鴨瘟病毒強(qiáng)弱毒株P(guān)CR檢測(cè)方法的建立

謝麗基，黃 莉，謝芝勛*，王 盛，黃嬌玲，張艷芳，范 晴，羅思思，謝志勤，鄧顯文，鐘傳德

(1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001; 2.廣西玉林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西玉林 537000)

鴨瘟病毒強(qiáng)弱毒株P(guān)CR檢測(cè)方法的建立

謝麗基1，黃 莉1，謝芝勛1*，王 盛1，黃嬌玲1，張艷芳1，范 晴1，羅思思1，謝志勤1，鄧顯文1，鐘傳德2

(1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001; 2.廣西玉林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西玉林 537000)

根據(jù)基因庫(kù)中鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株UL2基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)的引物濃度和退火溫度等，初步建立了可同時(shí)鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的PCR檢測(cè)方法，并對(duì)建立的方法進(jìn)行了敏感性、特異性驗(yàn)證和臨床樣品檢測(cè)。該P(yáng)CR檢測(cè)方法最低能檢出1 pg的鴨瘟病毒強(qiáng)毒和弱毒DNA模板。對(duì)鴨瘟病毒強(qiáng)毒和弱毒模板的檢測(cè)，得到了與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的827 bp(強(qiáng)毒)和299 bp(弱毒)的擴(kuò)增條帶，而對(duì)鴨副黏病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨圓環(huán)病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨Ⅰ型肝炎病毒、禽流感病毒和小鵝瘟病毒等病原體的檢測(cè)均為陰性。說(shuō)明建立了一種敏感性高、特異性好的鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)毒和弱毒的PCR檢測(cè)方法。

鴨瘟病毒；強(qiáng)毒；弱毒； 聚合酶鏈反應(yīng)

目前，常用鴨瘟弱毒疫苗預(yù)防鴨瘟的發(fā)生，但根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)中本地區(qū)鴨瘟發(fā)生的情況及國(guó)內(nèi)其他學(xué)者的報(bào)道[4]，近年來(lái)發(fā)生的由鴨瘟強(qiáng)毒引起的鴨瘟，常用的鴨瘟疫苗不能預(yù)防該病的發(fā)生，鴨瘟強(qiáng)毒和弱毒/疫苗弱毒存在共感染現(xiàn)象。傳統(tǒng)的檢測(cè)鴨瘟病毒方法(病毒分離鑒定、血清中和試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、PCR、LAMP和熒光定量PCR等[5-10])或存在診斷時(shí)間長(zhǎng)、操作繁鎖、敏感性和特異性較差的特點(diǎn)，或不能區(qū)分感染的鴨瘟病毒是強(qiáng)毒株還是弱毒株/疫苗株。本研究基于鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株UL2基因的差異，設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，建立了能鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的PCR快速檢測(cè)方法，為鴨瘟的防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 病毒RNA/DNA快速純化試劑盒、2×PCR Mix和DNA片段膠回收試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pMD18-T試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 毒株 鴨瘟病毒強(qiáng)毒株(Yulin2016-30D株、Yulin2016-60D、DPVGuangxi01和DPVGuangxi02)均由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所生物技術(shù)室分離純化并保存；鴨副黏病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨圓環(huán)病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨Ⅰ型肝炎病毒、H9亞型禽流感病毒和小鵝瘟病毒等由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所生物技術(shù)室保存；鴨瘟弱毒AV18株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；4種鴨瘟病毒弱毒苗分別購(gòu)自廣西麗原生物制品股份有限公司、上海海利生物技術(shù)股份有限公司、遼寧益康生物股份有限公司和哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR方法的建立

1.2.1.1 核酸制備 根據(jù)病毒RNA/DNA快速純化試劑盒說(shuō)明書，提取鴨瘟病毒、鴨副黏病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨圓環(huán)病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨Ⅰ型肝炎病毒、H9亞型禽流感病毒和小鵝瘟病毒的RNA/DNA。測(cè)定核酸的濃度和純度[11]，置于-20℃保存。

