可以推測金屬型內(nèi)肽酶EP1、EP3、EP4的活性中心含有Ca2+，與EGTA的螯合物能穩(wěn)定存在，因此能被EGTA完全抑制［14］。金屬型蛋白酶水分子的激活需要由二價金屬離子，通常是Zn2+，有時是 Co2+或 Mn2+來完成［15-16］。同時，由于EGTA是一種鈣螯合劑，與其他金屬的螯合物穩(wěn)定性較差，而EDTA幾乎能夠螯合所有的金屬離子［14］。

本研究中，明膠電泳并沒有發(fā)現(xiàn)萌發(fā)0～4 d的花生種子有內(nèi)肽酶同工酶條帶，但分光光度法測定內(nèi)肽酶活性變化發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)4 d時子葉內(nèi)肽酶活性明顯增加，這可能與分離膠中明膠濃度過大，或萌發(fā)0～4 d的種子內(nèi)肽酶活性較弱有關(guān)。如果降低明膠的濃度，適當(dāng)縮短酶與底物反應(yīng)的時間，避免由于反應(yīng)時間過長而使酶失活，內(nèi)肽酶同工酶的條帶會更為清晰。本研究結(jié)果表明，花生子葉內(nèi)肽酶同工酶的最適溫度約為40℃，溫度過高或過低均會影響酶的活性。在萌發(fā)的過程中存在著一些溫度耐受性較強且活性較高的內(nèi)肽酶，如EP2和EP5，它們在種子萌發(fā)的過程中保持著較高的酶活力，其活性雖受到溫度變化的影響，但溫度在20～50℃范圍內(nèi)均不會使其完全失活，這些酶應(yīng)該是花生種子萌發(fā)過程中起主要作用的內(nèi)肽酶。通過本研究得知，萌發(fā)花生的子葉內(nèi)肽酶存在著多種同工酶，這些同工酶的類型存在差異，內(nèi)肽酶是促進蛋白質(zhì)發(fā)生降解反應(yīng)的重要蛋白酶，不同植物的內(nèi)肽酶種類存在差異，同一植物在其不同的生長發(fā)育階段內(nèi)肽酶同工酶的種類和活性也會存在差異［17-18］，在此方面還有很多未知的領(lǐng)域值得進一步深入探索。

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（責(zé)任編輯 鄒移光）

Study on endopeptidase activity during peanut seeds germination

LI Nuo1，KONG Qian-ying2，BIN Jin-hua2
（1.School of Life Science，Jiaying University，Meizhou 514015，China；2.College of Life Science，South China Normal University，Guangzhou 510631，China）

S565.2；Q945.34

A

1004-874X（2017）06-0001-07

李諾，孔倩瑩，賓金華.花生種子萌發(fā)過程中子葉內(nèi)肽酶活性研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（6）：1-7.

2017-03-16

廣東省高等院校學(xué)科建設(shè)和教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程項目（415B0208）

李諾（1979-），女，碩士，講師，E-mail：anorlee@126.com

賓金華（1962-），男，博士，教授，E-mail：binjh@scnu.edu.cn.