藏藥佐太對藥物代謝酶CYP2C11和CYP2D1 的活性及蛋白和mRNA表達的影響 ※

楊 夢，年永瓊，周雪姣，喬一杰，辛元堯，張娟玲，李向陽*

(1.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，青海 西寧 810016；2.青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810001)

藏藥佐太對藥物代謝酶CYP2C11和CYP2D1的活性及蛋白和mRNA表達的影響※

楊 夢，年永瓊1，周雪姣1，喬一杰2，辛元堯1，張娟玲1，李向陽2*

(1.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，青海 西寧 810016；2.青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810001)

目的探討佐太對藥物代謝酶CYP2C11和CYP2D1活性，以及蛋白和mRNA表達的影響。方法140只SD大鼠，雌雄各半，隨機分為CYP2C11(給予探針藥物苯妥英)和CYP2D1(給予探針藥物右美沙芬)兩大組，每大組設7個小組，為對照組、小劑量單次給藥組、小劑量多次給藥組、中劑量單次給藥組、中劑量多次給藥組、大劑量單次給藥組、大劑量多次給藥組，每小組10只。采用探針藥物法測定大鼠給予佐太后藥物代謝酶活性的變化；ELISA法測定大鼠給予佐太后藥物代謝酶蛋白表達的變化；實時定量PCR法測定大鼠給予佐太后藥物代謝酶mRNA表達的變化。結果與對照組比較，單次給予佐太12.0 mg·kg-1后，CYP2C11的活性顯著升高105.3%；單次給予佐太3.8 mg·kg-1后，CYP2D1的活性顯著升高193.5%；CYP2D1的蛋白表達顯著升高84.3%；CYP2D1的mRNA表達顯著升高76.4%，其他組無顯著性變化。多次給予佐太1.2、3.8、12.0 mg·kg-1后，CYP2C11的活性分別顯著升高436.8%、131.6%、226.3% ；CYP2C11的蛋白表達分別顯著升高88.1%、38.7%、54.2%；CYP2C11的mRNA表達分別顯著升高126.8%、135.2%、100.0%；CYP2D1的活性分別顯著升高145.2%、71.0%、58.1%；CYP2D1的蛋白表達分別顯著升高84.5%、73.7%、33.4%；CYP2D1的mRNA表達分別顯著升高118.2%、67.3%、36.4%，其他組無顯著性變化。結論藏藥佐太對CYP2C11和CYP2D1的活性，蛋白質(zhì)及mRNA表達均具有顯著升高效果，顯示佐太在作為合劑時可誘導肝藥酶代謝加快。

藏藥 佐太 CY2C11 CYP2D1

“佐太”(佐塔)作為藏藥母本，“佐”為煮煎，“太”為灰或炭，“佐太”即水銀煅灰，即在金屬汞中加入多種輔助藥物，經(jīng)過洗、滌、煮等炮制工藝，去垢、去銹、除汞毒，煅炭存性而成的水銀灰藥，謂之佐太[1]。佐太一般不作為單純內(nèi)服藥物，臨床作為輔劑應用。

細胞色素P450超家族(CYP450)是介導人體內(nèi)藥物代謝的主要酶系，其中包含多個亞家族，CYP2C9和CYP2D6為CYP450酶系的重要亞型，參與多種藥物代謝過程。研究顯示，人CYP2C9、CYP2D6與大鼠CYP2C11、CYP2D1分別具有相同的探針藥物，結合CYP450酶系亞型的同源性，可建立兩者間的對應關系[2]。研究佐太對大鼠CYP2C11、CYP2D1的影響，可進一步推測人體內(nèi)對應CYP450酶系CYP2C9、CYP2D6的變化情況。

