二氫楊梅素調(diào)控自噬抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究

鐘惠娟，陳璐，廖慧穎，張濤，王波，周潔

（1.廣州醫(yī)學(xué)院荔灣醫(yī)院 心內(nèi)科，廣東 廣州 510000；2.湖南省常德市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖南 常德 415003；3.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；4.解放軍第一六九醫(yī)院（湖南師范大學(xué)附屬湘南醫(yī)院）普外科，湖南 衡陽 421001）

二氫楊梅素調(diào)控自噬抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究

鐘惠娟1，陳璐1，廖慧穎2，張濤3，王波3，周潔4

（1.廣州醫(yī)學(xué)院荔灣醫(yī)院 心內(nèi)科，廣東 廣州 510000；2.湖南省常德市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖南 常德 415003；3.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；4.解放軍第一六九醫(yī)院（湖南師范大學(xué)附屬湘南醫(yī)院）普外科，湖南 衡陽 421001）

目的 觀察二氫楊梅素（DMY）對(duì)氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）損傷的影響，并探討自噬在其中的作用。方法 DMY（0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L）預(yù)處理HUVECs 2 h，用100.0 mg/L ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h。以辛伐他汀作為陽性對(duì)照組。采用噻唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞活力，Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)，透射電鏡觀察自噬體，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）、Beclin-1和p62/SQSTM1的表達(dá)，觀察自噬抑制劑對(duì)DMY作用的影響。結(jié)果 與對(duì)照組比較，ox-LDL組細(xì)胞的存活率降低（P＜0.05），細(xì)胞核呈集中高強(qiáng)度藍(lán)色熒光，固縮致密濃染或碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白，細(xì)胞核較小，形態(tài)不規(guī)則，自噬體和自噬溶酶體數(shù)量增加；Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上調(diào)，而p62的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。與ox-LDL組比較，0.1、1.0和10.0μmol/LDMY預(yù)處理組細(xì)胞存活率均升高；細(xì)胞核熒光強(qiáng)度降低，核固縮致密濃染和碎塊狀致密濃染減少，形態(tài)較規(guī)則；1.0 μmol/LDMY預(yù)處理組的自噬體和自噬溶酶體數(shù)量增加；Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上調(diào)，而p62的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。自噬抑制劑3-MA部分抵消DMY抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs存活率降低（P＜0.05）。結(jié)論 DMY能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷，其機(jī)制與誘導(dǎo)自噬有關(guān)。

二氫楊梅素；氧化低密度脂蛋白；內(nèi)皮細(xì)胞；自噬；自噬相關(guān)蛋白

Abstract:Objective To investigate the effect of Dihydromyricetin (DMY)on the damage induced by oxidized low-density lipoprotein(ox-LDL)in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)and to explore the role of autophagy in this effect.Methods After HUVECs were pretreated with DMY (0.01,0.1,1.0 and 10.0 μmol/L)for 2 h,the cells were incubated with ox-LDL(100.0 mg/L)for 24 h.Simvastatin was made as a positive control.MTT was used to detect cell viability.Nuclear morphology was observed by Hoechst 33258 staining.Cell ultrastructures and autophagosomes were observed by transmission electron microscope.Theexpressions of Beclin-1,light chain-3 of microtubule-associated protein (LC3)and the autophagy substrates p62/SQSTM1 in cells were determined by Western blot.Results Compared with the control group,the cell survival rate was singificantly decreased (P＜0.05),the nuclei were smaller in the ox-LDL group.The concentrated high-intensity blue fluorescence in nuclei,nuclear condensation and dense dyeing,or nuclear chunky and dense dyeing were observed in the ox-LDL group.Compared with the control group,the number of autolysosomes was obviously increased,the expressions of Beclin-1 and LC3-Ⅱ and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰin the cells were singificantly increased and the expression of p62 in the cells was singificantly decreased in the ox-LDL groups (P＜0.05).Compared with the ox-LDL group,the cell survival rate was singificantly increased (P＜0.05),the fluorescence intensity of nuclei was obviously decreased,nuclear condensation and dense dyeing or nuclear chunky and dense dyeing were decreased,the nuclei were regular in the DMY(0.1,1.0 and 10.0 μmol/L)pretreatment groups.Compared with the ox-LDL group,the number of autolysosomes was obviously increased,the expressions of Beclin-1 and LC3-Ⅱ and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰin the cells were singificantly increased while the expression of p62 in the cells was singificantly decreased in the DMY(1.0 μmol/L)pretreatment group(P＜ 0.05).Autophagy inhibitor 3-MA partly abolished the effect of DMY on the cell survival rate(P＜0.05).Conclusions DMY protects ox-LDL-induced damage in HUVECs,the mechanism is associated with induction of autophagy.

