果蠅幼蟲唾腺染色體標(biāo)本的制備與比較*

羅玉娥 黎杰強(qiáng) 何風(fēng)華 高 峰

（華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東廣州 510631）

0 前言

唾腺染色體（salivary gland chromosome）是一種具多線性的巨大染色體，因最早在雙翅目昆蟲的唾腺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)而得名，又稱多線染色體（polytene chromosome）。雙翅目昆蟲的唾腺細(xì)胞分化并發(fā)育到一定階段后就不再分裂，而染色體不斷復(fù)制，且復(fù)制后得到的新染色線與原來的染色體平行排列，最終形成約1 000拷貝的巨型染色體。其長度是有絲分裂中期染色體的150多倍[1］，在顯微鏡下清晰可見。雙翅目幼蟲體細(xì)胞含4對染色體，但在其唾腺細(xì)胞中只觀察到4條染色體，這是因為唾腺細(xì)胞發(fā)生了體細(xì)胞同源染色體聯(lián)會現(xiàn)象，1對同源染色體緊密配對形成1條染色體。經(jīng)染色后，多線染色體呈一系列明、暗帶相間的橫紋。每條染色體上橫紋的寬窄、數(shù)目、排列順序及疏密程度都因物種不同而異[2］。多線染色體上的疏松區(qū)域稱為“蓬突”或“泡”，與基因表達(dá)緊密相關(guān)。除了唾腺，多線染色體也存在于雙翅目昆蟲的馬氏管、腸、脂肪體等組織中；纖毛蟲類的大核原基、被子植物的胚乳以及彈尾目、鱗翅目和直翅目的某些特定細(xì)胞中也曾發(fā)現(xiàn)巨大染色體[3］。由于巨大的形態(tài)結(jié)構(gòu)，多線染色體已被廣泛應(yīng)用于生物的細(xì)胞遺傳、系統(tǒng)分類、基因的定位和克隆及基因結(jié)構(gòu)的研究[4］。

本實驗采用雙翅目的黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）幼蟲為實驗材料。黑腹果蠅具有體型小、易飼養(yǎng)、繁殖快、性狀表現(xiàn)極豐富等特點，使其成為奠定經(jīng)典遺傳學(xué)基礎(chǔ)的重要模型生物之一[5］。多線染色體的研究實驗常以果蠅幼蟲為材料，除了上述原因外，還因為果蠅幼蟲的唾腺易獲取、唾腺染色體巨大、數(shù)量少（2n=8）、橫紋清晰等優(yōu)點。

在我國，自1983年劉凌云[6］發(fā)表多線染色體制片方法的報道以來，陸續(xù)有不少研究者探討制備方法的改進(jìn)，試圖獲得更清晰的染色效果、更舒展的染色體臂等。但鮮有報道果蠅唾腺染色體臂的識別、基因突變對染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響等內(nèi)容。有鑒于此，本文描述了果蠅唾腺染色體臂的識別、3種品系果蠅唾腺染色體的比較等，主要目的是：確認(rèn)有效的唾腺染色體辨認(rèn)方法；研究基因突變對唾腺染色體橫紋的寬窄、數(shù)目、排列順序及疏密程度的影響；為實驗教學(xué)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗所用的3種黑腹果蠅為野生型果蠅（18號）、黑檀體果蠅（e號）和三隱性果蠅（6號），果蠅的表現(xiàn)性狀見表1，果蠅突變性狀見表2。

表1 3種品系果蠅的表現(xiàn)性狀

表2 3種品系果蠅的突變性狀

1.2 方法

1.2.1 玉米-瓊脂培養(yǎng)基的配制[7］

1）A 液：取糖 62g，瓊脂 6.2 g，水 380 mL，煮沸溶解。

2）B 液：取玉米粉 82.5 g，水 380 mL，攪拌溶解。

3）A、B液混合加熱，煮沸成糊狀，加 0.5 mL丙酸，稍冷卻后加入20片研磨成粉狀的酵母。

4）分裝至 50 mL錐形瓶，高度約 1.5～2 cm，覆兩層紗布，用橡皮筋綁緊。

5）冷卻后放入5℃冰箱低溫保存。

1.2.2 果蠅的培養(yǎng)