近年來國內(nèi)外佐太相關研究取得了很大進展，主要集中在佐太的制備工藝、藥理毒理、體內(nèi)代謝、安全性評價以及臨床應用等方面[3]。藥效學研究表明，佐太具有鎮(zhèn)靜、消炎、免疫調(diào)制、健脾、強身等作用[4，5]。向麗[6]和李岑[7]等對其毒理學進行了研究，證實了佐太及其制劑安全性較高，對機體無明顯毒副作用，長期使用會在腎臟蓄積，提示佐太不宜長期大劑量給藥。作者曾研究佐太對藥物代謝酶NAT2和CYP1A2的影響，結果顯示，佐太顯著影響藥物代謝酶CYP1A2和NAT2的活性和蛋白及mRNA表達[8]。為進一步研究佐太對其他藥物代謝酶的影響，本文探討了藏藥佐太對大鼠體內(nèi)藥物代謝酶CYP2C11、CYP2D1的活性及表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，體重200±20 g，雌雄各半，購于甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心，合格證號：SCXK(甘)2011-0001。分籠飼養(yǎng)，給予標準飼料，自由飲水。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

高效液相色譜儀(LC-10AT，日本shimadzu公司)；色譜工作站(N2000，浙江大學智能信息工程研究所)；電子分析天平(Sartorius BT224S，德國賽多利斯集團)；高速離心機(TGL-16B，上海安亭科學儀器廠)；旋渦混合器(XW-80A，上海精科有限公司)；生化測定儀(TBA120-FR，日本東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會社)；酶標儀(680型，美國伯樂公司)；熒光定量PCR儀(ABI7500 FAST，美國應用生物系統(tǒng)公司)；超速離心機(Optima MAX-XP，美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2.2 藥品和試劑

佐太由青海省藏醫(yī)院研制，批號：20111002，汞、金、鉛和銅含量分別為 52.29%、0.14%、0.17%和0.26%[9]。4′-羥化苯妥英(HPPH，Sigma公司，批號：00213DG)；苯妥英(PHT，日本東京化成工業(yè)株式會社，批號：GF01-FD)；右美沙芬(DM，Augsburg Germany，批號：00323)；去甲右美沙芬(DX，加拿大Toronto化學試劑公司，批號：6-MIC-142-1)；Trizol試劑(Invitrogen)。大鼠酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，CY2C11批號：E93294Ra；CYP2D1批號： E96192Ra)。氯仿、異丙醇和無水乙醇(AR，國藥集團)；DEPC H2O(Ambion)；Prime Script Reverse Transcriptase(Takara)；PCR試劑(promega Taq酶及配套試劑)；定量PCR試劑[上海睿安生物科技有限公司，HS qPCR Master Mix(2X)]。色譜純乙腈、甲醇(山東禹王實業(yè)有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物分組及給藥

140只SD大鼠，隨機分為CYP2C11(給予探針藥物PHT)和CYP2D1(給予探針藥物DM)兩大組，每大組設7個小組(雌雄各半)，為對照組、小劑量單次給藥組、小劑量多次給藥組、中劑量單次給藥組、中劑量多次給藥組、大劑量單次給藥組、大劑量多次給藥組，每小組10只大鼠。其中，單次給藥組為1次給藥，多次給藥組為每天1次，連續(xù)給藥12 d；佐太小、中、大劑量分別為1.2、3.8、12 mg·kg-1，首次灌胃前禁食12 h，自由進水。分別在對照組大鼠、單次給藥組大鼠第2天和多次給藥組大鼠第13天給予探針藥物PHT及DM。

1.3.2 樣品采集

灌胃給予大鼠PHT，給藥后12 h采集血液，分離血清，冷凍保存；采用兩步灌注法，對肝臟進行灌注，分離肝臟組織，于液氮冷凍保存待測。

大鼠灌胃給予探針藥物DM，8 h后采集尿液，冷凍保存；采用兩步灌注法，對肝臟進行灌注，分離肝臟組織，置液氮冷凍保存待測。

1.3.3 CYP2C11和CYP2D1活性測定

1.3.3.1 CYP2C11的活性測定

活性評價：大鼠灌胃給予探針藥物PHT，12 h后采集血液，制備血清，采用RP-HPLC法測定PHT和代謝產(chǎn)物HPPH的血藥濃度，以代謝產(chǎn)物HPPH與原型藥物PHT的濃度比值評價CYP2C11的活性。