Keywords:Dihydromyricetin;oxidized low-density lipoprotein;endothelial cell;autophagy;autophagy related proteins

二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DMY）是黃酮類化合物之一，我國(guó)民間古茶藤茶中大量存在。二氫楊梅素的藥理作用非常廣泛，具有鎮(zhèn)痛、止咳、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖和血脂、調(diào)節(jié)免疫力及肝腎保護(hù)作用等[1]。最近研究表明，二氫楊梅素能降低動(dòng)脈粥樣硬化（Artherosclerosis，AS）大鼠血脂水平，改善其血流動(dòng)力學(xué)，抑制大鼠主動(dòng)脈弓的炎癥因子的表達(dá)，具有抗AS的作用[2]，然而其詳細(xì)的機(jī)制還不清楚。氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）是 AS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。ox-LDL 導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是AS發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。自噬是真核生物中一種進(jìn)化上高度保守，用于降解和回收利用細(xì)胞內(nèi)生物大分子和受損細(xì)胞器的過程[4]。研究發(fā)現(xiàn)自噬與AS關(guān)系密切，在AS中的發(fā)生、發(fā)展中具有雙重作用，適度的自噬對(duì)AS具有保護(hù)作用，過度的自噬卻會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，降低斑塊的穩(wěn)定性，導(dǎo)致斑塊破裂，發(fā)生急性臨床事件[5]。研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的自噬并發(fā)生Ⅱ型程序性死亡[6]。DMY的抗AS作用是否與內(nèi)皮細(xì)胞的自噬有關(guān)，目前還不清楚。因此，本研究旨在觀察DMY對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）損傷的影響，并探討自噬在其中的作用，為AS的防治提供新的線索和策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

HUVECs株由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心提供，二氫楊梅素為成都曼斯特生物科技公司產(chǎn)品，RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶、四乙酸乙二胺為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，細(xì)胞凋亡-Hoechst33258染色試劑盒購(gòu)于杭州碧云天生物技術(shù)研究所，3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）和噻唑藍(lán)[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，兔抗人Beclin1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（Microtubule-associatedproteinlightchain-3，LC3）、p62/SQSTM1、β- 肌 動(dòng) 蛋白一抗單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、細(xì)胞工作超凈臺(tái)、多功能酶標(biāo)儀、低速離心機(jī)和倒置顯微鏡。全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司），垂直電泳儀與轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)BioRad公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司），圖像分析系統(tǒng)（武漢華海公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

HUVECs用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，在37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。隔天傳代，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為6組：①對(duì)照組；②ox-LDL組：用含100.0mg/L ox-LDL RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h；③DMY單獨(dú)處理組：用含1.0或100.0μmol/LDMY培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞26 h；④辛伐他汀預(yù)處理組：以辛伐他汀做為陽性對(duì)照組，用含1.8 mg/L辛伐他汀的培養(yǎng)液預(yù)處理2 h后，加入100.0 mg/L ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h；⑤不同濃度DMY預(yù)處理組：用含0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/LDMY的培養(yǎng)液預(yù)處理2 h后，加入100.0 mg/L ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h；⑥自噬抑制劑3-MA干預(yù)組：用含5 mmol/L 3-MA培養(yǎng)液預(yù)處理30 min，用含1.0 μmol/LDMY培養(yǎng)液預(yù)處理2 h，加入100.0 mg/L ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h。

1.4 MTT法

用胰酶消化后將HUVECs細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，以1×104個(gè)/孔接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每孔加入100μl MTT，使MTT的終濃度為0.5 mg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液。加入二甲基亞砜100μl/孔，振蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm波長(zhǎng)的吸光度值（optical density，OD），每組設(shè)重復(fù)孔3個(gè)。計(jì)算各組細(xì)胞的存活率，以對(duì)照組為參照（細(xì)胞存活率為100%），計(jì)算其他各組細(xì)胞存活率=（處理組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.5 Hoechst 33258染色