1）取裝有培養(yǎng)基的錐形瓶6個置于烘箱中，打開通風(fēng)口和開關(guān)，當(dāng)溫度升至60℃關(guān)閉開關(guān)和通風(fēng)口。

2）5 h后，取出錐形瓶，進(jìn)行果蠅接種。

3）18號、e號和6號各接種2個錐形瓶，每個錐形瓶約15只果蠅，貼上注明品系號、接種日期的標(biāo)簽。

4）放入恒溫箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)置為23～25℃。

5）3～4 d后，移出錐形瓶中的果蠅。

6）7～9 d后，陸續(xù)有乳白色幼蟲爬上瓶壁，挑選肥大的幼蟲進(jìn)行實驗。

1.2.3 果蠅幼蟲唾腺染色體標(biāo)本的制備[7］

1）腺體剖?。哼x取蟲體肥大的3齡幼蟲，置于載玻片上，加幾滴0.7%生理鹽水，在雙目解剖鏡下左手持解剖針壓住蟲體中后部，右手持解剖針按住頭部，輕輕向前拉動，使頭部扯離蟲體，從而拉出唾腺。腺體呈透明囊狀結(jié)構(gòu)，位于食管兩側(cè)；腺體側(cè)常有乳白色脂肪體，應(yīng)盡量剔除。

2）解離：載破片上僅留腺體，用吸水紙小心吸去生理鹽水，加1滴1 mol/L HCl，解離2～3 min。

3）染色：用吸水紙吸去鹽酸，加1滴蒸餾水輕輕沖洗后吸干。加2滴醋酸洋紅或改良品紅染液，染色10～20 min。

4）壓片：換上新鮮染液，蓋上蓋玻片，用吸水紙輕輕覆蓋玻片。左手固定蓋玻片，右手先用手指垂直輕壓蓋玻片，再用鉛筆的橡皮頭或解剖針垂直輕敲，或進(jìn)一步用拇指在蓋玻片上適當(dāng)用力壓片，注意勿使蓋玻片移動。

5）鏡檢：在低倍鏡下找到分散良好的標(biāo)本，移至視野中央，轉(zhuǎn)到高倍鏡下觀察。對染色體分散、橫紋清晰的片子進(jìn)行拍照。

1.2.4 不同果蠅幼蟲唾腺染色體的比較 挑選橫紋清晰、不變形、染色體臂較為完整的圖片，與Lefevre繪制的果蠅唾腺染色體臂的照片圖譜（網(wǎng)址：http://flybase.org/maps/chromosomes/maps.html）進(jìn)行對照，辨認(rèn)不同染色體臂，并對3種品系果蠅的唾腺染色體進(jìn)行比較，重點比較突變基因所在區(qū)域的橫紋的寬窄、數(shù)目、疏密和排列順序。利用Adobe Photoshop的標(biāo)尺工具，在同一放大倍數(shù)下，測量突變基因所在橫紋的寬度及突變基因所在區(qū)域的長度，并計算相對寬度。比較突變基因所在區(qū)域的橫紋的疏密程度時，利用Adobe Photoshop在同一放大倍數(shù)下測量突變基因所在橫紋與左、右最近2條橫紋的距離，求相對距離。突變基因所在橫紋距離靠近端粒端（即游離端）的最近一條橫紋的距離，簡稱為距端距離；突變基因所在橫紋距離靠近染色中心的最近一條橫紋的距離，簡稱為距心距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 果蠅幼蟲唾腺染色體臂的辨認(rèn) 辨認(rèn)果蠅幼蟲唾腺染色體臂的最常用方法，是根據(jù)染色體臂端粒端的形態(tài)特征進(jìn)行辨認(rèn)，染色體臂幾種常見形態(tài)見圖1（本文附圖見插頁1）。在6條臂中，第Ⅳ染色體臂（圖 1-o，1-p，1-q）最短，橫紋難以看清，形態(tài)似乎也在變化，臂充分伸展時可在染色中心附近觀察到。5條長臂中，第Ⅰ染色體（X染色體）1條臂，第Ⅱ、第Ⅲ染色體各自2條臂，分別記為 2L、2R 和 3L、3R。