標準系列樣品和質(zhì)控樣品的制備：分別精密稱取PHT和HPPH的對照品1 mg置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制備成1 mg·mL-1的PHT和HPPH的儲備液。精密量取儲備液，用甲醇梯度稀釋，得到標準系列樣品。取適量上述儲備液制備質(zhì)控樣品(QC)儲備液，用甲醇梯度稀釋為低、中、高濃度的質(zhì)控樣品。用空白血清稀釋PHT和HPPH的QC儲備液，制備定量下限和低、中、高濃度分別為1和2、8、16 μg·mL-1的質(zhì)控血清樣品。

樣品預處理：于離心管中精密加入0.3 mL血清樣品，渦旋0.5 min，加入等量乙腈，重復渦旋，離心(16 000 r·min-1)5 min，吸取上清液10 μL，進行HPLC分析。

方法學考察

專屬性：分別取對照品溶液(PHT、HPPH)，空白血清，空白血清中加入PHT、HPPH的對照品溶液，給藥12 h后的大鼠血清，按“樣品預處理”項下所示方法操作，進樣分析，得對應色譜圖。

標準曲線：取0.3 mL空白血清，分別加入適量混合標準工作液，配成含PHT、HPPH均為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg·mL-1的系列濃度血清樣品，按“樣品預處理”操作，進樣分析(各濃度取6個樣本)，記錄PHT、HPPH的峰面積，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，進行回歸計算，求得線性回歸方程。

回收率：取低、中、高濃度的質(zhì)控樣品(PHT、HPPH均為2、8、16 μg·mL-1)，按“樣品預處理”項下所示方法操作并進樣分析(各濃度取6個樣本)，以質(zhì)控樣品峰面積與空白血清(預處理后上清液)加入對照品溶液測得峰面積比值計算回收率。

精密度與準確度：取定量下限和低、中、高濃度的質(zhì)控樣品(PHT、HPPH均為1和2、8、16μg·mL-1)，按“樣品預處理”項下所示方法操作并進樣分析(各濃度取6個樣本)，測定3天，記錄PHT和HPPH的峰面積，代入當日標準曲線回歸方程，得到測得濃度，再計算準確度與精密度。

基質(zhì)效應：分別取6個不同來源的大鼠空白血清，按“樣品預處理”項下所示方法操作，取上清液，加入適量對照品溶液(PHT、HPPH)，配成低、高濃度分別為2、16 μg·mL-1的質(zhì)控樣品。用水代替空白血清，依上述方法處理。各濃度取3個樣本分析，以兩種條件下峰面積比值評價基質(zhì)效應。

穩(wěn)定性試驗：取低、高濃度的質(zhì)控樣品(PHT、HPPH均為2、16μg·mL-1)，按“樣品預處理”項下所示方法操作并進樣分析(各濃度取6個樣本)，考察室溫(25℃)放置8 h、冷凍(-20℃)放置60 d、-20 ℃反復凍融3次、進樣器內(nèi)放置24 h等條件下的穩(wěn)定性。

1.3.3.2 CYP2D1的活性測定

活性評價：大鼠灌胃給予探針藥物DM，8 h后采集尿液，采用RP-HPLC法測定DM和代謝產(chǎn)物DX的尿藥濃度，以代謝產(chǎn)物DX與原型藥物DM的濃度比值評價CYP2D1的活性。

色譜條件：流動相為乙腈(A)-1%三乙胺水溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH=2.2，B)，梯度洗脫，0～15 min，A 20%～35%。色譜柱為Boston Green ODS(250mm×4.6mm，5μm)，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為280 nm，進樣量為10 μL。

標準系列樣品和質(zhì)控樣品的制備：分別精密稱取DM和DX的對照品1 mg置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制備成1 mg·mL-1的DM和DX儲備液。精密量取儲備液，甲醇梯度稀釋，得到標準系列樣品。取適量上述儲備液制備質(zhì)控樣品(QC)儲備液，用甲醇梯度稀釋為低、中、高濃度的質(zhì)控樣品。用空白尿液稀釋DM和DX的QC儲備液，制備定量下限和低、中、高濃度分別為1.0、2.5、15.0、35.0 μg·mL-1的質(zhì)控尿液樣品。

樣品預處理：于離心管中精密加入0.3 mL尿液樣品，渦旋0.5 min，加入0.3 mL乙腈，離心(16 000 r·min-1)5 min，吸取上清液10 μL，進行HPLC分析。