實(shí)施依法治理，是自然資源事業(yè)改革發(fā)展的根本保障。我省堅(jiān)持把法治理念貫穿自然資源管理全過(guò)程，基本構(gòu)建起立法、普法、執(zhí)法相銜接，專業(yè)執(zhí)法、公眾參與、立體監(jiān)督相結(jié)合的自然資源執(zhí)法監(jiān)督體系。

1.2.1.2 引物設(shè)計(jì) 參照鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的UL2基因序列，利用MEGA4生物分析軟件找到保守區(qū)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物(表1)。引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

表1 試驗(yàn)所使用引物

1.2.1.3 PCR方法建立 反應(yīng)總體積為50 μL，包括2×PCR Mix 25 μL，上游引物和下游引物適量，模板1 μL，以ddH2O補(bǔ)足50 μL。對(duì)PCR各循環(huán)參數(shù)(退火溫度50℃～60℃，反應(yīng)時(shí)間40 s～60 s等)和各引物濃度(0.2 μmol/L～1 μmol/L)等進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的PCR模式。

1.2.2 PCR特異性試驗(yàn) 提取鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的核酸樣品， 以及其他對(duì)照病原體(鴨副黏病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨圓環(huán)病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨Ⅰ型肝炎病毒、H9亞型禽流感病毒和小鵝瘟病毒) 的核酸樣品，用建立的鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)毒和弱毒PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，確定建立的PCR檢測(cè)方法的特異性。

1.2.3 PCR敏感性試驗(yàn) 測(cè)定鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的DNA模板濃度后，將其混合作10倍遞進(jìn)稀釋。用建立的鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)毒和弱毒PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，確定該方法的敏感性。

1.2.4 克隆測(cè)序 將50 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠經(jīng)DNA片段膠回收試劑盒純化回收。純化的PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體，并轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌。挑取白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，用PCR方法進(jìn)行快速鑒定。將鑒定為陽(yáng)性的重組克隆菌送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast同源性比對(duì)分析。

1.2.5 臨床樣品檢測(cè) 利用建立的鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株P(guān)CR檢測(cè)方法，對(duì)發(fā)生鴨瘟強(qiáng)毒感染的鴨群病料(廣西玉林某鴨場(chǎng)，2份鴨肝臟，2份鴨脾臟)、注射鴨瘟疫苗的鴨群樣品(廣西桂林某鴨場(chǎng)，1份鴨肝臟，1份鴨脾臟)及正常鴨的1份肝臟和1份脾臟進(jìn)行檢測(cè)，并將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體后進(jìn)行測(cè)序分析，對(duì)該方法進(jìn)行實(shí)用性驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 PCR方法的建立

對(duì)退火溫度、反應(yīng)時(shí)間和引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果顯示，PCR反應(yīng)中DPlague 299/827-1和DPlague 299/827-2引物的最佳工作終濃度為0.5 μmol/L， PCR的最佳反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s， 35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2.2 PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

該方法對(duì)4株鴨瘟病毒強(qiáng)毒株(Yulin2016-30D、Yulin2016-60D、DPVGuangxi01和DPVGuangxi02 )均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的827 bp條帶，5種弱毒株(AV18株和4種鴨瘟病毒弱毒苗)均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的299 bp的條帶，而對(duì)照病原體在相同位置均無(wú)特異性擴(kuò)增條帶(圖1)。

2.3 PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

該P(yáng)CR方法，對(duì)稀釋至1 pg 的鴨瘟病毒DNA模板進(jìn)行檢測(cè)仍出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(圖2)，即該P(yáng)CR方法最低能同時(shí)檢測(cè)到1 pg的鴨瘟病毒強(qiáng)毒和鴨瘟病毒弱毒。

2.4 測(cè)序結(jié)果分析

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，大小分別為827 bp和299 bp，與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符。序列經(jīng)BLAST比對(duì)分析，與引物設(shè)計(jì)模板的對(duì)應(yīng)片段同源性為100%。

2.5 臨床樣品檢測(cè)

利用建立的PCR檢測(cè)方法，對(duì)4份發(fā)生鴨瘟強(qiáng)毒感染的鴨群病料或2份注射鴨瘟弱毒苗的鴨群樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均能擴(kuò)增出特異性PCR條帶(圖3)。PCR產(chǎn)物序列分析結(jié)果表明， 擴(kuò)增產(chǎn)物為鴨瘟病毒強(qiáng)毒和疫苗弱毒的特異性片段。