HUVECs細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，相應(yīng)處理結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖溶液將細(xì)胞清洗2遍。然后每孔加 10μg/ml Hoechst33258染色液 100 μl，在室溫下避光孵育15 min，將染色液吸去。在熒光顯微鏡下以346 nm的激發(fā)光激發(fā)，在460 nm的發(fā)射光下觀察細(xì)胞核的形態(tài)[7]。實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 Western blot檢測(cè)

提取各組HUVECs細(xì)胞的總蛋白，BAC法測(cè)定蛋白濃度。取100μl蛋白樣本加入到2×十二烷基磺酸鈉凝膠加樣緩沖液中，煮沸充分變性蛋白。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h分離蛋白，分離的蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙稀膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗人 Beclin-1（1∶200）、LC3（1∶200）、p62（1∶200）及β-肌動(dòng)蛋白（1∶400）一抗，4℃下過夜。加入鼠抗兔二抗，孵育6 h。洗膜，顯色，用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行掃描和半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析；組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ox-LDL和DMY對(duì)HUVECs細(xì)胞存活率的影響

采用MTT法檢測(cè)HUVECs細(xì)胞活力，細(xì)胞的存活率組間比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.872，P=0.016）。ox-LDL組細(xì)胞的存活率與對(duì)照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.843，P=0.000），ox-LDL 組降低；DMY 單獨(dú)處理組與對(duì)照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.382，P=0.657）；辛伐他汀預(yù)處理組與ox-LDL組細(xì)胞存活率比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.157，P=0.001），辛伐他汀預(yù)處理組升高；0.1、1.0 和10.0μmol/LDMY預(yù)處理組細(xì)胞的存活率與ox-LDL組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.463、3.051 和 3.349，P=0.015、0.008 和 0.004），0.1、1.0 和10.0μmol/LDMY預(yù)處理組均升高，其中最佳藥物濃度為1.0μmol/L。1.0和10.0μmol/LDMY預(yù)處理組細(xì)胞的存活率與辛伐他汀預(yù)處理組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.627和0.834，P=0.571和0.482）。見圖 1。

圖1 ox-LDL和DMY對(duì)HUVECs細(xì)胞存活率的影響

2.2 ox-LDL和DMY對(duì)HUVECs細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的影響

對(duì)照組細(xì)胞核呈彌散較均勻低強(qiáng)度藍(lán)色熒光，細(xì)胞核較大，形態(tài)規(guī)則，呈圓形或橢圓形。ox-LDL組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞核出現(xiàn)高強(qiáng)度藍(lán)色熒光，固縮致密濃染，部分呈碎塊狀致密濃染，細(xì)胞核較小，形態(tài)呈不規(guī)則型。DMY單獨(dú)處理組與對(duì)照組比較，細(xì)胞核的形態(tài)無差異。辛伐他汀預(yù)處理組與ox-LDL組比較，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞核熒光強(qiáng)度明顯降低，核固縮致密濃染和碎塊狀致密濃染減少。0.1、1.0和10.0μmol/LDMY預(yù)處理組與ox-LDL組比較，細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞核熒光強(qiáng)度明顯降低，核固縮致密濃染和碎塊狀致密濃染減少，細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，1.0和10.0μmol/LDMY預(yù)處理組細(xì)與辛伐他汀預(yù)處理組比較，細(xì)胞核形態(tài)無差異。其中DMY最佳藥物濃度為1.0μmol/L，與細(xì)胞存活率結(jié)果一致，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中DMY的濃度為1.0μmol/L。見圖2。

2.3 HUVECs中自噬體的觀察

目前檢測(cè)自噬的金標(biāo)準(zhǔn)是透射電鏡觀察自噬體。與對(duì)照組比較，ox-LDL組和DMY單獨(dú)處理組細(xì)胞自噬體和自噬溶酶體數(shù)量明顯增加；與ox-LDL組比較，1.0μmol/LDMY預(yù)處理組細(xì)胞自噬體和自噬溶酶體數(shù)量明顯增加。見圖3。

圖2 ox-LDL和二氫楊梅素對(duì)HUVECs細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的影響 （×400）