方法學考察

專屬性：分別取對照品溶液(DM、DX)，空白尿液，空白尿液中加入DM、DX的對照品溶液，給藥后8 h的尿液樣品，按“樣品預處理”項下所示方法操作，進樣分析，得對應色譜圖。

標準曲線：取離心管數(shù)支，加入0.3 mL空白尿液，配成含DM和DX均為1、2、5、10、20、40 μg·mL-1的系列濃度尿液樣品。按“樣品預處理”項下所示方法操作(各濃度取6個樣本)，記錄DM和DX的峰面積，以平均峰面積為縱坐標，DM和DX濃度為橫坐標，得到線性回歸方程。

回收率：取低、中、高濃度(DM及DX均為2.5、15.0、35.0 μg·mL-1)的質(zhì)控樣品，按“樣品預處理”項下所示方法操作并進樣分析(各濃度取6個樣本)，記錄峰面積，以質(zhì)控樣品與空白尿液(預處理后上清液)加對照品溶液測得峰面積的比值計算回收率。

精密度與準確度：配制定量下限和低、中、高濃度的質(zhì)控樣品(DM及DX均為1.0和2.5、15.0、35.0 μg·mL-1)，各濃度取6個樣本，連續(xù)測定3天。按“樣品預處理”項下所示方法操作，進樣分析，記錄DM和DX的峰面積，代入當日標準曲線回歸方程，計算出濃度，再計算準確度與精密度。

基質(zhì)效應：分別取6個不同來源的大鼠空白尿液，按“樣品預處理”項下所示方法操作，取上清液，加入適量對照品溶液(DM、DX)，配成低、高濃度分別為2.5、35.0 μg·mL-1質(zhì)控樣品。用水代替空白尿液，依上述方法處理。各濃度取3個樣本分析，以兩種條件下峰面積比值評價基質(zhì)效應。

穩(wěn)定性試驗：取低、高濃度的質(zhì)控樣品(DM、DX均為2.5、35.0μg·mL-1)，按“樣品預處理”項下所示方法操作并進樣分析，各濃度取6個樣本分析，考察室溫(25℃)放置12 h、冷凍(-20℃)放置120 d、-20 ℃反復凍融3次、進樣器內(nèi)放置24 h等條件下的穩(wěn)定性。

1.3.4 蛋白定量

肝微粒體制備：采用超速離心法制備肝微粒體。精密稱取大鼠肝組織1 g，加入3 mL 50 mmol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液(含200mmol·L-1蔗糖、3mmol·L-1MgCl2和1 mmol·L-1EDTA，調(diào)pH值為7.4)，制成30%組織勻漿，離心(11 000 r·min-1)30 min，分取上清液，離心(100 000 r·min-1)80 min，所得沉淀即為大鼠肝微粒體，用Tris-HCl溶液清洗，離心(100 000 r·min-1)60 min。上述每一步均在-4 ℃條件下操作。用10 mmol·L-1的Hepes-HCl溶液懸浮肝微粒體置液氮中保存待測。

CYP2C11和CYP2D1的蛋白定量測定均采用ELISA方法。50 μL標準品稀釋液加入酶標板標準孔中，40 μL樣品稀釋液加入待測樣品孔中，然后再加10 μL待測樣品，混勻，在37 ℃條件下孵育30 min。棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30 s后棄去，共重復5次，拍干。除空白孔外，每孔加入50 μL酶標試劑，混勻，37 ℃孵育30 min，棄去液體，加洗滌液洗滌，重復5次后拍干。每孔依次加入50 μL的顯色劑A和B，混勻后于37 ℃避光顯色10 min，加入50 μL終止液，終止反應，于450 nm波長下立即測量各孔的OD值。將測得的OD值分別代入的回歸方程計算對應的蛋白濃度，CYP2C11：C=28.73×OD-1.19，r=0.9974；CYP2D1：C=91.84×OD-8.90，r= 0.9987。