X 染色體臂（圖 1-a，1-b，1-c）頭部像一個彈頭，彈頭下方有一個永久性蓬突（圖中箭頭所指），是辨認(rèn)X染色體的最突出特征。2L（圖1-d，1-e）頭部散開呈扇狀，端粒端有6條深染橫紋，其中如圖標(biāo)示的2、3、4位置上的橫紋較寬。對于2R、3L和3R端粒端，筆者均發(fā)現(xiàn)有2種形態(tài)。2R第1種形態(tài)（圖1-f，1-g）頭部呈圓弧形，末端可清晰看到1條深染的較寬橫紋；第2種形態(tài)（圖1-h）頭部呈截斷狀，末端有1條深染的較細(xì)橫紋。但2R 2種形態(tài)的端粒端均有5條深染橫紋（圖標(biāo)1-5橫紋），其后有2條淺染橫紋（圖標(biāo)6、7橫紋）。3L第 1種形態(tài)（圖 1-i，1-j）頭部像一頂僧帽，在帽頂（圖標(biāo)A）有1條細(xì)橫紋和1條較粗橫紋，帽檐（圖標(biāo)B）有1條細(xì)橫紋，在圖標(biāo)1-6位上固定有6條深染橫紋；第2種形態(tài)（圖1-k）頭部呈扇形，在圖標(biāo)1、3、5及6位上為深染橫紋，在圖標(biāo)2、4位上為淺染橫紋。3R第1種形態(tài)（圖1-l，1-m）頭部呈扇形，第2種形態(tài)（圖1-n）頭部呈截斷狀，且末端有1條深染橫紋。3R 2種形態(tài)在圖標(biāo)1處均有1條虛線狀的橫紋，其后有4條深染橫紋，圖標(biāo)2、3和4、5位的橫紋分別排列得較緊密。

2R第2種形態(tài)與3R第2種形態(tài)在光學(xué)顯微鏡下觀察十分相似，兩者區(qū)別：1）3R頭部有一虛線狀橫紋，2R在相應(yīng)位置上沒有。2）2R在圖標(biāo)1、2、3、4位上的橫紋排列勻稱，橫紋之間距離接近，圖標(biāo)5處橫紋與圖標(biāo)4處的橫紋排列緊湊，而3R在圖標(biāo)2、3及4、5處的橫紋形成2對排列緊湊的橫紋。

2.2 3種品系果蠅幼蟲唾腺染色體臂橫紋的比較 18號（圖 2-a）、e號（圖 2-b）和 6號（圖 2-c，2-d）果蠅唾腺染色體都具有染色中心，都由染色中心延伸出6條臂，其中5條長臂和1條短臂。

參照Lefevre繪制的果蠅唾腺染色體臂照片圖譜的分區(qū)方法[8］，e號果蠅的突變基因 e位于93C7-93D1（圖3-a）。比較e號與 18號果蠅93區(qū)的橫紋數(shù)和排列順序，兩者從左到右依次為3條深染帶、4條淺染帶、2條深染帶。由表3～表5可知，e號果蠅突變基因所在橫紋的寬度及相對距端、相對距心距離與18號果蠅不存在顯著性差異。

6號果蠅的突變基因w、Sn3及m分別位于3B6（圖 3-b）、7D1-7D2（圖 3-c）、10E1-10E2（圖 3-d）。6號與18號果蠅的3區(qū)從左至右依次有1條深染帶、1條淺染帶、1條粗深染帶、2條深染帶、3條淺染帶；7區(qū)從左至右依次有4條深染帶、2條淺染帶、2條深染帶；10區(qū)從左到右依次有2條深染帶、5條淺染帶。由表3～表5可知，6號果蠅3個突變基因各自所在橫紋的寬度及相對距端、相對距心距離與18號果蠅均無顯著差異。

