響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取平臥菊三七多酚工藝

魏晶，葉芝紅，林樂珍，鄭國棟

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取平臥菊三七多酚工藝

魏晶，葉芝紅，林樂珍，鄭國棟*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045）

以平臥菊三七粉末為原料，在單因素的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度，超聲溫度，超聲時間，超聲功率為自變量，平臥菊三七多酚提取率為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合（Box-Benhnken）試驗(yàn)設(shè)計原理，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測模型，優(yōu)化平臥菊三七多酚超聲提取工藝。所得最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度55%，超聲溫度70℃，超聲時間53 mim，超聲功率106 W，在此條件下，平臥菊三七多酚提取率為0.522%，與預(yù)測值0.524%基本一致。

平臥菊三七；多酚；超聲波提??；響應(yīng)面法

Abstract：On the basis of single-factor test，the response surface methodology was used to investigate the effects of processing parameters，including solvent concentration，temperature，extraction time and ultrasound power.The extraction rate of GPM polyphenols was chosen as response value，mathematical model was established by implementing four factors and three levels at the basic of Box-Behnken design.The optimum technological conditions were 55%aqueous ethanol concentration，ultrasonic temperature of 70℃，extraction time of 53 min and ultrasonic power of 106 W.Under the optimum conditions，the yield rate of polyphenol was 0.522%，which general accorded with the predicted value（0.524%）according to the modal.

Key words：Gynura procumbens（Lour.）Merr；polyphenols；ultrasonic extraction；response surface analysis method

平臥菊三七（Gynura procumbens（Lour.）Merr）為菊科菊三七屬多年生草本植物，一般分布于東南亞及我國南部及西南部地區(qū)[1]。近代藥理研究表明平臥菊三七具有抑菌、降壓、降糖降脂、抗氧化、抗癌、消腫、散瘀、活血生肌等功效[2-4]。是一種極具潛力和高經(jīng)濟(jì)價值的藥食兩用植物[5]。“植物多酚”也叫植物單寧，是分子中具有多個羥基酚類的植物成分的總稱，它是植物的次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于植物體的根、皮、果肉和殼中，它在植物中的含量僅次于半纖維素，纖維素和木質(zhì)素[7]。植物多酚具有多種生物活性功能，例如：抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、防癌等[8-9]。故被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、化工、醫(yī)藥、材料等領(lǐng)域，成為當(dāng)今天然產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)[10]。植物多酚萃取常用的方法有很多，例如超聲波法、微波法、有機(jī)溶劑水提法等。超聲波法提取作為一種新興技術(shù)，具有高效率，低能耗，和節(jié)約溶劑等特點(diǎn)。已被用于多種植物有效成分的提取[11]。目前，國內(nèi)外對平臥菊三七多酚超聲提取工藝的研究較少，故本文以平臥菊三七為原料，采用超聲波輔助提取平臥菊三七中多酚，通過考察乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度、超聲功率等因素對平臥菊三七多酚提取率影響的研究，再結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，為進(jìn)一步開發(fā)平臥菊三七多酚產(chǎn)品研究與開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料

平臥菊三七：江西鑫植源農(nóng)業(yè)生態(tài)科技開發(fā)股份有限公司提供。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：成都曼思特生物科技有限公司；其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[12]。配置0.2 mg/mL的沒食子酸溶液，分別吸取 1、2、3、4、5、6、7 mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液于 10 mL容量瓶中并定容，吸取上述溶液0.2 mL于試管中，加入福林酚試劑0.5 mL，1 mol/L Na2CO3溶液1 mL，蒸餾水2.3 mL，在25℃反應(yīng)2 h，在765 nm波長處測量其吸光度。繪制縱坐標(biāo)為吸光度（A）與橫坐標(biāo)為濃度（C）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 平臥菊三七中多酚物質(zhì)含量的測定方法

將平臥菊三七干燥粉碎后，過40目篩，稱量0.25 g于離心管中，按1∶20（g/mL）的料液比加入50%的乙醇溶液，在50℃的超聲溫度和100 W的超聲功率下超聲提取30 min。將提取液離心（4 000 r/min，10 min）后，取其上清液置于10 mL容量瓶中并定容后，按照方法2.1，測定吸光值，根據(jù)所得回歸方程計算出多酚的提取率。

2.3 單因素試驗(yàn)