1.3.5 實時熒光定量 PCR

取適量大鼠肝組織，置于研缽中，加入液氮迅速研磨至粉末，用Trizol試劑提取總RNA并定量，取適量RNA用AMV反轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA。用熒光定量PCR儀進行PCR反應，反應參數(shù)：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火 60 s，共40個循環(huán)。每次擴增設置β-actin基因內(nèi)參照。由PCR儀自帶軟件進行熒光定量分析，得出Ct值。引物和Tag Man熒光探針由Primer Express軟件設計，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。

CYP2C11引物序列：

5′-CGGGAAGTCATACGACATTAGC-3′(上游引物)，

5′-GCAGAGAGGCAAATCCATTG-3′(下游引物)；

CYP2D1引物序列：

5′-TGGAGCAGTGGGTGACAGA-3′(上游引物)，

5′-AAGTCCAGGAGCCTGATGAA-3′(下游引物)，

β-actin引物序列：

5′- CAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′(上游引物)，

5′- TGGCATAGAGGTCTTTACGGA -3′(下游引物)，

1.3.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 活性測定方法學考察

2.1.1 CYP2C11

專屬性：結果顯示在建立的色譜條件下，HPPH、PHT峰形較好，基線平穩(wěn)，無雜峰，大鼠血清對以上目標檢測物無干擾。

標準曲線：回歸方程HPPH A=16 020×C+738，r=0.9991；PHT：A=15 330×C+2528，r=0.9995，均在1～20 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好，定量限均為1 μg·mL-1。

回收率：結果顯示HPPH低、中、高濃度的回收率在86.14%～90.36%之間，PHT低、中、高濃度的回收率在87.44%～91.65%之間。

精密度與準確度：試驗結果顯示HPPH定量下限和低、中、高濃度的批內(nèi)和批間精密度均低于8.86%，PHT定量下限和低、中、高濃度的批內(nèi)和批間精密度均低于8.74%。

基質(zhì)效應：考察結果顯示HPPH、PHT在低、高濃度的基質(zhì)效應均在89.2%～108.4%，RSD均小于6.8%。

穩(wěn)定性實驗：HPPH及PHT低高濃度血清樣品室溫(25℃)放置8 h、冷凍(-20℃)放置60 d、-20 ℃反復凍融3次、進樣器內(nèi)放置24 h等條件下回收率(RE)分別在1.8%～4.4%、3.1%～6.9%、-1.5%～5.7%、-1.8%～6.2%之間，樣品穩(wěn)定性良好。

2.1.2 CYP2D1

專屬性：結果顯示在建立的色譜條件下，DX、DM峰形較好，基線平穩(wěn)，無雜峰，大鼠尿液對以上目標檢測物無干擾。

標準曲線：回歸方程DM A=3391×C+1520，r=0.9995；DX：A=3084×C+ 371，r= 0.9997，均在1～40 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好，定量限均為1 μg·mL-1。

回收率：結果顯示DM低、中、高濃度的回收率在95.03%～96.77%之間，DX低、中、高濃度的回收率在92.89%～95.95%之間。

精密度與準確度：試驗結果顯示DM低、中、高濃度的批內(nèi)和批間精密度均低于4.98%，DX低、中、高濃度的批內(nèi)和批間精密度均低于9.66%。

基質(zhì)效應：考察結果顯示DM、DX在低、高濃度的基質(zhì)效應均在87.9%～107.6%，RSD均小于5.9%。

穩(wěn)定性實驗：DM及DX低高濃度尿液樣品(25℃)放置12 h、冷凍(-20℃)放置120 d、-20 ℃反復凍融3次、進樣器內(nèi)放置24 h等條件下回收率(RE)分別在-3.5%～4.6%、2.5%～7.8%、-1.3%～6.5%、-4.2%～3.8%之間，樣品穩(wěn)定性良好。

2.2 CYP2C11及CYP2D1活性測定

對照組、佐太單次給藥組和佐太多次給藥組的大鼠CYP2C11及CYP2D1活性測定結果見圖1。結果表明，與對照組比較，單次給予佐太12 mg·kg-1后，CYP2C11的活性顯著升高105.3%，單次給予佐太3.8 mg·kg-1后，CYP2D1的活性顯著升高193.5%；多次給予佐太1.2、3.8 、12.0 mg·kg-1后，CYP2C11的活性分別顯著升高436.8%、131.6%、226.3%，CYP2D1的活性分別顯著升高145.2%、71.0%、58.1%。其他組無顯著性變化。