圖3 HUVECs中自噬體 （透射電鏡）

2.4 ox-LDL和DMY對(duì)HUVECs細(xì)胞中Beclin1、LC 3及p62表達(dá)的影響

Beclin-1和LC3是自噬體形成的標(biāo)志蛋白，而p62是自噬的底物，常用來反應(yīng)自噬流的水平。Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及p62的表達(dá)組間比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.641，P=0.024）。與對(duì)照組比較，ox-LDL組和DMY單獨(dú)處理組的Beclin-1（t=2.746和2.723，P=0.024和 0.027）、LC3-Ⅱ（t=2.542 和 2.521，P=0.036和0.039）的表達(dá)、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（t=2.806和 2.721，P=0.022 和 0.028）比較，經(jīng) LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ox-LDL組和DMY單獨(dú)處理組均上調(diào)；而p62表達(dá)比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.149和 3.068，P=0.012和0.015），ox-LDL組和DMY單獨(dú)處理組均下調(diào)。與ox-LDL組比較，1.0μmol/LDMY 預(yù)處理組的 Beclin-1（t=2.957，P=0.018）、LC3-Ⅱ（t=2.731，P=0.026）的表達(dá)、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（t=2.958，P=0.018）比較，經(jīng) LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1.0μmol/LDMY預(yù)處理組上調(diào)；而p62表達(dá)比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.809，P=0.021），1.0μmol/LDMY 預(yù)處理組下調(diào)。見圖4。

2.5 自噬抑制劑對(duì)DMY作用的影響

采用MTT法檢測(cè)HUVECs細(xì)胞活力，觀察自噬抑制劑3-MA對(duì)DMY抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的影響。細(xì)胞的存活率組間比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.673，P=0.002）。ox-LDL組和3-MA組細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.645和6.817，P=0.001和 0.000），ox-LDL組和 3-MA組均降低；1.0μmol/LDMY預(yù)處理組細(xì)胞存活率與ox-LDL組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.958，P=0.012），1.0μmol/LDMY預(yù)處理組升高；自噬抑制劑3-MA部分抵消DMY抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs存活率的降低（t=2.586，P=0.022）。DMY單獨(dú)處理不影響 HUVECs細(xì)胞的存活率（t=0.584，P=0.843）。見圖5。

圖4 ox-LDL和DMY對(duì)HUVECs細(xì)胞中Becl i n 1、LC 3及p62表達(dá)的影響

圖5 自噬抑制劑對(duì)二氫楊梅素作用的影響

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，ox-LDL是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的常見因素，也是導(dǎo)致AS發(fā)生、發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。ox-LDL可刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種炎癥因子、黏附分子及趨化因子，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的黏附并向內(nèi)膜下移行，促進(jìn)AS的形成。另一方面，ox-LDL誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的脂膜、蛋白質(zhì)和DNA的損傷，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，降低內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血管的保護(hù)作用，加速AS的發(fā)生。因此保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞是防治AS的一個(gè)重要途徑。

二氫楊梅素為 3，5，7，3’，4’，5’-6 羥基 -2，3-雙氫黃酮醇，是一種常見的黃酮類化合物，在我國(guó)民間古茶藤茶中含量較高，在葡萄等水果和蔬菜中都大量自然存在。二氫楊梅素的藥理作用非常廣泛，具有鎮(zhèn)痛、止咳、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、護(hù)肝、調(diào)節(jié)血糖和血脂，以及調(diào)節(jié)免疫力等作用。最近研究表明，二氫楊梅素具有抗AS的作用。梁柱第等[2]研究發(fā)現(xiàn)，藤茶二氫楊梅素抑制高脂誘導(dǎo)Wistar大鼠AS的形成，降低AS大鼠血清C-反應(yīng)蛋白、血清腫瘤壞死因子及白細(xì)胞介素-1的水平，顯著降低AS大鼠主動(dòng)脈弓分泌型血小板型磷脂酶A2的表達(dá)，提示藤茶雙氫楊梅素具有防治AS的作用。其作用機(jī)制是通過改善AS大鼠炎癥因子水平，抑制分泌型血小板型磷脂酶A2的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，藤茶總黃酮（主要成分為DMY）可顯著降低AS大鼠的血清低密度脂蛋白、三酰甘油及總膽固醇水平，升高高密度脂蛋白水平；顯著降低AS大鼠血漿黏度、全血黏度和紅細(xì)胞壓積，提示藤茶總黃酮可改善AS大鼠血脂水平和血流動(dòng)力學(xué)，具有防治AS的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，DMY具有血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。劉云霄等[8]研究發(fā)現(xiàn)，DMY能抑制H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，其機(jī)制與清除細(xì)胞內(nèi)活性氧、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)。HOU等[9]研究表明，DMY能通過線粒體凋亡途徑抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果顯示，DMY預(yù)處理能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的損傷，增加細(xì)胞的存活率，抑制細(xì)胞的凋亡，與以前的研究結(jié)果一致，但其機(jī)制還不清楚。