表3 3種品系果蠅突變基因所在橫紋的相對寬度的平均值（x±s，*P<0.05）

表4 3種品系果蠅突變基因的相對距端距離的平均值（x±s，*P<0.05）

表5 3種品系果蠅突變基因的相對距心距離的平均值（x±s，*P<0.05）

3 討論

3.1 果蠅幼蟲唾腺染色體臂的辨認(rèn) 多線染色體橫紋的寬窄、數(shù)目、排列順序及疏密程度都具有物種特異性，果蠅不同染色體臂的橫紋也各有特色，且染色體臂末端易壓散，故通過辨認(rèn)染色體臂的端粒端確認(rèn)各染色體是最常用也最便捷的方法。快速掌握此法的技巧是先粗看再細(xì)看，先粗略觀察端粒端的整體形態(tài)，確定可能與之對應(yīng)的染色體臂，再與照片圖譜進(jìn)行橫紋的一一對應(yīng)，最終確定染色體臂名稱。結(jié)合照片圖譜多練習(xí)幾次后便能熟練掌握，快速辨認(rèn)各染色體臂。

果蠅5條長臂的端粒端一般各自有幾種不同的形態(tài)，但端粒端的橫紋特征基本是恒定的，這與楊大翔[9］的結(jié)論相同。同一染色體臂末端出現(xiàn)不同形態(tài)，可能是受幼蟲齡期和壓片角度、力度等影響。

在末端模糊不可辨認(rèn)時，也可從近染色中心處，或選取染色體臂上橫紋清晰的具突出特征的2～3個區(qū)域，與照片圖譜比對，進(jìn)而確認(rèn)染色體臂名稱。染色體上的蓬突和縊縮是幫助確認(rèn)的重要特征，可由此2處出發(fā)向左或向右選取幾個區(qū)域進(jìn)行比對。

3.2 3種品系果蠅幼蟲唾腺染色體臂橫紋的比較 3種品系黑腹果蠅，體細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=8，18號為野生型果蠅，性狀表現(xiàn)為灰體、紅眼、長翅、直剛毛；e號為黑檀體果蠅，位于第3對染色體右臂（3R）一對等位基因發(fā)生隱性突變，體色性狀表現(xiàn)為烏木色、黑亮；6號為三隱性果蠅，即位于X染色體上控制眼色、翅長、剛毛的3對基因發(fā)生隱性突變，性狀表現(xiàn)為白眼、短小翅、焦剛毛。

實驗結(jié)果表明，3種品系果蠅幼蟲在唾腺染色體橫紋的寬窄、數(shù)目、排列順序及疏密程度上不存在明顯的差異（圖 3、表 3～表 5）。原因：1）少數(shù)幾個基因的突變不足以引起染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化?；蚴蔷哂羞z傳效應(yīng)的DNA片段，DNA分子與蛋白質(zhì)纏繞形成染色質(zhì)絲，染色質(zhì)絲上不同區(qū)域發(fā)生不同程度的螺旋，聚合成染色粒，上千拷貝的染色粒隨著上千染色質(zhì)絲平行排列而整齊排列，故經(jīng)染色后呈現(xiàn)出寬窄不一的橫紋?；蛲蛔兪怯蓧A基對的替換、增添和缺失而形成的基因結(jié)構(gòu)的改變。少數(shù)幾個堿基對的改變可能并不影響染色粒的形成及染色質(zhì)絲的排列，故3種品系果蠅幼蟲的唾腺染色體在形態(tài)上無明顯差別。2）3種品系果蠅幼蟲唾腺染色體的橫紋、疏松區(qū)可能在不同齡期幼蟲中存在差異，但3齡幼蟲時這種差異不存在，是否如此有待進(jìn)一步研究。3）3種品系果蠅在3齡幼蟲的唾腺染色體中可能存在微細(xì)差異，但僅通過形態(tài)、結(jié)構(gòu)的觀察并不能發(fā)現(xiàn)，可結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)等進(jìn)行更深入研究。

4 結(jié)論

本文結(jié)論主要有以下2點。

1）果蠅唾腺染色體臂端粒端的橫紋特征基本恒定，是辨認(rèn)各染色體臂的最便捷方法。此外，蓬突和縊縮也是辨認(rèn)多線染色體的重要特征。

2）18號與e號、6號果蠅幼蟲，在唾腺染色體橫紋的寬窄、數(shù)目、排列順序及疏密程度上不存在明顯的差異，在不同變種之間無法區(qū)分。