2.3 CYP2C11及CYP2D1蛋白表達

對照組、佐太單次給藥組、佐太多次給藥組CYP2C11和CYP2D1的蛋白定量測定結果見圖2。結果顯示，與對照組比較，單次給予佐太3.8 mg·kg-1后，CYP2D1的蛋白表達顯著升高84.3%；多次給予佐太1.2、3.8、12.0 mg·kg-1后，CYP2C11的蛋白表達分別顯著升高88.1%、38.7%、54.2%，CYP2D1的蛋白表達分別顯著升高84.5%、73.7%、33.4%。其他組無顯著性變化。

2.4 CYP2C11及CYP2D1 mRNA表達

對照組、佐太單次給藥組、佐太多次給藥組CYP2C11和CYP2D1的mRNA表達測定結果見圖3。結果顯示，與對照組比較，單次給予佐太3.8 mg·kg-1后，CYP2D1的mRNA表達顯著升高76.4%；多次給予佐太1.2、3.8、12.0 mg·kg-1后，CYP2C11的mRNA表達分別顯著升高126.8%、135.2%、100.0%，CYP2D1的mRNA表達分別顯著升高118.2%、67.3%、36.4%。其他組無顯著性變化。

3 討論

本研究采用探針藥物法測定了CYP2C11和CYP2D1活性的變化。結果顯示，三個劑量的佐太單次給藥對CYP2C11的活性，蛋白以及mRNA表達基本無影響；佐太單次給予1.2、12.0 mg·kg-1對CYP2D1的活性，蛋白以及mRNA表達基本無影響。但佐太單次給予3.8 mg·kg-1后，CYP2D1的活性，蛋白以及mRNA表達均顯著升高，原因可能是佐太對酶活性的調(diào)節(jié)作用與其所含金屬離子濃度有關，在一定濃度范圍內(nèi)，酶活性升高效果顯著，超過濃度閾值，對酶活性的影響效果反而降低[8]。與單次給藥組相比，多次給藥組均出現(xiàn)了藥物代謝酶活性及相關表達的顯著升高，推測原因是佐太的連續(xù)給藥對機體產(chǎn)生了累積效應，形成了對酶活性的顯著影響，但影響程度與劑量缺乏良好的劑量—效應關系，原因還有待于進一步探討。采用ELISA和實時熒光定量PCR法分別測定了CYP2C11和CYP2D1的蛋白及mRNA表達，發(fā)現(xiàn)多次給予佐太后，其蛋白和mRNA表達均發(fā)生顯著升高，其蛋白和mRNA表達的變化與活性變化的趨勢一致，推測兩種代謝酶活性的升高分別與其蛋白和mRNA表達的升高有關。

文獻報道汞、鉛、砷、銀、鋅等金屬顯著影響藥物代謝酶的活性，佐太是多種金屬的復合物，對藥物代謝酶具有一定的影響[10，11]。作者曾研究了佐太對藥物代謝酶CYP1A2和NAT2的影響，結果顯示，佐太顯著降低藥物代謝酶NAT2和CYP1A2的活性、蛋白和mRNA表達[8]。本文研究結果顯示佐太對機體藥物代謝酶CYP2C11和CYP2D1活性、蛋白和mRNA表達具有誘導升高作用，提示藥物代謝酶的種類不同，佐太的影響也不同。含有佐太的復方制劑臨床應用范圍較廣，主要用于心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等相關系統(tǒng)疾病的治療[12-14]，本研究為佐太在方劑中具有協(xié)同增效作用提供了相關佐證，并對合理解釋藏藥中的重金屬問題提供了理論依據(jù)。

由于佐太在其炮制過程中加入多種重金屬及非金屬，組成復雜，性質(zhì)差異也較大，體內(nèi)的藥代動力學過程更加復雜，同時酶活性的影響因素較多，相關作用機制有待于進一步闡明。研究者以臨床等效劑量連續(xù)給予KM小鼠佐太4.5個月后，對其生長發(fā)育狀況、血常規(guī)指標、血清生化指標、腦組織學結構以及肝腎功能均未產(chǎn)生顯著影響[15]。作者曾以汞為檢測指標，初步研究了佐太在大鼠體內(nèi)的吸收和排泄情況。結果顯示汞在大鼠體內(nèi)吸收較少，短期給藥對肝腎組織無蓄積及毒性作用[16]，提示佐太對藥物代謝酶的影響與機體肝腎功能無關。