自噬是一種真核細(xì)胞進(jìn)化過程中高度保守的機(jī)制，在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下，利用溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器和入侵微生物的過程，是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)必不可少的一條分解代謝途徑，是細(xì)胞應(yīng)激情況下，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和存活的重要途徑。研究顯示，細(xì)胞自噬參與內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)，細(xì)胞自噬可降解和消化內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)受損、衰老和失去功能的細(xì)胞器和變性的蛋白質(zhì)，能減輕炎癥、氧化應(yīng)激和缺氧等誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和壞死。XIA等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飛燕草素三葡萄糖甙通過腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息調(diào)節(jié)因子1（AMP-activatedproteinkinase/silentinformationregulatoroftranscription1，AMPK/Sirt1）信號(hào)通路上調(diào)自噬水平，抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，Sirt3活化可維持細(xì)胞內(nèi)的自噬水平，而抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs的損傷[11]。Beclin-1和LC3是自噬標(biāo)志性蛋白。Beclin-1是哺乳動(dòng)物體內(nèi)參與細(xì)胞自噬的特異性基因，也是酵母自噬相關(guān)蛋白6的同系物。Beclin-1能與ClassⅢ磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）形成復(fù)合物，參與自噬前體復(fù)合物的形成和自噬小體膜的形成，成為自噬體形成的標(biāo)志性蛋白。最初合成一個(gè)未處理的LC3是前體LC3，自噬相關(guān)蛋白4可立即將其裂解，產(chǎn)生一種活躍的細(xì)胞溶質(zhì)形式被稱為L(zhǎng)C3-Ⅰ。隨著自噬相關(guān)蛋白7的催化和E2酶At93的結(jié)合，LC3-Ⅰ和豐富的膜磷脂即磷脂酰乙醇胺相互作用產(chǎn)生LC3-Ⅱ。LC3Ⅱ結(jié)合并位于胞內(nèi)自噬體膜上，其含量與自噬泡數(shù)量成正相關(guān)，反映自噬體的含量，因此LC3-Ⅱ表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ常用來反映自噬的水平。p62/SQSTM1是自噬降解的標(biāo)志物，常用來反映自噬活性。DMY對(duì)細(xì)胞自噬具有調(diào)節(jié)作用。XIA等[10]研究發(fā)現(xiàn)，DMY能抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶向基因（Mammaliantargetofrapamycin，mTOR）途徑誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞自噬。研究發(fā)現(xiàn)，DMY通過AMPK信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬，改善骨骼肌細(xì)胞的胰島素抵抗[12]。本研究結(jié)果顯示，DMY預(yù)處理增加ox-LDL誘導(dǎo)的HU VECs的自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量，上調(diào)Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，下調(diào)p62的表達(dá)，而自噬抑制劑3-MA部分抵消DMY對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs的保護(hù)作用，提示DMY通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。細(xì)胞自噬的調(diào)控過程十分復(fù)雜，涉及PI3KI/mTOR、PI3KⅢ和AMPK/Sirt1等信號(hào)通路，DMY誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的詳細(xì)過程有待進(jìn)一步研究。

總之，DMY能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制與促進(jìn)細(xì)胞自噬水平有關(guān)。本研究證實(shí)，DMY能通過保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞而發(fā)揮抗AS的作用，為臨床上將DMY用于內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)性疾病的防治，提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。

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（童穎丹 編輯）

Dihydromyricetin protects oxidized low-density lipoproteininduced damage by inducing autophagy in human umbilical vein endothelial cells

Hui-juan Zhong1,Lu Chen1,Hui-ying Liao2,Tao Zhang3,Bo Wang3,Jie Zhou4
(1.Department of Cardiology,Liwan Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou,Guangdong 510000,China;2.Department of Neurology,the First People's Hospital of Changde,Changde,Hunan 415003,China;3.The Second Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;4.Department of General Surgery,the 169thHospital of Chinese People's Liberation Army,Hengyang,Hunan 421001,China)

R543；R363

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.23.006

1005-8982（2017）23-0031-07

2016-08-28

周潔，Tel：0734-8483223；E-mail：zhoujie7927@126.com