選擇提取次數(shù)、乙醇濃度、料液比、提取時間、超聲功率、提取溫度等6個因素作單因素試驗(yàn)，考察各種單因素對平臥菊三七中多酚提取率的影響。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，依據(jù)Box-Benhnken原理，以乙醇濃度、提取溫度、提取時間、超聲功率4個因素為自變量，總多酚提取提取率為響應(yīng)值，設(shè)計出了四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)方案[13]。其因素水平分析選取見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取6份平臥菊三七粉末，每份0.25 g，在最佳工藝條件下進(jìn)行提取，按照方法2.2測定吸光度并計算平臥菊三七多酚的平均提取率。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取平臥菊三七粉末0.25 g，在最佳工藝條件下進(jìn)行提取，按方法2.1測定吸光度，之后每10 min測定一次吸光度，考察2 h內(nèi)多酚的穩(wěn)定性。

2.6 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)中均采取3次平行試驗(yàn)的平均值進(jìn)行分析作圖，作圖采用OriginPro 8.5軟件進(jìn)行處理；響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 6.0.1軟件進(jìn)行分析處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程

沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程為y=0.078 81x＋0.012 67，R2=0.998 03。根據(jù)回歸方程計算出多酚的含量見圖1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

本研究采用之前試驗(yàn)研究結(jié)果，固定提取料液比為1∶20（g/mL）提取次數(shù)為2次。

3.2.1 乙醇濃度對平臥菊三七多酚提取率的影響

乙醇濃度對平臥菊三七多酚提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對平臥菊三七多酚提取率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the yield of GPM polyphenols

從圖2可以觀察到，當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)小于50%時，平臥菊三七中多酚物質(zhì)的提取率隨乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增加而上升，但是當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)超過50%后，多酚物質(zhì)的提取率隨乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增加反而下降，原因可能是在低濃度范圍內(nèi)隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增加，多酚與多糖和蛋白質(zhì)之間的氫鍵與疏水作用力越容易斷裂，使多酚在乙醇溶液中的溶解度增加[14]；但當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)超過50%時，溶液極性差異逐漸增大，從而導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的溶解度下降。因此，乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)以50%為宜。

對息肉進(jìn)行內(nèi)鏡下的微創(chuàng)治療，創(chuàng)傷小、恢復(fù)快、療效確切，但并不是一勞永逸的，息肉摘除后，需要進(jìn)行腸鏡隨訪。隨訪的時間要根據(jù)不同息肉類型而定，一般1到2年復(fù)查。

3.2.2 超聲時間對平臥菊三七多酚提取率的影響

提取時間對平臥菊三七多酚提取率的影響見圖3。

圖3 提取時間對平臥菊三七多酚提取率的影響Fig.3 The effect of extract time on the yield of GPM polyphenols

從圖3可看出，隨著超聲時間的增加平臥菊三七多酚提取率是逐漸上升的，且在30 min至50 min上升明顯，當(dāng)超聲時間為50 min左右時，其提取率達(dá)到峰值，當(dāng)超聲時間超過50 min時，多酚提取率開始下降。原因可能是超聲波提取可以加快介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動速度，同時產(chǎn)生空化作用，從而加速提取物質(zhì)的浸出。然而，提取時間過長，會使多酚物質(zhì)發(fā)生氧化分解，多酚提取率下降[15]。因此，超聲提取時間選擇50 min為宜。

3.2.3 超聲功率對平臥菊三七多酚得提取率的影響

超聲功率對平臥菊三七多酚得提取率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對平臥菊三七多酚提取率的影響Fig.4 The effect of power of ultrasound generator on the yield of GPM polyphenols

從圖4可看出，隨著超聲波功率的增大，平臥菊三七中多酚物質(zhì)的提取提取率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，但當(dāng)超聲波功率超過110 W時，超聲功率的增大卻使提取率有所下降。這說明超聲功率到達(dá)一定值時，會產(chǎn)生大量的熱會破壞提取液中的多酚，從而使平臥菊三七多酚提取率下降[16]。因此，超聲波提取功率為110 W為宜。

3.2.4 超聲溫度對平臥菊三七多酚提取率的影響

超聲提取溫度對平臥菊三七多酚提取率的影響見圖5。

圖5 超聲提取溫度對平臥菊三七多酚提取率的影響Fig.5 The effect of temperature on the yield of GPM polyphenols

由圖5可知，平臥菊三七多酚提取率是在30℃～60℃之間是隨溫度升高而升高的，原因可能是溫度的升高加快了多酚物質(zhì)的滲透，溶解，擴(kuò)散速度，從而使多酚易被提出，但當(dāng)溫度超過60℃后隨著溫度的升高，提取率反而呈現(xiàn)下降趨勢。溫度過高時會導(dǎo)致平臥菊三七多酚的氧化損耗，且水和乙醇蒸發(fā)，雜質(zhì)溶出率增大導(dǎo)致多酚提取率下降[17]。故超聲波提取平臥菊三七的溫度為60℃時最佳。