3 討論

目前，我國(guó)主要是靠接種弱毒疫苗來(lái)預(yù)防鴨瘟，所以免疫鴨瘟弱毒苗的養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)鴨瘟病毒診斷陽(yáng)性時(shí)，現(xiàn)有的檢測(cè)方法很難快速判斷，該鴨場(chǎng)呈現(xiàn)的陽(yáng)性是因感染鴨瘟病毒強(qiáng)毒還是因注射鴨瘟疫苗造成的。因此，迫切需要建立一種能鑒別檢測(cè)鴨瘟病毒強(qiáng)毒和弱毒的檢測(cè)方法，為鴨瘟病毒的防控提供技術(shù)支撐。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)1 000; 1～4.鴨瘟病毒強(qiáng)毒株(Yulin2016-30D、Yulin2016-60D、DPVGuangxi01和DPVGuangxi02); 5～9. 5種鴨瘟病毒弱毒；10.鴨副黏病毒; 11.鴨坦布蘇病毒; 12.鴨圓環(huán)病毒; 13.番鴨細(xì)小病毒; 14.鴨Ⅰ型肝炎病毒; 15.H9亞型禽流感病毒; 16.小鵝瘟病毒; 17.dH2O; 18.鴨瘟病毒強(qiáng)毒+鴨瘟病毒弱毒

M.DNA Marker 1 000; 1-4.Duck plague virus virulent strain (Yulin2016-30D,Yulin2016-60D,DPVGuangxi01 and DPVGuangxi02); 5-9.Five duck plague virus attenuated strains; 10.Duck paramyxovirus; 11.Duck Tembusu virus; 12.Duck circoviru,13.Muscovy duck parvovirus; 14.Duck hepatitis virus type I; 15.Avian influenza virus; 16.Gosling plague virus; 17.dH2O; 18.Duck plague virus virulent strain+ Duck plague virus attenuated strain

圖1 PCR特異性試驗(yàn)

Fig.1 Specificity test of PCR

M.DNA Marker 1 000; 1.1ng; 2.100 pg; 3.10 pg; 4.1 pg; 5.100 fg; 6.10 fg; 7.1 fg

圖2 PCR敏感性試驗(yàn)

Fig.2 Sensitivity test of PCR

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)1 000; 1、2.感染鴨瘟病毒強(qiáng)毒鴨的肝臟和脾臟；3、4.感染鴨瘟病毒強(qiáng)毒鴨的肝臟和脾臟；5、6.接種鴨瘟弱毒苗鴨的肝臟和脾臟；7、8.正常鴨的肝臟和脾臟

M.DNA Marker 1 000; 1，2.Liver and spleen samples of duck infected DPV virulent strain; 3，4.Liver and spleen samples of duck infected DPV virulent strain; 5,6.Liver and spleen samples of duck injected DPV attenuated vaccine strain;7，8.Normal liver and spleen

圖3臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

Fig.3 PCR detection results of clinical samples

本研究下載了GenBank中所有鴨瘟病毒序列，通過(guò)基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，鴨瘟病毒弱毒(包括弱毒VAC:GenBank Accession Number EU082088，四川弱毒株1:GenBank Accession Number JQ347517，四川弱毒株2:GenBank Accession Number JQ347518，弱毒 K:GenBank Accession Number KF487736，疫苗弱毒C-KCE :GenBank Accession Number KF263690， 疫苗弱毒clone-03 :GenBank Accession Number EF449516等)與鴨瘟病毒強(qiáng)毒株(包括廣西株30D:GenBank Accession Number KX925439 ，廣西株60D：GenBank Accession Number KX925440 ，德國(guó)株2085：GenBank Accession Number JF99965， 四川株Chv：GenBank Accession Number EU885419，CV株：GenBank Accession Number JQ673560，江蘇株LH2011：GenBank Accession Number KC480262，四川株LS：GenBank Accession Number JQ248598，四川株N1：GenBank Accession Number JQ043216，四川株N2：GenBank Accession Number JQ248596，四川株N3：GenBank Accession Number JQ248597等 )比較，UL2基因均缺失了528 bp的片段(缺失的片段位于強(qiáng)毒株的198-725位核苷酸)，這個(gè)發(fā)現(xiàn)與之前Wang J等[12]和Yang C等[13]的報(bào)道(比較的是少量的強(qiáng)毒株和弱毒株)一致。