含重金屬藥物多為傳統(tǒng)中藥(諸如雄黃、朱砂、鉛丹、輕粉、白降丹、樸消、寒水石等)，藥材質(zhì)量常受到環(huán)境以及土壤污染的影響。陳朝軍等[17]研究了不同產(chǎn)地寒水石的重金屬及有害元素含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的寒水石晶體結構、共生元素、微量元素以及有害元素存在差異。作為藏藥母本，佐太在其他藏區(qū)也有生產(chǎn)，本實驗所用樣品為青海省藏醫(yī)院研制，其他地區(qū)佐太能否得到類似結果，對藥物代謝酶產(chǎn)生類似影響，都有待于進一步驗證。佐太作為藏成藥中重金屬的主要來源，質(zhì)量標準應與西藥標準中金屬含量控制有所區(qū)別。目前，關于佐太的質(zhì)量標準有了初步成果，但是佐太的制備及含量控制尚未出現(xiàn)全面系統(tǒng)的國家藥品質(zhì)量標準，考慮到臨床用藥的有效性、安全性以及差異性，應加快推進藏藥質(zhì)量的標準統(tǒng)一化。

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EffectsofTibetanmedicineZuotaiontheactivity，proteinandmRNAexpressionofCY2C11andCYP2D1

YANG Meng1，NIAN Yong-qiong1，ZHOU Xue-jiao1，QIAO Yi-jie1，XIN Yuan-yao1， ZHANG Juan-ling，LI Xiang-yang2*

(1.College of Ecological Environment Engineering，Qinghai University，Xining，Qinghai，810016，China； 2.Qinghai University Medical college，Xining，Qinghai，810001 China)

ObjectiveTo investigate the effects of Tibetan medicine Zuotai on the activity，protein and mRNA expression of CYP2C11 and CYP2D1.Methods140 SD rats are randomly divided into two groups with half male and female：CYP2C11(treated with probe drug phenytoin)and CYP2D1(treated with probe drug dexamethasone).Each group were divided into seven groups with ten rats which are control group，single low-dose administration group，multiple low-dose，single middle-dose，multiple middle-dose，single high-dose，multiple high-dose.The activity of drug metabolizing enzyme in rats was determined by probe drug method.The protein and mRNA expression of drug metabolizing enzyme in rats were determined by ELISA and real-time quantitative PCR.ResultsCompared with the reference，the activity of CYP2C11 was significantly increased by 105.3% after treated with 12.0 mg·kg-1Zuotai single administration.The activity of CYP2D1 was significantly increased by 193.5% after treated with 3.8 mg·kg-1Zuotai single administration.The protein and mRNA expression of CYP2D1 was drastically enhanced over 84.3% and 76.4%，and there was no significant change in other groups.After treated with Zuotai multiple administration of 1.2，3.8，12.0 mg·kg-1，the activity of CYP2C11 and CYP2D1 show 436.8%，131.6%，226.3% and 145.2%，71.0%，58.1% improvement，respectively.The protein and mRNA expression of CYP2C11 were drastically enhanced over 88.1%，38.7%，54.2% and 126.8%，135.2%，100.0%，respectively.The protein and mRNA expression of CYP2D1 were drastically enhanced over 84.5%，73.7%，33.4% and 118.2%，67.3%，36.4%，respectively.There was no significant change in other groups.ConclusionTibetan medicine Zuotai can drastically enhance the activity，protein and mRNA expression of CYP2C11 and CYP2D1，show that Zuotai as a mixture can induce accelerating liver enzyme metabolism .

Tibetan medicine Zuotai CY2C11 CYP2D1

R969.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.03.006

2017-2-3

※：國家自然科學基金(81460568，81760673)；*：通信作者，博士生導師，E-mail：qhmclxy@163.com 楊夢(1993～)，女，漢族，安徽籍，青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院2015級碩士研究生