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

經(jīng)軟件分析確定對平臥菊三七中多酚提取率影響較為顯著的4個因素分別為乙醇濃度、提取時間、提取溫度、超聲功率，通過Design-Expert 6.0.1軟件得到響應(yīng)面試驗(yàn)方案及平臥菊三七多酚提取率的測定結(jié)果見表2，回歸方程方差分析見表3。

表2 設(shè)計方案及平臥菊三七多酚提取率的測定結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

續(xù)表2 設(shè)計方案及平臥菊三七多酚提取率的測定結(jié)果Continue table 2 Design and results of response surface methodology

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic response surface regression model

通過Design-Expert 6.0.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，經(jīng)二次回歸擬合，對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析后得到4個因素與平臥菊三七多酚提取率之間的回歸方程為：Y=0.48+0.011A+0.045B+0.028C-0.000 8D-0.046A2-0.020B2-0.057C2-0.058D2+0.03AB-0.015AC-0.028AD+0.005BC-0.015BD-0.035CD

由表3可知此回歸模型P＜0.000 1，在a=0.01水平下為極顯著，失擬項(xiàng)較小且決定系數(shù)r2=0.909 8，表明擬合方程與實(shí)際情況比較相符，誤差也較小，可充分反映各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，其影響不是簡單的線性關(guān)系[13，18]。通過觀察回歸方程可知，各因素之間是有一定交互影響的，從表3 可知B，C，A2，C2，D2呈極顯著影響（P＜0.01），AB，AD，CD呈顯著影響 （P＜0.05），B，D，B2，AC，BC，BD均不顯著。

觀察表3，得到單因素的影響順序：B（超聲溫度）＞C（超聲時間）＞A（乙醇濃度）＞D（超聲功率），在有交互作用存在下，對平臥菊三七多酚提取率的影響順序?yàn)椋篊D＞AB＞AD＞BD＞AC＞BC。

觀察響應(yīng)面圖形（圖6），若曲線走勢越陡，則表明其影響越顯著，若曲線走勢平滑，則表明其影響較小[18]。超聲溫度，超聲的時間圖形曲線走勢較陡，說明其影響顯著，由Design-Expert 6.0.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，得出平臥菊三七多酚的最佳提取條件為乙醇濃度54.97%，超聲溫度70℃，超聲時間53.35 min，超聲功率106.46 W，結(jié)合實(shí)際操作過程，確定最終工藝條件為：乙醇濃度55%，提取溫度70℃，提取時間53 min，提取功率106 W，在該條件下平行試驗(yàn)6次，平臥菊三七多酚提取率為0.522%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為RSD=2.864 4，測定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，證明該結(jié)果合理可靠。

圖6 各因素間交互作用的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for the effects of crose interactions among different factors

3.4 方法學(xué)考察

重復(fù)性試驗(yàn)：平臥菊三七多酚平均提取率為0.522%；穩(wěn)定性試驗(yàn)：在2 h內(nèi)平臥菊三七所測吸光度的變化RSD=0.707，說明2 h內(nèi)平臥菊三七中多酚物質(zhì)較穩(wěn)定。所測結(jié)果可靠。

4 結(jié)論

通過響應(yīng)面分析法對試驗(yàn)結(jié)果的分析得出平臥菊三七多酚的最佳提取工藝條件為，乙醇濃度為55%，超聲時間為53 min，超聲溫度為70℃，超聲功率為106 W。在此條件下做6次平行試驗(yàn)，平臥菊三七多酚平均提取率為0.522%，RSD為2.864 4，實(shí)際值為預(yù)測值的99%，說明所優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠且穩(wěn)定可行。

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Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction of Polyphenols from Gynura procumbens（Lour.）Merr by Response Surface Methodology

WEI Jing，YE Zhi-hong，LIN Le-zhen，ZHENG Guo-dong*
（College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Jiangxi Key Laboratory of Natural Product and Functional Food ，Nanchang 330045，Jiangxi，China）

2017-02-08

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.006

國家863項(xiàng)目子課題（2013BAD10B04）

魏晶（1994—），女（漢），碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物與功能食品研究。

*通信作者：鄭國棟（1969—），男，教授，從事天然產(chǎn)物與功能食品研究。