基于這個(gè)差異，本研究初步建立了能鑒別檢測(cè)鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的PCR檢測(cè)方法。該方法全程(包括核酸提取、PCR擴(kuò)增，凝膠電泳)僅需約4 h，最低能同時(shí)檢出1 pg的鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株DNA模板。該方法對(duì)鴨瘟病毒強(qiáng)毒和弱毒的檢測(cè)，均得到了與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的827 bp(強(qiáng)毒)和299 bp(弱毒)的擴(kuò)增條帶，而對(duì)對(duì)照病原體的檢測(cè)全為陰性。研究建立的鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)毒和弱毒PCR檢測(cè)方法，具有快速、敏感和特異的優(yōu)點(diǎn)，從試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，該方法可以同時(shí)進(jìn)行鴨瘟病毒強(qiáng)、弱毒株的檢測(cè)，可用于臨床鴨瘟感染的檢測(cè)，這對(duì)于在鴨瘟發(fā)病早期提供準(zhǔn)確的診斷，切斷其傳播途徑有重要意義。

本研究初步建立了鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)、弱毒株P(guān)CR檢測(cè)方法，雖然比較了GenBank中所有的鴨瘟病毒的UL2基因序列，并應(yīng)用該方法實(shí)際檢測(cè)了4株強(qiáng)毒株(Yulin2016-30D、Yulin2016-60D、DPVGuangxi01和DPVGuangxi02 )和5種弱毒株(AV18株和4種鴨瘟病毒弱毒苗)，但臨床上的毒株可能千變?nèi)f化，因此，在今后的工作中有必要繼續(xù)關(guān)注更多的鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的UL2基因，并對(duì)更多的強(qiáng)毒株和弱毒株進(jìn)行檢測(cè)，以進(jìn)一步證實(shí)和確保本方法的實(shí)用性。

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Abstract:According to the conserved sequence of duck plague virus (DPV) UL2 gene,the specific primers were designed,the primer concentration and annealing temperature were optimized.A polymerase chain reaction assay was developed to simultaneously detect DPV virulent strains and attenuated strains.The experiments about sensitivity and specificity were conducted.As little as 1pg of DPV virulent strain and attenuated strain DNA could be detected.Samples containing DPV virulent strain and attenuated strain could be amplified into the specific bands,827 bp for DPV virulent strain and 299 bp for DPV attenuated strain.No specific bands of the same sizes were amplified from duck paramyxovirus,duck Tembusu virus,duck circovirus,Muscovy duck parvovirus,duck hepatitis virus type I,avian influenza virus and gosling plague virus.The PCR assay with high sensitivity and good specificity for DPV detection was successfully established.

Keywords:Duck plague virus; virulent strain; attenuated strain; polymerase chain reaction

DevelopmentofaPolymeraseChainReactionAssayforDifferentiationofDuckPlagueVirusVirulentStrainsfromAttenuatedStrains

XIE Li-ji1,HUANG Li1,XIE Zhi-xun1,WANG Sheng1,HUANG Jiao-ling1,ZHANG Yan-fang1, FANG Qing1,LUO Si-si1,XIE Zhi-qin1,DENG Xian-wen1，ZHONG Chuan-de2

(1.GuangxiVeterinaryResearchInstitute,GuangxiKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,Nanning，Guangxi，530001，China; 2.YulinCityAnimalDiaeasePreventionandControlCenter,Yulin，Guangxi，537000,China)

S852.659.1;S858.32

A

1007-5038(2017)08-0019-04

2016-11-11

廣西科技項(xiàng)目(桂科攻10100014-5);國(guó)家”萬(wàn)人計(jì)劃”領(lǐng)軍人才專項(xiàng) (2016-37);廣西特聘專家專項(xiàng)(2011B020)

謝麗基(1981-)，女，廣西靈山人，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)研究。*